Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 4

ОРГАНІЗАЦІЯ ДНК У КЛІТИНАХ:

ГЕНОМИ ТА СТРУКТУРА ХРОМАТИНУ

Il n'existe rien hors contexte.

J. Derrida

– Нет, – ответила Маргарита, –

более всего меня поражает, где все

это помещается.

М. Булгаков. Мастер и Маргарита

Організація геномів

Генетичний код

У послідовності нуклеотидів ДНК записана інформація про послі-

довність амінокислот у складі білків. Відповідність між цими двома

типами текстів – між комбінаціями нуклеотидів і амінокислотами –

називається генетичним кодом. Загальна кількість комбінацій по

два нуклеотиди із чотирьох дорівнює 16, а по три – 64. Тобто мініма-

льна кількість нуклеотидів у одному слові нуклеотидного тексту,

оскільки такими словами потрібно закодувати 20 амінокислот, має

дорівнювати трьом. Саме це й спостерігається: одне слово – кодон –

являє собою триплет нуклеотидів.

Послідовності всіх 64 кодонів (у напрямку від 5'- до 3'-кінця

у складі мРНК) наведено на рис. 4.1. Серед 64 кодонів три є сигнала-

ми зупинки синтезу білка (стоп-кодони, або нонсенс-кодони), решта –

61 змістовний кодон – відповідають двадцяти амінокислотам. Спів-

відношення між кодонами та амінокислотами є однозначним: певний

триплет кодує одну і

тільки одну певну амінокислоту. Зворотне спів-

відношення не є однозначним: більшість амінокислот кодуються кіль-

кома триплетами – код є виродженим. Дві амінокислоти – Trp і Met –

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

104

невироджені й кодуються лише одним кодоном кожна. Усі інші

18 амінокислот кодуються серіями кодонів-синонімів – від двох до

шести кодонів на серію.

2й нуклеотид

U C A G

UUU

UUC

UUA

UUG

UCU

UCC

UCA

UCG

UAU

UAC

UAA

UAG

UGU

UGC

UGA

UGG

CUU

CUC

CUA

CUG

CCU

CCC

CCA

CCG

CAU

CAC

CAA

CAG

CGU

CGC

CGA

CGG

AUU

AUC

AUA

AUG

ACU

ACC

ACA

ACG

AAU

AAC

AAA

AAG

AGU

AGC

AGA

AGG

1й

GUU

GUC

GUA

GUG

GCU

GCC

GCA

GCG

GAU

GAC

GAA

GAG

GGU

GGC

GGA

GGG

Phe

Leu

Tyr

Stop

His

Gln

Ser

Arg

Asn

Lys

Asp

Glu

Cys

Leu Pro

Ser

Arg

Thr

Ala

Val

Gly

Ile

Met

Trp

Stop

Рис. 4.1. Таблиця генетичного коду

Якщо розглянути триплети синонімічних серій, стає очевидним, що

три позиції кодона нерівнозначні:

• Найважливішою для визначення змісту кодона є комбінація

нуклеотидів у першій і другій позиції, при цьому друга пози-

ція визначає зміст кодона найбільш жорстко – нуклеотидні

заміни по другій позиції завжди приводять до зміни змісту

(амінокислотної заміни).

• Найменш змістовною є третя позиція – нуклеотидні заміни

в ній у 70 % випадків не приводять до зміни змісту кодона.

Залежно від того, який нуклеотид стоїть у другій позиції, усі ко-

дони та відповідні амінокислоти можна розділити на чотири групи

(чотири стовпчики в таблиці коду на рис. 4.1). Виявляється, що до

Розділ 4. Організація днк у клітинах: геноми та структура хроматину

105

групи U (урацил у другій позиції) належать гідрофобні амінокислоти

великого розміру з повністю аліфатичними боковими залишками (див.

також рис. 2.1). Тобто нуклеотидні заміни в першій та третій позиціях

у межах цієї групи не викликають зміни властивостей амінокислоти,

мінімізуючи вплив таких амінокислотних замін на просторову струк-

туру білка (див. розділ 2). До групи А належать великі полярні аміноки-

слоти (за виключенням Tyr, але й він, хоча загалом гідрофобний, також

здатен утворювати водневий зв'язок). Група С сформована маленьки-

ми амінокислотами. До групи G потрапляють амінокислоти з екстре-

мальними властивостями: найбільша гідрофобна – Trp, найбільша по-

лярна – Arg, найбільш реакційноздатна – Cys, найменша – Gly.

