Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

173

Це забезпечує динамізм активації: енхансосома не є фіксованою,

а збирається / розбирається в певні моменти.

Активаційні домени ТФ і коактиватори мають, у свою чергу, спорі-

дненість до медіатору та базальних факторів транскрипції. Результа-

том такої взаємодії є ефективне збирання преініціаторного комплексу

на базальному промоторі (рис. 6.12). Слід зауважити, що певні ком-

поненти мультибілкових комплексів, які збираються на промоторах,

можуть, навпаки, блокувати ініціацію транскрипції – тоді їх назива-

ють репресорами та корепресорами.

Енхансер

Проксимальні

елементи

Кодуюча

ілянка

ТАТА

RNAPII

Медіатор

TFIIB TFIID

TFIIA

TFIIF

TFIIH

TFIIE

Енхансер

Проксимальні

елементи

Активатори

Коактиватори

Рис. 6.12. Схема збирання комплексу активації транскрипції

Зовнішня регуляція активності транскрипційних факторів

Активність певного гена залежить від наявності у клітині певного

набору активаторів / репресорів транскрипції. Відповідно, гени са-

мих факторів транскрипції перебувають під контролем складних сис-

тем регуляції, що працюють під час розвитку та диференціації клітин.

У результаті в клітині певного типу відбувається синтез специфічного

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

174

набору ТФ, що призводить до активації специфічного набору генів.

У той же час, експресія певного гена може оперативно контролюва-

тися у відповідь на зовнішні сигнали шляхом зміни активності вже

синтезованих транскрипційних факторів. Два найважливіші механі-

зми такої регуляції – взаємодія ТФ певного типу зі стероїдними гор-

монами та каскади посттрансляційних модифікацій у відповідь на

дію хімічних сигналів (сигнальна трансдукція).

Гормонові рецептори – транскрипційні фактори, активність яких

залежить від стероїдних гормонів. Гормоновий рецептор (зазвичай го-

модимер) складається з трьох структурних доменів: 1) ДНК-зв'язуваль-

ний домен, що має специфічну спорідненість до певних елементів по-

слідовності ДНК (див. рис. 3.14, б); 2) активаційний домен; 3) гормон-

зв'язувальний домен. У відсутності гормону білок міститься в цитопла-

змі, де гормон-зв'язувальний домен взаємодіє з білком теплового шоку

hsp90 (розділ 8), який підтримує недоструктурований стан домену.

У результаті гормоновий рецептор є інактивованим (рис. 6.13).

Цитоплазма

дро

гормон

DBD

HBD

hsp90

Рис. 6.13.

Активація гормонового рецептора стероїдним гормоном.

AD – активаційний, DBD – ДНК-зв'язувальний,

HBD – гормон-зв'язувальний домени.

Коли гормон проникає в цитоплазму, він взаємодіє з гормон-

зв'язувальним доменом, витісняючи hsp90, відбувається остаточне

структурування гормонового рецептора, і той стає активним – прямує

до ядра, де зв'язується зі специфічним елементом послідовності. Сайт

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

175

зв'язування гормонового рецептора є досить маленьким, а чим коро-

тшою є довжина сайта зв'язування, тим імовірнішою є його доступ-

ність. Тому взаємодія гормонового рецептора з ДНК часто запускає

каскад збирання енхансосоми: рецептор рекрутує інші транскрип-

ційні фактори за рахунок свого активаційного домену.

Сигнальна трансдукція. Приклад сигнальної трансдукції наведено

на рис. 6.14. Білковий гормон не проникає у клітину, а зв'язується ре-

цептором на зовнішньому боці мембрани. Рецептор є гомодимером,

і у відсутності гормону дві субодиниці вільно дифундують у площині

мембрани. Зв'язування гормону викликає димеризацію, унаслідок чого

в цитоплазматичної частини рецептора виникає кіназна активність.

Кіназа фосфорилює неактивні субодиниці транскрипційного фактора.

