Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 3. ДНК

двійної спіралі. Замість 16 типів динуклеотидних контактів у однола-

нцюговій нуклеїновій кислоті, у подвійній спіралі залишається 10 –

унаслідок комплементарності ланцюгів певні контакти є еквівалент-

ними. Наприклад, контакт AG в одному ланцюзі автоматично озна-

чає, що в комплементарному ланцюзі реалізується контакт CT. Слід

пам'ятати, що ланцюги є антипаралельними, і що послідовність нук-

леотидів читається в напрямку 5' → 3' (усі динуклеотидні контакти

подвійної спіралі наведено в табл. 3.2). Для певних контактів (напри-

клад, пурин-піримідинових порівняно з піримідин-пуриновими)

стекінг-взаємодії є більш ефективними. Відповідно,

стабільність

подвійної спіралі залежить від послідовності пар основ.

Утворення подвійної спіралі працює проти конформаційної ентро-

пії: розходження двох ланцюгів супроводжується значним зростан-

ням їхньої конформаційної свободи (невпорядкованості). Відповідно,

стабільність подвійної спіралі залежить від температури: при зрос-

танні температури ентропійна компонента вільної енергії збільшуєть-

ся (рівняння (1.2)), і відбувається розходження ланцюгів – плавлення

подвійної спіралі. Зрозуміло, що температура плавлення – температу-

ра за якої 50 % пар основ є розплавленими – є мірою стабільності

й залежить від послідовності пар основ.

Суттєвий дестабілізуючий внесок у вільну енергію подвійної спіралі

дають також електростатичні взаємодії. Оскільки кожен фосфатний

залишок несе на собі негативний заряд (рис. 3.4), молекула ДНК є гі-

гантським поліаніоном із високою поверхневою щільністю зарядів.

У розчині ці заряди суттєво нейтралізовані протиіонами – неорганіч-

ними катіонами: навколо ДНК утворюється “іонна атмосфера” з до-

сить високою локальною щільністю катіонів, тобто в системі виникає

нерівномірний розподіл катіонів – зростає відповідна ентропійна ком-

понента вільної енергії. Цей невигідний ефект буде тим меншим, чим

вищою є концентрація солі в розчині, тобто різниця між концентраці-

єю катіонів поблизу від ДНК і на віддаленні від неї. Відповідно, стабі-

льність подвійної спіралі (і температура плавлення) залежить від іонної

сили розчину – зростає при підвищенні концентрації солі.

За фізіологічних умов подвійна спіраль є досить стабільною струк-

турою, і саме в цій формі ДНК (і значна частина комплементарних

ділянок РНК) існує в живих системах. Розходження ланцюгів, яке має

тимчасово відбуватися при різноманітних функціональних процесах,

потребує виконання роботи молекулярними машинами з використан-

ням енергії гідролізу АТР.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Конформаційні параметри подвійної спіралі

Як для будь-якого іншого полімеру, конформаційна рухливість нук-

леїнових кислот реалізується завдяки зміни кутів обертання навкруг

ковалентних зв'язків. У складі подвійної спіралі ці обертальні рухи

обмежені міцними стекінг-взаємодіями та комплементарними водне-

вими зв'язками. Дозволені обертання навкруг різних зв'язків призво-

дять врешті-решт до зміни взаємної орієнтацій основ і пар основ.

Саме набором параметрів, що описують такі відносні орієнтації, при-

йнято характеризувати конформації подвійних спіралей.

В основі номенклатури конформаційних параметрів подвійних

спіралей нуклеїнових кислот, прийнятої спеціальною нарадою EMBO

(European Molecular Biology Organization), лежить стандартна лока-

льна декартова система координат, що ставиться у відповідність до

кожної пари основ (рис. 3.8): початок координат знаходиться в гео-

метричному центрі пари; площина X–Y збігається з площиною пари,

вісь Y є паралельною щодо лінії, яка з'єднує С1'-атоми, і спрямована

на ланцюг, який береться за перший; вісь Z спрямована на площину

наступної (у напрямку 5'-3' по першому ланцюгу) пари основ; на-

прямок осі X обирається за правилами утворення правої декартової

системи координат – жолобок, на який вона спрямована, познача-

ється як “великий”. Насправді, терміни “великий / маленький жоло-

бок” не обов'язково мають буквальне значення (див. нижче).