Генетичний код є досить універсальним – наведена таблиця коду

реалізується як для бактерій, так і для ссавців. Однак у деяких ви-

падках (окремі прокаріоти, гриби, водорості, а також автономна ге -

нетична система мітохондрій) спостерігаються невеличкі відхилення

від цієї універсальної таблиці.

A U G C C A G A U C C C G A A . . . U G A

Рис. 4.2. Три можливі рамки зчитування, одна з яких

(позначена червоними дужками) є відкритою

При синтезі білка (розділ 8) триплети зчитуються з нуклеотидного

тексту один за одним: сусідні триплети не перекриваються, і

між

ними відсутні проміжки . Відповідно, будь яка послідовність нукле-

отидів може бути прочитана трьома різними способами – містить

три рамки зчитування (рис. 4.2). Рамка, що знаходиться між стар-

товим (частіше як стартовий використовується метіоніновий кодон

AUG) і стоп-кодоном, називається відкритою рамкою зчитування

(ORF, open reading frame).

Гени

Відкрита рамка зчитування (кодуюча послідовність), яка містить

інформацію про амінокислотну послідовність білка, є найважливішою

змістовною частиною гена (gene). Але для того, щоб відбулась експресія

генетичної інформації (через синтез РНК і далі – білка), не менш важ-

ливими є регуляторні послідовності ДНК, які за рахунок спорідненості

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

106

до специфічних білків використовуються для вмикання / вимикання

транскрипції (див. розділи 5, 6) як першої стадії експресії гена. Отже,

визначення гена можна сформулювати так:

ген – це ділянка ДНК, яка

є необхідною і достатньою для повноцінного синтезу функціональної

молекули РНК.

Ділянка ДНК, яка може вважатися геном, має місти-

ти кодуючу послідовність, де записана інформація про продукт,

а також певний набір регуляторних елементів послідовності, від

яких залежить запуск / блокування процесу транскрипції, шлях зчи-

тування інформації тощо. Згідно з визначенням міжнародного кон-

сорціуму онтології послідовностей (Sequence Ontology Consortium),

ген – це “певна визначена зона послідовності ДНК, яка відповідає

одиниці спадковості та асоційована з регуляторними ділянками,

ділянками, що транскрибуються, та / або іншими функціональними

ділянками послідовності”.

Одним із найважливіших типів продуктів транскрипції генів є

мРНК –

матричні РНК (messenger RNA, mRNA), які використовуються далі

як матриці для синтезу білків (піддаються трансляції, див. розділ 8).

У цьому випадку білок є кінцевим продуктом гена, який, відповідно,

називається білковим. Крім того, досить велика кількість генів кодує

різноманітні молекули РНК, які не піддаються трансляції (є кінцевими

продуктами):

рРНК – рибосомні РНК (ribosome RNA, rRNA, розділ 8);

тРНК – транспортні РНК (transfer RNA, tRNA, розділ 8); маленькі ядерні

РНК (small nuclear RNA,

snRNA, розділ 7); маленькі ядерцеві РНК (small

nucleolar RNA,

snoRNA, розділ 8); мікро-РНК (micro RNA, miRNA, розділ 6),

молекули РНК, які є компонентами деяких ферментів; інші види РНК,

не для всіх із яких з'ясовано їхні функції.

Геноми

ДНК, що міститься у клітині, – це не тільки гени: принаймні мають

бути з'єднуючі міжгенні ділянки.

Сукупність послідовностей ДНК

у гаплоїдному наборі даного організму називається геномом

. На сьо-

годні повністю розшифровані послідовності більше 600 прокаріотич-

них і 80 еукаріотичних геномів. Головна відмінність між ними поля-

гає в тому, що в прокаріотичних геномах кодуючі послідовності ста-

новлять до 95 %, тоді як частка кодуючих послідовностей у геномах

еукаріотів не перевищує 3 %. Розміри деяких геномів і оцінка кілько-

сті білкових генів у їхньому складі наведені в табл. 4.1.

