Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 5. Транскрипція: Прокаріоти

133

промотор

кор-фермент

ααββ'ω

Зак

итий комплекс

Відкритий комплекс,

утворення першого

зв'язку

Зростання

первинного

ранскрипту

Очищення промотора,

початок елонгації

РНК

Рис. 5.1. Ініціація транскрипції бактеріальною РНК-полімеразою

Структура РНК-полімерази

Дві субодиниці α взаємодіють між собою в складі кор-ферменту

бактеріальної РНК-полімерази (рис. 5.2), виконуючи структурну

роль: вони сприяють утриманню разом інших частин ферменту. Дві

великі субодиниці – β і β' – формують характерні “щелепи” (форма

нагадує також клішню краба), у щілині між якими з ферментом вза-

ємодіє ДНК, розташована “нижче” (downstream) у напрямку руху по-

лімерази від точки, яка в даний момент знаходиться в активному

центрі. Щелепи є рухливими елементами, здатними розмикати-

ся /замикатися під час роботи полімерази.

Глибоко в щілині між щелепами, ліворуч від F-спіралі (F bridge

helix), що зображена на рис. 5.2 (належить до найбільшої субоди-

ниці

β'), розташований каталітичний активний центр: 3 залишки Asp

(також належать до

β'), що утримують ключовий для каталізу іон Mg

(рис. 5.3). Структурні елементи, які оточують активний центр, забезпечу-

ють взаємодію полімерази з нематричним ланцюгом ДНК (підтримуючи

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

134

його розплавлений стан), дволанцюговим гібридом ДНК-РНК, сприя-

ють поділу подвійної спіралі ДНК нижче від активного центру, поділу

подвійної спіралі ДНК-РНК гібрида та відновленню подвійної спіралі

ДНК вище (upstream) активного центру. Від активного центру, де міс-

титься 3'-кінець РНК, що зростає, РНК виходить за межі полімеразно-

го комплексу через спеціальний канал. Інший, так званий вторинний

канал, дозволяє нуклеозидтрифосфатам потрапляти до точки зрос-

тання РНК. Загальну схему будови полімерази в комплексі з ДНК

і РНК під час елонгації транскрипції наведено на рис. 5.4.

β'

Кор-фермент

Голофермент

Напрямок руху

F-спіраль

Рис. 5.2. Структура РНК-полімерази Thermus thermophilus (1IW7)

Описані риси структурної організації бактеріальної РНК-полімерази

(рухливі щелепи, активний центр з іоном Mg

, канали для виходу

РНК і заходу NTP) є загальними для усіх РНК-полімераз. Це стосується

не тільки гомологічних еукаріотичних полімераз (див. розділ 6). Деякі

бактеріофаги (зазвичай фаги використовують полімеразу клітини-

хазяїна) мають власні РНК-полімерази, що є мономерними білками без

гомології в амінокислотній послідовності до субодиниць бактеріальної

полімерази (рис. 5.5). Простота мономерних полімераз (яка робить їх

Розділ 5. Транскрипція: Прокаріоти

135

зручним об'єктом досліджень) зумовлена тим, що вони мають упізна-

вати лише кілька промоторів фагових генів. Але вказані вище загаль-

ні риси структурної організації РНК-полімераз та базові принципи

функціонування зберігаються і для них.

F-спіраль

Asp

Рис. 5.3. Активний центр поряд із F-спіраллю

у складі РНК-полімерази Thermus aquaticus (1HQM).

Орієнтація полімерази приблизно така сама, як на рис. 5.2

РН

Матричний

анцюг ДН

NTP

Рис. 5.4. Схема організації полімеразного комплексу

(у розрізі) під час елонгації транскрипції

У структурі голоферменту бактеріальної РНК-полімерази присутня

додаткова субодиниця

σ. Вона має мультидоменну структуру (рис. 5.2)

і здійснює різноманітні взаємодії з обома великими субодиницями

(

β і β'): фіксує певне положення щелеп, взаємодіє з активним центром

і його оточенням. Розташування

σ-фактора на поверхні полімеразного

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

136

комплексу дозволяє йому здійснювати впізнання промотора. Крім того,

частина

σ взаємодіє з каналом виходу РНК (порівн. рис. 5.2 і 5.4), бло-

куючи його: дисоціація

σ є необхідною для виходу синтезованої РНК,

тобто для вільного руху полімерази вздовж матриці під час елонгації.

Рис. 5.5. Структура елонгаційного комплексу

мономерної РНК-полімерази бактеріофага Т7 (1MSW).