і + 1

Маленький жолобок

Ланцюг І

Ланцюг ІІ

Рис. 3.8. Дві пари основ у молекулі ДНК і локальна

декартова система координат, пов'язана з однією з них.

Розділ 3. ДНК

Для опису відносного положення двох сусідніх пар достатньо шість

параметрів: три зсуви наступної пари відносно попередньої по трьох

осях (будь-який зсув можна розкласти на три компоненти) і три кути

обертання другої пари відносно першої навколо трьох осей (рис. 3.9):

• Шифт (shift) характеризує зсув у напрямку одного із жолобків.

• Слайд (slide) – зсув у напрямку цукрофосфатного остова.

• Райз (rise) – відстань між парами основ уздовж осі Z.

• кут рола (roll) характеризує локальний вигин подвійної спіралі

в напрямку одного із жолобків.

• Кут тилта (tilt) – вигин у напрямку цукрофосфатного остова.

• Твіст (twist) є кутом обертання навкруг осі Z, який характери-

зує ступінь спірального закручення (для правої спіралі прийнято

використовувати позитивні значення твіста).

XXX

Шифт (shift) Слайд (slide) Райз (rise)

Ролл (roll) Тилт (tilt) Твіст (twist)

Рис. 3.9. Шість параметрів,

які описують конформацію двох сусідніх пар основ

Аналогічно, шість параметрів характеризують відносне положення

основ, що належать до однієї пари: зсув уздовж осі X і обертання на-

вколо неї (shear і buckle), зсув і обертання відносно осі Y (stretch

і propeller) та відносно осі Z (stagger і opening). Яким чином відбуваються

відповідні рухи однієї основи відносно іншої легко зрозуміти з рис. 3.9.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Структурні форми ДНК

ДНК із майже будь-якою послідовністю пар основ може існувати

у двох структурних формах, що позначаються як А і В. Деякі усеред-

нені параметри двох форм у фібрилах ДНК наведено в табл. 3.1,

структури показано на рис. 3.10.

В-форма А-форма

Рис. 3.10. В- (структура з рис. 3.6)

та А- (декамер, 401D) форми ДНК у двох проекціях

Обидві спіралі є правими. Основні відмінності між двома формами

ДНК зумовлені різною конформацією цукру – С2'- та С3'-ендо. Саме

внаслідок цього в А-формі порівняно з В-формою:

• Скорочується відстань між фосфатними залишками.

• Зменшується ступінь правої спіральної закрутки.

• Кожна пара основ суттєво нахиляється до осі спіралі (у В-формі

пари майже перпендикулярні до осі).

• Унаслідок нахилу в А-формі скорочується відстань між су-

сідніми парами основ уздовж осі спіралі (проекція райза на

вісь спіралі).

Розділ 3. ДНК

• Кожна пара суттєво зсунута до периферії спіралі в А-формі,

вісь спіралі проходить майже через центр пари в В-формі.

• “Великий” і “маленький” жолобки є справді великим і мале-

ньким для В-форми, в А-формі їхні відносні розміри міня-

ються місцями.

Таблиця 3.1. Порівняння між А- і В-формами

подвійних спіралей ДНК

А-форма В-форма

Твіст Ω (°) +32,7 +36,0

Кількість пар основ на

виток спіралі (360°/Ω)

11 10

Слайд (Å) –1,5 0

Ролл (°) 11,4 –0,2

Райз (Å) 3,3 3,3

Відстань між парами

вздовж осі спіралі (Å)

2,6 3,4

Конформація дезокси-

рибози

С3'-ендо С2'-ендо

Відстань між сусідні-

ми фосфатами по ла-

нцюгу (Å)

5,9 7,0

Великий жолобок: гли-

бина (Å),

ширина (Å)

13,5

2,7

8,5

11,7

Маленький жолобок:

глибина (Å),

ширина (Å)

2,8

11,0

7,5

5,7

Крім того, є різниця і в конформаційній рухливості: А-форма одно-

рідніша за своєю структурою, В-форма допускає ширші варіації па-

раметрів залежно від послідовності. Узагалі, частіше кажуть не про

форми ДНК, а про А- і В-родини структурних форм.

За фізіологічних умов у розчині ДНК існує тільки у В-формі, пе-

рехід в А-форму здійснюється за досить екстремальних умов in vitro – за

певних концентрацій солі та спиртів у розчині, при зниженні волого-

сті у фібрилах. Але це не означає, що А-форма не є фізіологічною.

