Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 3. ДНК

Розповсюджений клас білкових мотивів, що взаємодіють із ДНК, –

Zn-координуючі мотиви. Це дуже невеличкі структурні елементи, які

складаються з обмеженої, недостатньої для формування жорсткої

глобули, кількості сегментів вторинної структури. Іон цинку надає

жорсткості такому мотиву, утворюючи координаційні зв'язки

з чотирма амінокислотними залишками, частіше Cys або His. Коор-

динаційний зв'язок формується неподіленою парою електронів ато-

мів O, N або S, яка узагальнюється з атомом металу шляхом частко-

вого “перетікання” на його низьку незаповнену орбіталь. Чотири такі

зв'язки створюють жорсткий каркас, який утримує білкову поверх-

ню, що має взаємодіяти з ДНК.

Один зі структурних мотивів такого типу, що часто зустрічається, –

цинковий палець (Zn finger, рис. 3.15, а). Він має дуже просту будову:

одна

α-спіраль і маленький β-шар із двох β-ділянок; одна з них і α-спі-

раль містять залишки, що утворюють координаційні зв'язки з Zn.

Як правило, кілька таких пальців (три на рис. 3.15, а), з'єднаних пе-

ремичкою, спірально обгортають великий жолобок.

Інший приклад – ДНК зв'язувальний домен гормонового рецептора

(рис. 3.15, б). Гормонові рецептори – це еукаріотичні фактори транс-

крипції, здебільшого гомодимери, які набувають споріденості з пев-

ними елементами послідовності ДНК після зв'язування з білком сте-

роїдного гормону (розділ 6). ДНК-зв'язувальний домен має дві пари

структурних елементів, а саме

α-спіраль – суміжна нерегулярна петля,

кожна пара координує іон Zn. Одна пара елементів бере участь у ди-

меризації, інша – у взаємодії з ДНК. Зустрічаються також інші

Zn-координуючі мотиви, але всі вони , як і розглянуті, реалізують вза-

ємодію

α-спіралі з великим жолобком.

Ще один мотив, який взаємодіє з великим жолобком ДНК за раху-

нок

α-спіралей – лейциновий зіпер (Leu zipper, рис. 3.16). Він являє

собою дві довгі

α-спіралі, кожну з яких можна розділити на дві час-

тини. Одна частина обох спіралей здійснює димеризацію – за раху-

нок гідрофобних взаємодій між неполярними амінокислотними за-

лишками (часто Leu, звідки назва мотиву) утворюється трохи закру-

чена подвійна спіраль (coiled coil). Друга частина кожної

α-спіралі

взаємодіє з

великим жолобком ДНК.

Варіацією лейцинового зіпера є мотив

спіраль – петля – спіраль

(helix – loop – helix) – різниця лише в тому, що кожна довга α-спіраль

розділена на дві коротші, з'єднані петлею: одна пара спіралей взає-

модіє між собою, інша – з ДНК.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

а б

Рис. 3.15. Три цинкових пальця у складі ДНК-зв'язувального білка (а, 1ZAA)

і ДНК-зв

'язувальний домен (димер) глюкокортикоїдного рецептора (б, 1GLU).

Зелені сфери – іони Zn

Рис. 3.16. Лейциновий зіпер (1NWQ)

Розділ 3. ДНК

Усе це не означає, що тільки α-спіраль використовується для взає-

модії білків з великим жолобком ДНК. У великий жолобок добре вкла-

дається також β-шар із двох β-ділянок – саме такий шар є взаємоді-

ючим елементом для білків типу метіонінового репресора. Численний

клас білків становить родину імуноглобуліноподібних траскрипцій-

них факторів (глобула має укладку імуноглобулінового типу, див.

рис. 2.12, б), які реалізують взаємодії перемичок між ділянками

β-структури з великим жолобком. Отже, хоча

α-спіраль використову-

ється частіше, реалізуються і всі інші можливості.

Усе описане не означає також, що білки взаємодіють з ДНК тільки

через великий жолобок (хоча через великий – частіше). На рис. 3.17

зображено приклади взаємодії перемичок між

α-спіралями (а) чи ви-

тягнутого поліпептидного ланцюга (б) з маленьким жолобком. У пер-

шому випадку – димер гістонів у складі нуклеосоми (див. розділ 4) –

маємо ще один структурний мотив, який зустрічається і в інших

ДНК-зв'язувальних білках, а саме гістонову укладку: одна довга

α-спіраль фланкована двома короткими. Димер двох таких укладок

взаємодіє з ~2,5 витками подвійної спіралі. У випадку гістонів ця

взаємодія не є специфічною: утворюються електростатичні контакти

позитивно заряджених амінокислотних залишків з фосфатами ДНК,

але з боку маленького жолобка.