Матричний ланцюг ДНК – темно-синій, РНК – червона

Ініціація транскрипції

Зрозуміло, що РНК-полімераза може бути орієнтована відносно ДНК

двома способами: кожній із цих орієнтацій буде відповідати два можли-

ві напрямки руху ферменту при транскрипції. Відповідно, один із двох

ланцюгів ДНК буде обиратися як матричний – той, з якого зчитується

інформація в напрямку 3'–5' і на якому синтезується комплементарний

ланцюг РНК у протилежному напрямку 5'–3' (рис. 5.6).

Послідовність ланцюга ДНК, який є комплементарним матрично-

му, збігається з послідовністю РНК, що синтезується. Тому саме цей

нематричний ланцюг називають кодуючим або змістовним, і саме

його послідовність прийнято наводити як послідовність даного гена

(матричний ланцюг називають, відповідно, антикодуючим). Нуклео-

тид кодуючого ланцюга, який відповідає стартовому нуклеотиду РНК

(частіше пуриновий), позначається як +1, наступні нуклеотиди

(чи пари основ) у напрямку руху полімерази нумерують із познач-

кою “+”: +2, +3 і т.д. У зворотному напрямку (ліворуч на рис. 5.6)

нуклеотиди нумерують із позначкою “–” (починаючи з –1).

Розділ 5. Транскрипція: Прокаріоти

137

T T G A C A T A T

A T

A/G

-10

-35

Кодуючий

(

змістовний

)

ланцюг

Антикодуючий

(

антизмістовний

)

ланцюг

12-14 па

основ

Рис. 5.6. Типовий промотор E. coli. Зелена стрілка

позначає старт транскрипції всередині розплавленої зони

Типовий бактеріальний промотор (рис 5.6) складається із двох еле-

менті в послідовності, які знаходяться на відстані приблизно –10 і –35

від стартової точки. Консенсусна (узагальнена для різних промоторів)

послідовність елемента –35 має вигляд T

(числами по-

значено частоту даної пари основ у відсотках). Послідовність елемен-

та –10 (називається також боксом Прибноу (David Pribnow) – Pribnow

box): T

. Варіабельність послідовностей визначає різну

ефективність ініціації – силу промоторів. Саме елементи –35 і –10

безпосередньо впізнаються

σ-фактором при ініціації транскрипції.

Наведені послідовності впізнаються варіантом

σ-фактора з молекуля-

рною вагою 70 кДа (

), який є досить широко вживаним, але не

єдиним. Кільком іншим варіантам

σ, під контролем яких знаходяться

певні групи промоторів, відповідають інші консенсусні послідовності

–35 та –10. Взаємодія

σ-фактора з промотором чітко орієнтує РНК-полі-

меразу відносно ДНК, тобто визначає і стартову точку транскрипції,

і її напрямок (вибір одного з двох ланцюгів як матричного).

Вважається, що субодиниця

σ утримує щелепи у відкритому поло-

женні у складі голоферменту. Це сприяє підвищенню швидкості ди-

соціації білка від непромоторної ДНК і гарантує низьку ефективність

транскрипції з випадкових сайтів на ДНК (рис. 5.7). За умови впіз-

нання

σ-фактором двох елементів промотора відбувається структурна

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

138

перебудова полімеразного комплексу із замиканням щелеп. У резуль-

таті ДНК у зоні пари основ +1 потрапляє всередину щілини між щеле-

пами – утворюється закритий комплекс.

Початкове

зв'язування

Упізнання

промотора:

закритий

комплекс

Плавлення

НК:

відкритий

комплекс

Очищення

промотора:

початок

елонгації

Рис. 5.7. Послідовність подій при ініціації транскрипції

Дуже швидко закритий комплекс перетворюється на відкритий:

замикання ДНК у щілині приводить до того, що подвійна спіраль не

може розміститися там за недостатністю простору. У результаті від-

бувається локальне плавлення 12–14 пар основ (формування транс-

крипційного міхура) у зоні від –7 до +5 відносно стартової точки (рис.

5.6, 5.7). Важливим фактором, що сприяє локальному плавленню по-

двійної спіралі у складі відкритого комплексу, є наявність у цирку-

лярній бактеріальній ДНК певного рівня негативної надспіралізації –

напружень, що полегшують розкручування дуплекса (див. розділ 3).