Після фосфорилювання субодиниці об'єднуються в димер, що й акти-

вує цей фактор: він проникає в ядро, де знаходить специфічну послі-

довність ДНК. Наведена схема є найпростішим варіантом сигнальної

трансдукції: часто примембранна кіназа запускає каскад фосфорилю-

вання – фосфорилює білок, який набуває внаслідок цього кіназної ак-

тивності, ця нова кіназа фосфорилює інший білок (або кілька різних

білків, завдяки чому здійснюється підсилення сигналу та / або його

розгалуження по кількох шляхах, спрямованих до кількох кінцевих

мішеней), перетворюючи його на кіназу, і так далі – до фосфорилю-

вання та, відповідно, активації транскрипційного фактора.

Цитоплазма

дро

ілковий

гормон

рецептор

кіназа

Неактивний

мономер

Рис. 6.14. Активація транскрипційного фактора

у відповідь на дію білкового гормону

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

176

Ацетилювання гістонів

Нуклеосоми та хроматинова фібрила в цілому виступають як зага-

льний репресор генної активності. Тим самим вони допомагають за-

безпечити загальну інактивацію більшості генів в еукаріотичній клі-

тині, за винятком тих, чия активація здійснюється за участю ТФ.

Ключовим моментом механізмів активації є підвищення доступності

регуляторних сайтів у складі промоторів, що забезпечується, зокрема,

специфічними модифікаціями гістонових хвостів (див. розділ 4). Спе-

цифічна картина (патерн) модифікацій відіграє також і зворотну роль

– у здійсненні гарантованої репресії гетерохроматинових ділянок.

Серед інших модифікацій ацетилювання залишків Lys (у певних

консервативних позиціях, див. рис. 4.13) майже завжди корелює

з активацією транскрипції – ацетильовані гістон-ацетилтрансфера-

зами гістони акумулюються в активних промоторах, і навпаки – дія

гістон-деацетилаз призводить до інактивації. Гістон-ацетилтранс-

ферази (НАТ) входять до складу мультибілкових комплексів, які час-

то є компонентами енхансосом. НАТ-комплекси можуть рекрутува-

тися до промоторів транскрипційними факторами чи кофакторами

(наприклад, активаційним доменом гормонового рецептора). Зв'язу-

вання НАТ може індукуватися іншими гістоновими модифікаціями,

скажімо, через впізнання фосфорильованого Ser10 гістону Н3. Крім

того, часто до складу НАТ входять бромодомени – структурні модулі,

які мають специфічну спорідненість до ацетильованих лізинів. Тобто

НАТ упізнають Lys, уже ацетильовані іншими НАТ, і здійснюють

ацетилювання сусідніх нуклеосом, підтримуючи таким чином аце-

тильований статус певної ділянки хроматину.

Механізми головних впливів ацетилювання гістонів на структуру

хроматину та активацію транскрипції полягають у наступному:

• Ацетилювання сприяє деконденсації хроматинової фібрили за

рахунок зниження позитивного заряду головних факторів

конденсації, якими є гістонові хвости. У результаті знижуєть-

ся спорідненість ацетильованих нуклеосом до гістону Н1, що

далі сприяє деконденсації фібрили. Розгортання фібрили

й тимчасова дисоціація Н1 створює “вікно можливості” для

зв’язування регуляторних факторів на виході ДНК з нуклео-

соми та з міжнуклеосомною лінкерною ДНК.

• Хоча ацетилювання гістонів не змінює структуру нуклеосо-

ми, зниження позитивного заряду гістонових хвостів при-

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

177

зводить до дестабілізації нуклеосоми на виході з неї нуклео-

сомної ДНК за рахунок підвищення електростатичного роз-

штовхування між сусідніми витками нуклеосомної суперспі-

ралі (див. розділ 4). У результаті полегшується тимчасове

руйнування нуклеосом іншими факторами: перенесення гі-

стонів на проміжні акцептори та робота комплексів ремоде-

лювання хроматину (див. нижче).