Розділ 4. Організація днк у клітинах: геноми та структура хроматину

107

Таблиця 4.1. Розміри геномів і кількість білкових генів деяких організмів

Організм

Розмір

геному

(пари основ)

Кількість

хромосом

(молекул

ДНК)*

Кількість

білкових

генів

Бактеріофаг φХ-174 5 386 1 10

Бактерія Escherichia coli

4,6·10

1 4 100

Аскоміцет

Saccharomyces cerevisiae

1,2·10

16 6 700

Нематода Caenorhabditis elegans 10

6 20 000

Плодова мушка Drosophila

melanogaster

1,3·10

4 14 000

Курка Gallus gallus

33 13 000

Миша Mus musculus

3,3·10

20 22 000

Людина Homo sapiens 3,2·10

23 21 000

Мітохондріальна ДНК людини 16 569 1 37

* Для еукаріотів наведено кількість хромосом у гаплоїдному наборі

Прокаріотичні й вірусні геноми. Схему організації одного з найпрос-

тіших (і першого з вивчених) геномів – геному бактеріофа г а

φХ-174

(слід читати “фі-десять”) – показано на рис. 4.3. Геном побудований

надзвичайно “економно”: десять генів (один із них дає два різні

транскрипти) займають практично всю циркулярну ДНК бактеріо-

фага. Більше того, декілька генів перекриваються за рахунок вико-

ристання різних рамок зчитування: гени А і С та С і D перекрива-

ються своїми кінцями, гени B, K і E повністю знаходяться у межах

інших генів; три гени – А, С і K – використовують усі три можливі

рамки зчитування на одній ділянці ДНК (звичайно, у даному випад-

ку всі три рамки є відкритими). Явище перекриття генів за рахунок

використання різних рамок зчитування спостерігається також для

кількох інших бактеріофагів, проте іноді зустрічається в еукаріотів.

Загалом геноми вірусів і бактеріофагів побудовані за подібним еко-

номним принципом: порівняно невелика кількість генів, мінімальна

кількість

міжгенної ДНК.

У геномі прокаріотичної клітини кількість ДНК і генів значно зрос-

тає, але зберігається принцип економічності щодо використання біль-

шості послідовностей для кодування генетичної інформації. Напри-

клад, геном Escherichia coli представлений однією циркулярною моле-

кулою ДНК (бактеріальною хромосомою) довжиною 4,6 млн пар основ.

Близько 90 % цієї ДНК припадає на кодуючі послідовності ~4100 білко-

вих генів і ~120 генів РНК, що не транслюється. Середній розмір гена

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

108

складається з 950 пар основ, середня довжина міжгенної ділянки –

118 пар основ. Проте, міжгенні зони мають досить нерівномірний роз-

поділ за довжиною, яка варіює від 0 до 1 тис. 730 пар основ.

3981-136

4497-136

5075-51 51-221

133-393

390-848

848-964

568-843

1001-2284

2395-2922

2931-3917

Рис. 4.3. Геном бактеріофага φХ-174.

Позначено початок і кінець кожного гена,

загальна довжина ДНК – 5386 пар основ

Приблизно ¾ транскрипційних одиниць E. coli містять один ген,

решта реалізує характерний для бактерій (і тільки для них) оперонний

принцип організації генетичного матеріалу. Оперон являє собою клас-

тер так званих структурних генів, на яких синтезується одна моле-

кула мРНК, що має кілька (на кожен структурний ген) послідовних

(які не перекриваються) відкритих рамок зчитування для трансляції

відповідних білків (див. приклади організації та регуляції оперонів

у розділі 5). У межах оперона згруповані структурні гени, які відпові-

дають за синтез білків, залучених до одного ланцюжка біохімічних

перетворень (ферменти синтезу або деградації певної сполуки). Крім

структурних генів оперон має регуляторні ділянки, за рахунок яких

здійснюється регуляція транскрипції оперона як цілого. У геномі E.

coli міститься ~650 таких одиниць транскрипції.

Характерною особливістю бактерій є наявність у клітині, поряд із

бактеріальною хромосомою, невеликих автономних елементів геному –

плазмід. Плазміда є циркулярною молекулою ДНК (типовий розмір

Розділ 4. Організація днк у клітинах: геноми та структура хроматину

109

~3 тис. пар основ), яка містить кілька генів і реплікується незалежно

від бактеріальної хромосоми. Плазміди широко використовуються як

зручний інструмент молекулярно-біологічних досліджень (див. розділ 11).

Циркулярна ДНК бактеріальної хромосоми існує у клітині у вигляді

комплексу з білками. Ця взаємодія є досить динамічною, і практично

весь бактеріальний геном (що принципово відрізняє його від еукаріо-

тичного геному, див. нижче) перебуває в потенційно транскрипційно-

активному стані: гени й оперони є об'єктами швидкої оперативної ре-

гуляції у відповідь на зміну зовнішніх умов.