а б

Рис. 3.17. Димер гістонів Н3-Н4 (а, 1AOI)

і АТ-гак у складі білка HMGA (б, 2EZD)

Другий приклад (рис 3.17, б) стосується білків HMGA – білків

групи високої рухливості (High Mobility Group) типу А (HMG – істо-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

рична назва для білків різних структурних класів , мається на увазі

рухливість при електрофорезі). Білки HMGA взагалі не мають глобу-

лярної структури – є невпорядкованими. Вони містять 3 пентапеп-

тидні елементи (Pro-Arg-Gly-Arg-Pro), що називаються АТ-гаками

(АТ-hook). Такий гак добре укладається у звужений маленький жо-

лобок невеликої ділянки подвійної спіралі, збагаченої АТ-парами

(тобто АТ-гак має специфічність до невеликих АТ-збагачених сай-

тів, завдяки чому він і отримав свою назву).

Наступні приклади стосуються дуже важливих випадків взаємодії

елементів регулярної вторинної структури білків з маленьким жолоб-

ком. Оскільки

α-спіраль і дволанцюговий β-шар добре укладаються

у великий жолобок, це автоматично означає, що в маленькому жолоб-

ку їм не вистачає місця. Відповідно, така взаємодія буде можливою

тільки за умови суттєвої деформації подвійної спіралі ДНК (розши-

рення жолобка) – ефект, що має важливі функціональні наслідки.

На рис. 3.18 зображено досить розповсюджений мотив – HMG-бокс,

який, зокрема, входить до складу білків HMGВ (ще один клас білків

HMG). Мотив складається з трьох α-спіралей, дві з них (позначені че-

рвоним) вбудовуються (інтеркалюють) у маленький жолобок. Це супро-

воджується розкрученням подвійної спіралі й вигином на ~80° у про-

тилежний щодо білка бік. Серед HMG-боксів є як специфічні до пев-

них послідовностей пар основ, так і неспецифічні.

Рис. 3.18. HMG-бокс у складі білка HMGВ (1J5N)

Розділ 3. ДНК

У складі білка ТВР (TATA-box Binding Protein) – важливого елемента

ініціації транскрипції в еукаріотів – досить широкий β-шар взаємодіє

з маленьким жолобком подвійної спіралі в зоні ТАТА-боксу – регу-

ляторного елемента послідовності ДНК (розділ 6). Наслідком цієї

взаємодії також є значна деформація подвійної спіралі з її розкру-

ченням і значним вигином у протилежний від білка бік (рис. 3.19).

Вигин, як і у випадку HMG-боксу, підсилюється інтеркаляцією двох

гідрофобних амінокислотних залишків між парами основ. У місці

інтеркаляції порушуються стекінг-взаємодії та утворюється кінк

(kink) – різкий злам подвійної спіралі.

Рис. 3.19. ДНК-зв'язувальний домен ТВР

у комплексі з ТАТА-боксом (1QNE)

На відміну від розглянутих факторів транскрипції та структурних

білків, ферменти, які працюють на ДНК, досить важко описати

в термінах простих структурних мотивів. Ферменти використовують

складні комбінації різноманітних елементів білкової структури для

впізнання ДНК і зв'язування з нею. Два приклади – мономерна

ДНКаза І (неспецифічна ендонуклеаза, яка здійснює одноланцюго -

вий розріз в ділянці маленького жолобка) і гомодимерна рестриктаза

EcoRV – зображені на рис. 3.20.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

аб

Рис. 3.20. Комплекси з ДНК ДНКази І (а, 1DNK)

і рестриктази EcoRV (б, 1AZ0)

Принципи білково-нуклеїнового впізнання

Усі випадки взаємодії численних білків із ДНК можна поділити на дві

категорії: неспецифічне зв'язування білка з ДНК будь-якої послідовності

(характерна константа зв'язування K ~ 10

–10

л/моль, визначення кон-

станти зв'язування див. у розділі 1) і специфічне впізнання білком певної

послідовності пар основ (із константою ~10

–10

л/моль). Білки, що

здійснюють таке впізнання, як правило, взаємодіють і з будь-якою

іншою ДНК неспецифічно. Розглянемо на простому прикладі, що

практично означають наведені цифри.