• Ацетильовані лізинові залишки гістонів можуть безпосеред-

ньо впізнаватися факторами й кофакторами транскрипції.

Так, наявність бромодомену у складі TAF

250 (див. вище)

сприяє підвищенню локальної концентрації TFIID у ацетил-

ьованих ділянках хроматину.

Доступність промоторів

Залежне від послідовності ДНК переважне позиціювання нуклео-

сом (розділ 4) призводить до диференційного експонування ділянок

ДНК до дії регуляторних факторів. З одного боку, будь-яка послідов-

ність пар основ диктує певний “передустановлений” розподіл нукле-

осом. З іншого боку, активація промоторів призводить до їхнього

збіднення на нуклеосоми або за рахунок репозиціювання, або вна-

слідок тимчасового видалення гістонів.

Рисунок 6.15 ілюструє детально досліджений приклад: присутність

нуклеосом у промоторі дріжджового гена PHO5, вивчену Корнбергом

зі співавторами (Roger D. Kornberg).

Регуляторні

елементи

ТАТА-

окс

0,32 0,18

0,60

Рис. 6.15. Позиції нуклеосом (овали) у промоторі гена РНО5

дріжджів Saccharomyces cerevisiae та рівень їхньої присутності після активації

(числа – частка часу, коли нуклеосома присутня)

У неактивному стані промотор містить 3 нуклеосоми у специфічних

позиціях, у межах однієї знаходиться ТАТА-бокс, іншої – специфічна

регуляторна послідовність. При активації промотора (цьому передує

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

178

гіперацетилювання гістонів) спостерігається втрата нуклеосом в усіх

трьох сайтах, але ця втрата не є повною в жодному з них. У серед -

ньому втрачається 1,9 нуклеосоми з трьох; кожна з нуклеосом від

0,18 до 0,6 (специфічно для певної нуклеосоми) частини часу зберіга-

ється в активному промоторі. Це означає, що при активації здійсню-

ється певна рівновага між видаленням та реформуванням нуклеосом.

Тимчасове видалення нуклеосом з активних промоторів є загаль-

ним правилом. Тотальний аналіз розподілу нуклеосом по ділянках

усього геному дріжджів указує, що він є нерівномірним: 1) у міжген-

них зонах щільність нуклеосом зменшена порівняно з відкритими рам-

ками зчитування; 2) регуляторні області, зокрема промотори, містять

менше нуклеосом, ніж інші міжгенні зони; 3) існує зворотна кореляція

між щільністю нуклеосом у промоторах і рівнем транскрипційної ак-

тивності відповідних генів.

Комплекси ремоделювання хроматину

Підвищення доступності промоторів за їхньої активації потребує спе-

ціальних механізмів. Адже за фізіологічної іонної сили електростатичні

взаємодії ДНК і гістонів є дуже міцними, і нуклеосома зберігає високу

стабільність. Ця стабільність практично виключає навіть переміщення

нуклеосоми вздовж ДНК (слайдинг): таке переміщення потребує появи

високоенергетичних інтермедіатів із частковим порушенням взаємодії

гістонів із ДНК. Оскільки переміщення нуклеосом є необхідним для екс-

понування регуляторних сайтів на ДНК до дії транскрипційних факто-

рів, у клітині існує спеціальна система, що сприяє репозиціюванню нук-

леосом за рахунок індукування проміжних структурних станів: АТР-

залежні комплекси ремоделювання хроматину.

На сьогодні описано велику кількість таких комплексів у дріжджів,

комах і ссавців. Усі комплекси ремоделювання (КР) – мультибілкові ком-

плекси досить великої молекулярної ваги – містять у своєму складі суб-

одиницю, що має АТРазну активність. Власне АТРазний домен є дуже

подібним для усіх комплексів і має високу гомологію з ДНК-геліказами.