Еукаріотичні геноми містять значно більшу кількість ДНК порівня-

но з геномами прокаріотів (див. табл. 4.1), причому переважна частина

цієї ДНК представлена послідовностями, що не є кодуючими. У тому

числі приблизно половина еукаріотичного геному – це послідовності,

представлені багатьма копіями (послідовності, що повторюються). Еука-

ріотична ДНК існує у клітинному ядрі у складі хромосом, кожна хромо-

сома містить одну гігантську лінійну молекулу ДНК. Послідовності, що

повторюються, зосереджені на кінцях хромосом (теломери) і в зонах

прикріплення хромосом до веретена поділу при мітозі (центромери).

Характерною ознакою генів еукаріотів (на відміну від прокаріотів)

є мозаїчний принцип будови кодуючої частини: власне кодуюча час-

тина – це послідовність окремих змістовних ділянок – екзонів (exon),

розділених беззмістовними інтронами (intron). Часто екзони відпові-

дають окремим структурним доменам мультидоменних білків: еволю-

ційне збирання білка з кубиків-доменів може здійснюватись шляхом

перетасування екзонів на рівні ДНК. Беззмістовними інтрони є в то-

му сенсі, що не містять інформації про кінцевий продукт, але в межах

інтронів часто розташовані важливі регуляторні ділянки. При транс-

крипції молекула РНК синтезується суцільно (первинний продукт

транскрипції – первинний транскрипт – містить екзони та інтрони).

Отже, необхідним етапом експресії гена є процес сплайсингу (розділ 7) –

вирізання інтронів і зшивання екзонів у кінцевий транскрипт, який

може бути використаний як матриця для білкового синтезу. При цьо-

му сплайсинг може бути спрямований різними шляхами (рис. 4.4) –

альтернативний сплайсинг, – унаслідок чого утворюються різні кін-

цеві продукти – різні білки. Таким чином, альтернативний сплайсинг

можна інтерпретувати як механізм “перекриття” еукаріотичних генів.

Інший випадок перекриття генів у геномах еукаріотів пов'язаний

з можливістю розташування гена (зі своїми інтронами та екзонами)

у межах інтрона іншого гена. В окремих випадках спостерігається

також перекриття відкритих рамок зчитування.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

110

інтрон

екзон

Транскрипція,

сплайсинг

Рис. 4.4. Мозаїчна будова кодуючої частини гена

та схема утворення різних кінцевих продуктів

унаслідок альтернативного сплайсингу

Усі гени багатоклітинного організму можна розділити на дві групи:

1) гени, від яких залежать певні універсальні функції та які активні

в усіх клітинах, – “гени домашнього господарства” (housekeeping

genes); 2) гени, що специфічно активуються у клітинах певного типу, –

“гени розкоші” (luxury genes). Загальною ознакою генів першої

групи є розташування в їхніх регуляторних зонах CpG-острівців

(CpG-islands) – ділянок із підвищеним вмістом динуклеотидів CpG

(контактів типу CG між парами основ, див. розділ 3). Вміст цих ди-

нуклетидів в еукаріотичних геномах приблизно у п'ять разів менший за

очікуваний унаслідок метилування цитозину в складі CpG-контакту:

5mC (5-метилцитозин) спонтанно перетворюється на тимін. Мети-

лування цитозину в регуляторних ділянках є одним із механізмів

репресії генів (див. розділ 6). Відповідно, гени, що зберігають свою

активність у більшості клітин, містять неметильовані динуклеотиди

CpG, вміст яких зберігається на високому рівні (для ДНК випадко-

вої послідовності із 40 % GC-пар очікуваний вміст динуклеотидів

CpG становить 4 %).

Типове значення вмісту GC-пар в еукаріотичних геномах – близько

40 % (у геномі людини – 41 %). Проте спостерігаються варіації локаль-

ного GC-вмісту в широких межах – від 30 до 60 %; зустрічаються

й досить довгі ділянки (до кількох мільйонів пар основ) з аномальним

вмістом GC-пар. Загальна тенденція при цьому така: високий вміст

GC-пар корелює з високою щільністю генів, зменшеною довжиною ін-

тронів і низькою щільністю послідовностей, що повторюються.