По-перше, через те, що рибоза не може набувати С2'-ендо конформації,

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

усі подвійні спіралі РНК існують в А-формі за фізіологічних умов.

З тієї ж причини набувають А-форми гібридні подвійні спіралі РНК-

ДНК, які виникають тимчасово, наприклад, під час транскрипції.

Крім того, ДНК може переходити в А-форму або наближену до неї

в комплексах із білками.

Ще одна регулярна форма подвійної спіралі реалізується тільки для

альтернуючих послідовностей poly(GC) (коли G і C чергуються по лан-

цюгу). Це так звана

Z-форма (рис. 3.11). Її назва пов'язана з тим, що

лінія, яка з'єднує фосфатні залишки у складі Z-форми нагадує зиґзаґ.

Найбільш вражаюча особливість цієї форми ДНК полягає в тому, що

це –

ліва спіраль із приблизно 12 парами основ на виток. Альтернуючі

послідовності G та C є в природних ДНК, але перехід у Z-форму від-

бувається in vitro за умов, які є дуже далекими від фізіологічних – при

концентрації NaCl 2,5 моль/л. Біологічне значення Z-форми залишаєть-

ся не зовсім зрозумілим, хоча знайдені білки, які мають високу спорід-

неність саме до неї, тобто можуть індукувати В→Z перехід in vivo.

В-

орма Z-

орма

Рис. 3.11. В- (гексамерний фрагмент структури з рис. 3.6)

і Z- (гексамер CGCGCG, 1DCG) форми ДНК.

Чорним кольором на структурі праворуч позначені атоми фосфору

Конформація В-ДНК

Структура В-форми ДНК не є абсолютно регулярною. Конформа-

ційні особливості та особливості стекінгу в різних контактах між па-

рами основ призводять до суттєвої залежності локальної конформації

подвійної спіралі від послідовності – можна сказати, що послідовність

несе інформацію про структурні особливості ДНК (подібно до того, як

амінокислотна послідовність зумовлює просторову структуру білка).

Розділ 3. ДНК

Щоб проілюструвати залежність конформації ДНК від послідовнос-

ті, у табл. 3.2 наведені значення кута твіста (див. рис. 3.9) для

10 типів контактів між парами основ у кристалах вільної ДНК і білко-

во-нуклеїнових комплексів.

Таблиця 3.2.Твіст ДНК для 10 типів контактів

між парами основ (за даними Олсон та ін.)

Середній кут твіста ± стандартне

відхилення (°)

Тип

контакту

Кристали ві-

льної ДНК

Білково-

нуклеїнові ком-

плекси

AA/TT 35,5 ± 3,6 35,1 ± 3,9

AG/CT 30,6 ± 4,7 31,9 ± 4,5

GA/TC 39,6 ± 3,0 36,3 ± 4,4

GG/CC 35,3 ± 4,9 32,9 ± 5,2

AC/GT 33,1 ± 4,6 31,5 ± 4,2

AT 31,6 ± 3,4 29,3 ± 4,5

GC 38,4 ± 3,0 33,6 ± 4,7

CA/TG 37,7 ± 9,3 37,3 ± 6,5

CG 31,3 ± 4,7 36,1 ± 5,5

TA 43,2 ± 5,5 37,8 ± 5,5

Середнє

по всіх

контактах

35,6 34,2

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Твіст у комплексах є дуже близьким до значення твіста вільної ДНК

у розчині за фізіологічних умов – середнє значення для всіх контактів

відповідає 10,1 парам основ на виток спіралі у кристалах

і 10,5 парам основ у комплексах з білком. Як видно з таблиці, твіст

варіює в досить широких межах – ступінь локальної спіральної закру-

тки ДНК суттєво змінюється залежно від послідовності пар основ.

Крім того, варіюють також і стандартні відхилення від середнього

значення твіста. Останній параметр показує, наскільки легко значен-

ня твіста може відхилятися від переважного середнього значення,

тобто характеризує конформаційну рухливість контакту даного типу.

Інші конформаційні параметри подвійної спіралі (як середні значен-

ня, так і ширина розподілу) також залежать від послідовності пар основ.