Залежно від наявності додаткових структурних доменів різного типу

в складі каталітичної субодиниці, КР поділяють на три основні групи:

Swi/Snf (Switch/Sucrose non-fermenting – назва походить від

першого описаного КР цієї родини, який було відкрито як групу му -

тацій дріжджів з певними біохімічними проявами) – комплекси скла-

даються з 10–15 субодиниць, каталітична субодиниця містить бромо-

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

179

домен, під час дії комплексу спостерігаються різноманітні проміжні

структурні форми нуклеосом.

ISWI (Imitation SWItch) – 4–5 субодиниць, індукують слайдинг

нуклеосом без масштабних змін їхньої структури;

CHD (Chromodomain Helicase DNA binding) – містять хромодомен

і гістон-деацетилазу, тісно пов’язані з перебудовами хроматину

в репресованих ділянках.

Крім того, є низка комплексів, що не вкладаються в цю класифі-

кацію. КР здатні здійснювати численні взаємодії з нуклеосомною

ДНК, гістоновими хвостами, специфічними та загальними факто-

рами транскрипції, гістон-ацетилтрансферазами тощо. При взає-

модії з нуклеосомою КР і нуклеосома чітко орієнтуються відносно

одне одного: КР родини Swi/Snf оточують нуклеосому, зв'язуючи її

всередині глибокої порожнини.

Основний результат активності всіх комплексів ремоделювання –

репозиціювання нуклеосом. Крім того, комплекси родини Swi/Snf мо-

жуть індукувати перенесення октамеру гістонів з однієї ділянки ДНК

на іншу або з ДНК на проміжні акцептори гістонів (див. розділ 4).

Механізм дії комплексів ремоделювання базується на гомології

з ДНК-геліказами. Незважаючи на це, АТРазна субодиниця КР не здат-

на діяти як геліказа – розводити два ланцюги. Подібно до геліказ, ком-

плекси ремоделювання, використовуючи енергію гідролізу АТР, пере-

суваються вздовж ДНК, але без її руйнування. Така транслокація має

бути пов’язана з одночасним обертанням ферменту навколо подвійної

спіралі або навпаки – прокручуванням спіралі через фермент. Оскіль-

ки КР при цьому зафіксований на нуклеосомі, тобто взаємне обер-

тання комплексу й нуклеосоми є неможливим, рух комплексу в бік від

нуклеосоми буде генерувати торсійну напругу (зміну твіста), штовха-

ючи додаткові витки подвійної спіралі всередину нуклеосомної ДНК –

ДНК прокручується через КР (рис. 6.16). Такий сценарій роботи ком-

плексів ремоделювання розглядається сьогодні як найбільш імовірний .

Напруга, яка створюється за рахунок транслокації комплексу

ремоделювання, може трансформуватися в зміну твіста в межах

кінцевої ділянки нуклеосомної ДНК. Локальна зміна твіста дифун-

дує всередину нуклеосоми, результатом чого є прокручування по-

двійної спіралі по поверхні октамеру гістонів, тобто зміна його по-

зиції (рис. 6.17). При такому механізмі переміщення шляхом твіс-

тингу (twisting) не повинно спостерігатися великих змін у структурі

нуклеосоми під час її пересування. Саме це й характерно для ком-

плексів ремоделювання типу ISWI.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

180

Нуклеосома

Комплекс

ремоделювання

Рис. 6.16. Модель дії комплексу ремоделювання

шляхом створення торсійної напруги в ДНК,

яка входить у нуклеосому

Комплекси ремоделювання родини Swi/Snf здатні генерувати про-

міжні стани нуклеосоми, в яких ДНК є більш доступною для нуклеаз,

за рахунок формування петлі ДНК на поверхні октамеру гістонів.

Отже, на відміну від попереднього механізму, для комплексів Swi/Snf

напруга, що є результатом транслокації, викликає випетлювання

(bulging) нуклеосомної ДНК. Така петля, імовірно, формується на кін-

цевій ділянці ДНК у нуклеосомі й далі пересувається по поверхні ок-

тамеру, що приводить знову до зміни позиції нуклеосоми (рис. 6.17).