Розділ 4. Організація днк у клітинах: геноми та структура хроматину

111

Серед еукаріотичних генів 25–50 % є унікальними (представлені

в геномі єдиною копією), решта належать до родин генів, що склада-

ються з кількох копій, як правило, не ідентичних. Відповідні (гомоло-

гічні але не ідентичні) білки складають родину білків. Кілька родин

(протеїнкінази, транскрипційні фактори певного типу, імуноглобуліни)

містять сотні білків, більшість родин складається з кількох (до 30) біл-

ків. Гени такої родини часто об'єднані в геномі в кластери – розташо-

вані поряд у певній хромосомі (кластери генів теплового шоку, глобі-

нові гени). Слід зауважити, що такий кластер не є опероном – кожен

ген піддається регуляції як окрема одиниця транскрипції. Наприклад,

кластер генів

β-субодиниці гемоглобіну містить гомологічні гени, які

активуються на певних стадіях індивідуального розвитку (рис. 4.5).

εγγψβδβ

~60 000 пар основ

Ембріон

Утро

ний

розвиток

Псевдоген

орослий

організм

Рис. 4.5. Кластер β-глобіну в 16-й хромосомі людини

(кожен ген містить інтрони). Указано стадії розвитку,

на яких відповідні гени є активними

β-Глобіновий кластер містить також неактивний псевдоген. Псевдоге-

ни – це послідовності, гомологічні певним генам, але не експресуються.

До такої дезактивації гена може призвести мутація, яка порушує ініціа-

цію транскрипції, сплайсинг, викликає невчасну термінацію тощо.

Після дезактивації псевдоген перестає бути об'єктом відбору, і в ньому

накопичується велика кількість мутацій. Зрозуміло, що в першу чергу

псевдогени виникають саме в кластерах – коли є кілька копій гена,

і пошкодження одного з них не приводить до фатальних наслідків.

Типовою ознакою еукаріотичних геномів є наявність кількох типів

генних кластерів, що повторюються багато разів. Серед білкових генів

це стосується генів гістонів – структурних білків хроматину (деталь-

ніше йтиметься у наступному підрозділі). Гени п'яти молекул гістонів

завжди згруповані в кластер (кожен ген – окрема одиниця транскри-

пції), який повторюється до 100 разів. Іншим прикладом кластерів,

що повторюються, є гени рибосомної РНК (рис. 4.6, тип рибосомних

РНК позначають за їхньою константою седиментації, див. розділ 8).

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

112

У цьому випадку кластер є одиницею транскрипції, первинний

транскрипт піддається далі “дозріванню” – частковій деградації

з утворенням окремих молекул рРНК. Такий тандемний повтор рибо-

сомного кластера є ядерцевим організатором – зоною, де утворюється

ядерце (місце збирання рибосом). Гени рРНК ще одного типу – 5S –

також тандемно повторюються в іншому місці геному. Також зібрані

в тандемні кластери частина генів тРНК і маленьких ядерних РНК

18S 5,8S 28S

~11 000 пар основ, 100-1000 повторів

Рис. 4.6. Кластер генів рибосомних РНК,

який повторюється в зоні ядерцевого організатора.

Червона стрілка позначає первинний транскрипт

Загальна кількість генів у геномах вищих еукаріотів варіює при-

близно від 20 до 30 тис. (табл. 4.1). Так, у геномі людини кількість біл-

кових генів становить 21 тис., ще кілька тисяч генів кодують РНК,

яка не піддається трансляції. Наведемо як приклад кілька загальних

характеристик білкових генів людини:

• Середній розмір гена (ураховуючи інтрони) – 100 тис. пар ос-

нов (максимум – 2 млн 400·тис.).

• Середній розмір кодуючої частини – 1 тис. 400 пар основ

(максимум – 80 тис.).

• Середній розмір екзона – 150 пар основ.

• Середня кількість екзонів – 9 (максимум – 178).

• Середній розмір інтрона – 5 тис. пар основ (максимум –

820 тис.).

Загальною тенденцією, що спостерігається в геномі людини,

є наявність порівняно коротких екзонів, розділених довгими інтрона-

ми. Приблизний розподіл білків людини (сукупність усіх білків органі-

зму називається протеомом) за їхніми функціями зображено на

рис. 4.7. Як видно з рис . 4.8, кодуючі послідовності цих генів займають

лише ~1,5 % геному. Решта припадають на міжгенну ДНК (де містять-

ся також регуляторні ділянки), інтрони (~34 %) і, більше половини ге-

ному, – на послідовності, що повторюються.