Нехай у бактеріальній клітині радіусом 1 мкм міститься 10 моле-

кул певного білка та 4 млн 600 тис. пар основ ДНК, де присутня

одна специфічна ділянка (оператор). Виходячи з об'єму клітини,

можна легко розрахувати загальні молярні концентрації білка та

оператора (скориставшись числом Авогадро). Концентрація ком-

плексу з оператором визначається рівнянням (1.6), де вільні концен-

трації білка та оператора дорівнюють їхнім загальним концентра-

ціям мінус концентрація комплексу. Звідки, якщо відома K, можна

розрахувати концентрацію комплексу.

Якщо білок зв 'язується неспецифічно (K = 10

л/моль), відношен-

ня концентрації комплексу до загальної концентрації оператора

дорівнює 4·10

–4

– оператор практично є вільним від білка. Та якщо

замість концентрації оператора використати загальну концентра-

цію потенційних сайтів зв'язування на ДНК (білок зв 'язується будь-

де), яка є в 4 млн 600 тис. разів вищою (кожна пара основ потен-

ційно може бути початком сайта зв'язування), то відношення кон-

Розділ 3. ДНК

центрації комплексу до загальної концентрації білка дорівнюватиме

0,995 – практично білок увесь час зв'язаний із ДНК.

При специфічному зв'язуванні (K = 10

л/моль), відношення кон-

центрації комплексу до загальної концентрації оператора дорівнює

0,97 – десяти молекул білка виявляється достатнім, щоб більшу час-

тину часу оператор був зв'язаним. При цьому з оператором у нашому

прикладі в даний момент часу може бути зв'язана лише одна молеку-

ла білка, решта перебуває не у вільному стані, а на ДНК, взаємодіючи

з нею неспецифічно.

Чим визначається висока специфічність зв'язування? Головне пра-

вило білково-нуклеїнового впізнання – відсутність жорстких правил.

Розглянуті різні структурні мотиви білків є різними еволюційними рі-

шеннями для специфічної взаємодії з тією чи іншою послідовністю:

існує багато шляхів для того, щоб сформувати білкову поверхню для

впізнання послідовності пар основ. Не існує і будь-якого коду впіз-

нання – чіткої відповідності між амінокислотними залишками та па-

рами основ. Але є певні загальні закономірності, частина яких уже

має бути зрозумілою з розгляду ДНК-зв'язувальних структурних моти-

вів. Зокрема, білково-нуклеїновий інтерфейс частіше представлений

парою

α-спіраль – великий жолобок завдяки хорошій просторовій

відповідності між цими двома елементами. Проте використовуються

також і β-структура, і перемички між елементами вторинної структу-

ри для впізнання пар основ у великому жолобку. Маленький жолобок

також використовується для впізнання послідовностей пар основ,

причому у випадку взаємодії елементів вторинної структури білка

(

α-спіраль чи β-структура) із маленьким жолобком така взаємодія су-

проводжується розкриттям маленького жолобка. Таке розкриття стає

можливим унаслідок значної деформації подвійної спіралі (розкручу-

вання, вигин, кінк у результаті порушення стекінг-взаємодій).

На поверхні ДНК розташовані фосфатні залишки та донорні / ак-

цепторні групи азотистих основ у жолобках. Саме ці групи й залуча-

ються до контактів з амінокислотними боковими залишками та пеп-

тидними групами на поверхні білка.

Існує декілька типів контактів

(взаємодій) між ДНК і білками:

Електростатичні взаємодії між позитивно зарядженими аміноки-

слотними залишками та негативно зарядженими фосфатами присут-

ні майже завжди в білково-нуклеїнових комплексах. Зрозуміло, що

електростатичні взаємодії відповідають за неспецифічне зв'язування.

Як правило, вони додатково стабілізують також і специфічні компле-

кси. Електростатичне зв'язування білка з нуклеїновою кислотою має

цілком ентропійну природу (див. також розділ 1). Висока концентра-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

ція негативних зарядів (фосфатів) на поверхні ДНК зумовлює форму-

вання навкруг ДНК “іонної атмосфери” з досить високою локальною

щільністю катіонів (рис. 3.21). Зв'язування позитивно зарядженого

білка призводить до визволення частки катіонів у зовнішній розчин,

тобто до зростання невпорядкованості (ентропії) у системі. Енергети-

чний виграш від зв'язування білка (його спорідненість до ДНК) є тим

більшим, чим меншою є концентрація солі в розчині, тобто різниця

між концентрацією катіонів поблизу від ДНК і на віддаленні від неї.