Плавлення ДНК у щілині РНК-полімерази відбувається за рахунок

взаємодії двох ланцюгів із внутрішньою поверхнею щілини: нематри-

чний ланцюг захоплюється певними структурними елементами полі-

мерази, матричний – опиняється в активному центрі. За активним

центром ДНК робить вигин майже під прямим кутом відносно ДНК,

що лежить нижче від активного центру.

Наступна, найповільніша стадія ініціації – синтез першого фосфодіе-

фірного зв'язку, тобто ініціація власне синтезу РНК. Здатність ініціюва-

ти синтез нуклеїнової кислоти – унікальна властивість РНК-полімерази

(ДНК-полімераза здатна лише продовжувати синтез уже існуючого лан-

цюга, див. розділ 9). Ініціація синтезу є дуже важкою, оскільки при цьому

дві порівняно невеликі молекули – перші два нуклеотиди – мають бути

жорстко зафіксовані в активному центрі в певній геометрії. Така фікса-

ція залежить від взаємодій

σ-фактора з активним центром: певною мі-

рою субодиниця

σ відіграє роль 3'-кінцевої ділянки РНК, яка бере участь

Розділ 5. Транскрипція: Прокаріоти

139

у створенні сайта зв'язування чергового нуклеотиду при елонгації

(див. нижче), але якої ще не існує при ініціації.

Далі процес нарощування транскрипту продовжується ще до вось-

ми–дев’яти нуклеотидів, які можуть розміститися в межах РНК-полі-

меразного комплексу до виходу в спеціальний канал. У процесі зрос-

тання цього первинного транскрипту можливе його визволення –

абортивна ініціація. Узагалі, оточення активного центру РНК-поліме-

рази має високу спорідненість до тимчасового РНК-ДНК-гібрида, що

існує під час транскрипції (див. рис. 5.4). Але чим коротшим є гібрид,

тим менше взаємодій він реалізує з полімеразою, і тим менш стабіль-

ним він є. Додаткова стабілізація короткого гібрида здійснюється завдя-

ки взаємодії з ним

σ-фактора.

Друга причина абортивної ініціації – конкуренція між

σ-фак-

тором і РНК за канал виходу. У принципі, після зростання транс-

крипту до 9–10 нуклеотидів

σ-фактор більше не потрібен – “мавр

зробив свою справу”. Можливий програш з боку РНК конкуренції

за канал є своєрідною платою за можливість ініціювати синтез

першого зв'язку. У разі такого програшу голофермент може повто-

рити свою спробу ініціювати транскрипцію. Якщо ж конкуренцію

виграє РНК,

σ-фактор (після синтезу близько 12 нуклеотидів) нареш-

ті витісняється з комплексу (відбувається очищення промотора)

і розпочинається елонгація транскрипції.

Елонгація транскрипції

При елонгації транскрипції РНК-полімераза рухається вздовж ма-

триці разом із розплавленими 12–14 парами основ у транскрипцій-

ному міхурі (рис. 5.4, 5.8). При цьому на кожному кроці полімерази

одна пара основ руйнується попереду міхура й одна відновлюється

позаду. Розділення подвійної спіралі ДНК перед міхуром полегшуєть-

ся так званою G-петлею РНК-полімерази (G-trigger loop, рис. 5.8).

У зоні міхура з полімеразою завжди зв'язаний ДНК-РНК-гібрид дов-

жиною вісім–дев’ять пар основ: вісім–дев’ять нуклеотиді в на 3'-кінці

РНК залучені до утворення подвійної спіралі з матричним ланцюгом,

наступні п’ять–шість нуклеотидів локалізовані в каналі виходу РНК,

решта нуклеотидів на 5'-кінці виходять за межі полімеразного ком-

плексу. Поділу гібрида, а отже, і відновленню ДНК-дуплекса, сприяє

L-петля (lid loop, рис. 5.8).

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

140

i + 1

i + 15

i -8

L-петля F-спіраль

G-петля

RNAP

NTP

Вторинний

канал

Канал

виходу РНК

РН

Рис. 5.8. Вихідна конфігурація системи транскрипції

на початку елонгаційного циклу

Наявність ДНК-РНК гібрида при транскрипції є дуже важливою

обставиною. Цей гібрид існує завдяки специфічним взаємодіям, які

реалізують з ним певні елементи полімерази . Висока спорідненість

РНК-полімерази до гібрида забезпечує високу

процесивність ферме-

нту – здатність працювати на матриці без дисоціації. Інший фактор

підвищення процесивності – взаємодія транскрипту з каналом виходу

РНК. Дисоціація полімерази, яка була можливою під час синтезу пер-

винного транскрипту, поки гібрид був недостатньо довгим (абортивна

ініціація, див. вище), під час елонгації стає малоймовірною подією.