Проміжні метастабільні стани нуклеосоми з випетлюванням ДНК

можуть відігравати важливу функціональну роль самі по собі, оскіль-

ки вже можуть забезпечувати зростання доступності нуклеосомної

ДНК: експонування петлі створює умови для її “захоплення” транс-

крипційними факторами. Крім того, значна дестабілізація ДНК-

гістонових взаємодій у проміжному стані з випетлюванням значно

підвищує імовірність руйнування нуклеосоми: у присутності Swi / Snf

продемонстровано перенесення гістонів на іншу ділянку ДНК або на

проміжні переносники гістонів.

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

181

Твістинг

Випетлювання

Рис. 6.17. Два механізми зміни трансляційної позиції нуклеосоми

в результаті активності комплексів ремоделювання

Обидва описані механізми дії комплексів ремоделювання розпочи-

наються з ділянки ДНК на вході до нуклеосоми. Відповідно, ця ділян-

ка має бути вільною від гістону Н1: Н1 і КР конкурують між собою за

зону входу / виходу нуклеосомної ДНК.

Шляхи рекрутування комплексів ремоделювання до промоторів.

Насправді функціональні наслідки ремоделювання хроматину певним

комплексом можуть бути різноманітними. Серед відомих нині компле-

ксів ремоделювання лише один – NuRD (Nucleosome R

emodeling and

Deacetylation), представник родини CHD – працює виключно як кореп-

ресор. Дія інших комплексів ремоделювання призводить або до репре-

сії, або до активації – залежно від контексту інших функціонально ва-

жливих впливів, у кооперації з якими працює даний комплекс.

У разі активації система АТР-залежного ремоделювання хроматину

завжди працює кооперативно із системою ацетилювання гістонів. Реа-

лізуються різноманітні стратегії рекрутування КР до промоторів:

• За рахунок взаємодії КР з транскрипційними факторами.

Активація ініціюється ТФ, який упізнає невеликий сайт

зв'язування на ДНК (навіть на поверхні нуклеосоми) і без-

посередньо рекрутує комплекс ремоделювання, або КР рекру-

тується пізніше на стадії збирання енхансосоми іншими ТФ.

Після цього, як правило, до енхансосоми рекрутується гіс-

тон-ацетилтрансферазний комплекс.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

182

• За рахунок упізнання ацетильованих Lys бромодоменом,

що входить до складу КР. Один із прикладів, який поєднує

цей і попередній шляхи рекрутування КР, зображено на

рис. 6.18: невеликий транскрипційний фактор зв'язується

у промоторі й рекрутує гістон-кіназу; кіназа здійснює фос-

форилювання Ser-10 гістону Н3 та дисоціює; фосфорильо-

ваний Ser-10 і транскрипційний фактор упізнаються гіс-

тон-ацетилтрансферазою, відбувається ацетилювання лізи-

нів; ацетильовані Lys та ТФ рекрутують SWI/SNF (комплекс,

що належить до родини Swi/Snf), який, здійснюючи репо-

зиціювання нуклеосоми, звільняє ТАТА-бокс; відбувається

зв'язування TFIID і збирання преініціаторного комплексу.

Інший приклад див. на рис. 6.19.

P Ac

кіназа

ТФ

нуклеосоми

HAT

SWI

SNF

HAT

TFIID

PIC

Рис. 6.18. Послідовність подій при активації

дріжджового промотора INO1

• За рахунок взаємодії з білками ядерного матриксу (див. розділ 4),

які можуть рекрутувати комплекс ремоделювання до осно-

ви хроматинової петлі – до ділянок, асоційованих з матрик-

сом (MAR). Така ділянка часто використовується як своєрідн і

“вхідні ворота” для факторів, що забезпечують регуляцію ак-

тивності в межах петлі, де міститься один або кілька генів.