Рис. 3.21. Електростатичне зв'язування білка

(червоним позначені позитивно заряджені амінокислотні залишки)

з ДНК за рахунок визволення неорганічних катіонів

Водневі зв'язки між донорно-акцепторними групами білка та фос-

фатами й екзоциклічними групами азотистих основ. Водневі зв'язки,

оскільки вони потребують чіткої взаємної орієнтації донора й акцеп-

тора, відіграють роль головного фактора специфічного впізнання.

Кожна послідовність пар основ утворює в жолобках подвійної спіралі

власний патерн донорних і акцепторних груп (рис. 3.22, див. також

рис. 3.7), який і може впізнаватися поверхнею білка. Слід зазначити,

що цей патерн більш варіабельний у великому жолобку, де легше роз-

різнити пари основ і динуклеотидні контакти – це ще одна причина,

чому саме великий жолобок частіше використовується для впізнання.

Деякі амінокислотні залишки здатні утворювати два водневі зв'язки

з азотистою основою, наприклад, Arg із гуаніном. Проте Arg контак-

тує й з усіма іншими основами. Чи буде певний залишок залученим до

утворення водневого зв'язку, і якого саме, залежить від його орієнтації

на поверхні. Певні закономірності (своєрідний код, коли залишок пев-

Розділ 3. ДНК

ного типу в певному місці утворює зв'язок із певною основою) спосте-

рігаються іноді тільки в межах однієї родини структурних мотивів, але

й тоді такі закономірності не мають абсолютного характеру.

N7 O

O N7

N3 O

O N3

N3 O

O N3

Великий жолобок Маленький жолобок

Акцептор

онор

Рис. 3.22. Патерни донорів і акцепторів водневого зв'язку

в жолобках подвійної спіралі для зазначеної послідовності чотирьох пар основ

Водневі зв'язки, опосередковані молекулами води. Вода взаємодіє

з поверхнями як білків, так і ДНК. Визволення води з білково-нуклеї-

нового інтерфейсу вносить додаткову ентропійну складову

у стабілізацію комплексу. Але досить часто окремі молекули води

можуть залишатися в інтерфейсі, виконуючи роль біфункціональної

зшивки – утворюючи водневі зв'язки з білковими групами та фос-

фатами або групами азотистих основ.

Гідрофобні контакти можуть здійснюватись за участю метильної

групи тиміну у великому жолобку (рис. 3.7), але суттєвішими

є гідрофобні взаємодії при інтеркаляції неполярних амінокислотних

залишків між парами основ при деформації подвійної спіралі вна -

слідок занурення елементів вторинної структури білка в маленький

жолобок (рис. 3.18, 3.19).

Головною умовою реалізації названих контактів між ДНК і білком

є заємна підгонка структури взаємодіючих елементів унаслідок від-

повідних конформаційних перетворень.

Так, шляхом певних конфор-

маційних змін подвійної спіралі (вигини спіралі, зміни твіста тощо)

змінюється розмір жолобків, хімічні групи “підводяться” під водневі

зв'язки та міцні електростатичні контакти, збільшується загальна по-

верхня, що може взаємодіяти з білком. Це означає, що для ефектив-

ного впізнання необхідна певна конформація подвійної спіралі

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

та / або певні зміни цієї конформації. І те, й інше визначається по-

слідовністю пар основ. Отже, основою для білково-нуклеїнового впіз-

нання є структурно-динамічний поліморфізм нуклеотидних послідов-

ностей – залежні від послідовності структурні особливості та конфор-

маційна рухливість подвійної спіралі.

Рис. 3.23. Структура ДНК-зв'язувальних доменів

димеру репресора лактозного оперона E. coli

у комплексі з неспецифічною ДНК (а, 1OSL)

та зі своїм специфічним оператором (б, 1L1M)

При цьому білок також часто потребує певної конформаційної під-

гонки під подвійну спіраль. Один із прикладів такої, досить значної,

конформаційної зміни як у молекулі білка (формування додаткових

α-спіралей), так і у молекулі ДНК (вигин подвійної спіралі) при утво-

ренні специфічного комплексу показано на рис. 3.23. Саме в процесі

взаємної конформаційної підгонки білка та ДНК і реалізується спе-

цифічний патерн контактів у інтерфейсі між двома молекулами.

Від того, наскільки легко потрібні конформаційні зміни відбувають-

ся при зустрічі конкретного білка з конкретною послідовністю пар

основ, залежить ефективність упізнання. Таким чином , головним ме-

ханізмом упізнання послідовності ДНК білком є структурно-динамічна

комплементарність двох молекул.