На рис. 5.8 схематично зображено вихідну конфігурацію системи на

початку кожного елонгаційного циклу перед зв'язуванням чергового NTP.

Сайт зв'язування формується 3'-кінцевим нуклеотидом РНК, неспаре-

ним нуклеотидом матричного ланцюга ДНК (позначеним як і+1), ак-

тивним центром полімерази та його оточенням, зокрема F-спіраллю

(рис. 5.3, 5.8). ОН-група на 3'-кінці РНК фіксується в активному

центрі поряд з іоном Mg

(рис . 5.3, 5.9). NTP потрапляє до сайту зв'я-

зування через вторинний канал разом з другим іоном Mg

Перший етап елонгаційного циклу – відбір і зв'язування нуклео-

зидтрифосфату, яке контролюється матрицею (нуклеотидом і+1).

Спорідненість усіх чотирьох типів NTP до РНК-полімерази є досить

невисокою, що дозволяє їм здійснювати швидке зв'язування / ди-

соціацію. Реалізація комплементарних взаємодій NTP із відповідним

Розділ 5. Транскрипція: Прокаріоти

141

нуклеотидом матриці (поява нового ліганду в сайті зв'язування –

комплементарної нуклеотидної пари) викликає конформаційну змі-

ну із замиканням NTP та жорсткою фіксацією субстратів у актив-

ному центрі (рис. 5.9, 5.10).

Другий етап – хімічна реакція приєднання чергового нуклеотиду

до 3'-кінця транскрипту (рис. 5.9). За умови реалізації комплементар-

них взаємодій між NTP і нуклеотидом у складі матриці, NTP жорстко

фіксується в активному центрі в певній “напруженій” реакційно-

здатній конформації, яка може розглядатися як інтермедіат реакції.

CAG

–

P P P

PPP

CAG

P P P

PPP

CAG

P P P

PPP

субстрати

інтермедіат

продукти

Рис. 5.9. Хімічна схема процесу приєднання нуклеотиду

Найважливішу роль у фіксації інтермедіату відіграють два іони

(один утримується в активному центрі завжди, інший, який потра-

пив туди разом з NTP – тимчасово, через взаємодію з двома із трьох

залишків Asp активного центру). Перший іон взаємодіє з

α-фосфатом

NTP і 3'-ОН групою, забезпечуючи зокрема її іонізацію (рис. 5.9).

Другий іон стабілізує певну напружену конформацію всіх трьох фос-

фатних залишків. Спорідненість активного центру до інтермедіату

і жорстка фіксація субстратів забезпечує зниження активаційного

бар'єра реакції, тобто її каталіз (див. розділ 2). Результатом реакції

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

142

є подовжений на один нуклеотид 3'-кінець РНК і відщеплений піро-

фосфат. Крім того, унаслідок реакції змінюється розташування ліган-

ду (3'-кінця) відносно активного центру (рис. 5.9; 5.10).

i+1

i+1i

i+1 i+2i

Елонгація

Редагування

Зв'язування

NTP

Приєднання

нуклеотида

Транслокація

Неста

ільна

пара

Зворотни

хі

F-спіраль

Рис. 5.10. Послідовність подій в елонгаційному циклі

(збільшений фрагмент схеми на рис. 5.8). Показано також

альтернативний шлях при редагуванні помилок. Праворуч:

енергетичні профілі, що відповідають руху полімерази вперед

відносно матриці при елонгації (угорі) і назад при редагуванні (унизу)

Зміна ліганду та дисоціація пірофосфату спричиняє "розмикання"

структури в зоні активного центру, яке дозволяє рух полімерази.

Відбувається

третій етап – транслокація у напрямку оптимально-

го розташування подовженого 3'-кінця відносно активного центру

(рис. 5.10). Рух полімерази при транслокації відбувається як одномір-

на дифузія вздовж матриці за рахунок енергії теплових флуктуацій,

тобто можливим є рух як "уперед", так і "назад". Пересування поліме-

рази вперед супроводжується руйнуванням однієї нуклеотидної пари

у складі РНК-ДНК гібрида та відновленням однієї пари ДНК позаду

від транскрипційного міхура. Одночасно руйнується одна пара ДНК

попереду від міхура. Якщо взяти до уваги, що на попередньому етапі

внаслідок хімічної реакції відбулося утворення пари в гібриді, то ма-

ємо практично ізоенергетичний процес – дві нуклеотидні пари утво-