Для прикладу на рис. 3.12 показано співвідношення між роллом і слайдом

(доступний сегмент конформаційного простору) для 10 контактів. Зага-

лом конформаційна рухливість негативно корелює з ефективністю сте-

кінгу: вона є вищою для піримідин-пуринових і АТ-збагачених контактів.

При цьому 6 конформаційних параметрів, наведених на рис. 3.9, не

є незалежними один від одного – їхні зміни є заємно пов'язаними.

–20

–10

–2 0 2 –2 0 2

ролл (°)

слайд (Å)

Рис. 3.12. Усередині зафарбованих зон – доступні для кожного з 10 контактів

значення двох конформаційних параметрів для кристалів ДНК (за даними Олсон та ін.)

Характер залежності конформації ДНК від послідовності є наспра-

вді ще складнішим: конформаційні особливості визначаються не тіль-

ки найближчими сусідами – типом контакту між парами основ, але

й контекстом послідовності, де даний контакт знаходиться.

Розділ 3. ДНК

Отже, хоча конструкція молекули ДНК є простішою за білкову, на

сьогодні неможливо точно передбачити деталі структури ДНК, вихо-

дячи з її послідовності. Залежні від послідовності особливості струк-

тури подвійної спіралі та потенціал щодо конформаційних змін – ос-

нова механізму специфічного впізнання послідовностей ДНК білками.

Білково-нуклеїнові взаємодії

Структурна класифікація білків, які взаємодіють із ДНК

Так само, як більшість глобулярних білків можна вписати в обме-

жений набір стандартних укладок глобули (розділ 2), структурні еле-

менти білків, які безпосередньо взаємодіють з ДНК, можна розділити

на досить обмежену кількість стандартних типів – ДНК-зв'язувальних

структурних мотивів.

Мотив НТН (helix-turn-helix, спіраль–поворот–спіраль), приклад

якого зображено на рис. 3.13, є найбільш розповсюдженим. Мотив

складається із двох

α-спіралей, часто майже перпендикулярних одна

до одної, з'єднаних короткою перемичкою. Одна із цих спіралей (яка

впізнає) виконує роль “головки, що читає”, взаємодіючи з екзоцикліч-

ними групами азотистих основ у великому жолобку подвійної спіралі.

Орієнтація цієї спіралі відносно ДНК може варіювати для різних біл-

ків від приблизно перпендикулярної відносно осі подвійної спіралі до

паралельної цукрофосфатному остову. Друга

α-спіраль часто утворює

допоміжні контакти з цукрофосфатним остовом. Взаємодія

α-спіралі

з великим жолобком часто зустрічається і для інших ДНК-зв'язу-

вальних мотивів. Причина полягає в майже точній просторовій відпо-

відності між цими двома елементами – можна сказати, що

α-спіраль

є просторово комплементарною великому жолобку.

Двоспіральний НТН-мотив утримується в структурі того чи іншого

структурного домену – у випадку репресора фага

λ, у структурі α-спі-

рального пучка (рис. 3.14, а). Часто білки, що містять НТН-мотив,

взаємодіють з ДНК у вигляді гомодимеру (дві однакові субодиниці) –

це особливо характерно для прокаріотичних білків. Тоді дві однакові

“читаючі головки” впізнають дві однакові послідовності, що симетри-

чно розташовані в сайті взаємодії.

Інший приклад такого ж типу – катаболітний активаторний білок

(CAP – Catabolite A

ctivator Protein) Escherichia coli (рис. 3.14, б). При вза-

ємодії гомодимеру САР зі специфічним сайтом відбувається досить знач-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

ний вигин ДНК у бік білка (подвійна спіраль “огортає” білок). Спорідне-

ність білка до цього сайта залежить від ліганду – сАМР (циклічного АМР –

5'-фосфат у складі нуклеотиду утворює внутрішній ковалентний зв'язок

з 3'-ОН групою рибози). Зв'язування сАМР індукує структурні зміни

в молекулі білка (див. розділ 2), у результаті змінюється робоча поверхня

і білок набуває здатності впізнавати специфічну послідовність.

Рис. 3.13. НТН-мотив репресора бактеріофага λ

у комплексі з ДНК (1LMB)

а б

Рис. 3.14. Комплекси з ДНК гомодимерів репресора бактеріофага λ (а, 1LMB)

і білка САР E. coli (б, 1CGP – зеленим кольором позначено молекули сАМР)