Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

193

Метилювання ДНК

Субстратом метилювання ДНК є цитозини (метильна група приєд-

нується до п'ятого атому кільця з утворенням 5mC – 5-метилцитозину)

у складі динуклеотидів CpG (рис. 6.27). Узагалі, у 70–80 % динуклео-

тидних контактів CpG обидва цитозини є метильованими в еукаріо-

тичному геномі. Зони, де підтримується деметильований стан CpG

(CpG-острівці, див. розділ 4), часто розташовані в промоторах генів

домашнього господарства – таких, що є активними незалежно від

спеціалізації клітин.

Патерн тканиноспецифічного метилювання ДНК є результатом

двох процесів: підтримання метильованого статусу після реплікації та

метилювання de novo.

Підтримуюча ДНК-метилтрансфераза (DNA methyltransferase,

Dnmt) спрацьовує протягом 1–2 хвилини після реплікації: дві дочірні

молекули ДНК містять батьківській ланцюг ДНК (з 5mС у складі CpG)

і синтезований ланцюг, де С не є метильованим. Dnmt упізнає такі

напівметильовані динуклеотидні контакти й відновлює симетрію що-

до метилювання С. За рахунок цього процесу патерн метилювання

відтворюється в дочірніх клітинах, що є, поряд з відновленням моди-

фікацій гістонів, одним із важливих механізмів епігенетичного спад-

кування.

pCpG

GpCp

Рис. 6.27. Динуклеотид CpG у ДНК –

субстрат метилювання

Інші ДНК-метилтрансферази здійснюють метилювання ДНК de novo.

Особливо важливим цей процес є на ранніх стадіях ембріонального

розвитку, коли ДНК є тотально деметильованою. У процесі диференці-

ації здійснюється масове метилювання ДНК, що визначає специфічне

вимикання певних груп генів у спеціалізованих клітинах. Крім того,

деметилювання є можливим і в диференційованих клітинах, де Dnmt

використовуються для відновлення метильованого статусу.

Отже, метилювання ДНК є ознакою репресованих і гетерохромати-

нових ділянок. Залучення 5mС до репресії пов'язане з наявністю

у складі певних білків особливих структурних модулів – MBD (Methyl

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

194

Binding Domain), які мають специфічну спорідненість до метильова-

них динуклеотидів CpG. Білки, що містять MBD, є компонентами різ-

номанітних репресуючих комплексів. Зокрема, такі білки рекрутують

до метильованих ділянок хроматину гістон-деацетилази. З іншого боку,

деацетильований стан гістонових хвостів блокує деметилюючі актив-

ності, і навпаки – ацетилювання хвостів може викликати деметилю-

вання ДНК у активних ділянках.

Аналогічно, білки, що містять MBD, рекрутують гістон-метилтранс-

феразу, яка здійснює метилювання Lys9 гістону Н3, що призводить до

репресії (рис. 6.25, 6.26). І навпаки: Me-Lys9 упізнається білком, що міс-

тить хромодомен і рекрутує ДНК-метилтрансферазу.

Хоча Me-Lys9 та 5mС є загальними маркерами конститутивно реп-

ресованих ділянок хроматину, не завжди репресія та додаткова ком-

пактизація залежить від НР1 – реалізуються також інші системи, біль-

шість з яких є ще не достатньо вивченими. Прикладом такої системи

є інактивація однієї з Х-хромосом у клітинах самок ссавців. У

складі

Х-хромосоми, яка буде інактивованою (обирається випадково на

ранніх стадіях розвитку), спрацьовує ген Xist, що продукує велику

некодуючу молекулу РНК. Ці РНК укривають собою хромосому

і взаємодіють з деякими білками, серед яких – варіант гістону Н2А

macroH2A. Імовірно, macroH2A рекрутує гістон-метилтрансферазу

(здійснюється метилювання Lys9 гістону Н3) і гістон-деацетилазу.

Метилювання Lys9, у свою чергу, зумовлює метилювання ДНК (що за-

безпечує епігенетичну спадковість). Крім того, до Х-хромосоми рекру-

туються структурні компактизуючі білки (але не НР1).

РНК-інтерференція

Гетерохроматин утворюється передусім на послідовностях ДНК,

що повторюються. Причому має значення не послідовність як така,

а саме наявність повторів. Виявляється, що у формуванні та під-

триманні гетерохроматинового стану повторів (принаймні в центро-

мерах) важливу роль відіграє процес так званої РНК-інтерференції

(RNAi – RNA interference).

Узагалі процес РНК-інтерференції запускається будь-якою дволан-

цюговою РНК (dsRNA – double stranded RNA). Дволанцюгова РНК стає

субстратом для РНКази, яка отримала назву дайсер (Dicer) (рис. 6.28):

дайсер розрізає молекулу на дволанцюгові фрагменти довжиною

19–21 пари основ (по два нуклеотиди залишаються неспареними на

кінцях). Ці фрагменти позначають як siRNA (short interfering RNA),

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

195

вони можуть бути ампліфіковані РНК-залежною РНК-полімеразою

(RdRP – RNA d

epended RNA Polymerase). Вони зв'язуються з кількома

білками, утворюючи комплекс RISC (RNA Induced Silencing Complex).

Один із білків має РНК-геліказну активність і розводить два ланцюги

siRNA. Один із ланцюгів здійснює комплементарне спарювання з ді-

лянкою мРНК, що синтезується у процесі транскрипції (вихідна

dsRNA має збігатися за послідовністю з кодуючою частиною даного

гена), спрямовуючи туди RISC. Один із компонентів комплексу –

РНКаза Slicer – здійснює деградацію транскрипту. Крім того, RISC

може індукувати активність RdRP для синтезу комплементарного ла-

нцюга РНК на мРНК (чи її частині) як матриці. Відновлена дволанцю-

гова РНК буде знов підтримувати інактивацію гена шляхом інтерфе-

ренції. Отже, хоча транскрипція відбувається, реалізується посттран-

скрипційне вимкнення гена (PTGS – posttranscriptional gene silencing).

RISC

RdRP

mRNA

dsRNA

siRNA

Dicer

RdRP

Рис. 6.28. Посттранскрипційне вимикання гена

завдяки РНК-інтерференції

РНК-інтерференція широко використовується останнім часом як до-

слідницький інструмент (за схемою на рис. 6.28): достатньо ввести в клі-

тину синтетичну дволанцюгову РНК, послідовність якої ідентична послі-

довності певного гена, щоб запустити процес інтерференції, вимкнути

ген і, таким чином, з'ясувати його функцію. Процес РНК-інтерференції

розглядається також як перспективний метод лікування певних хвороб.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

196

У клітині РНК-інтерференція є однією із систем негативної регуля-

ції експресії генів через використання так званих мікро-РНК (miRNA).

Активація генів мікро-РНК (у геномі людини такі гени, які транскри-

буються РНК-полімеразою ІІ, присутні в досить великій кількості, яку

остаточно не встановлено) призводить до синтезу молекул РНК, що

містять дволанцюгові шпильки. Ці шпильки (довжиною 25–35 пар ос-

нов) вирізаються нуклеазою і стають субстратом для дайсера. Резуль-

туюча дволанцюгова мікро-РНК є аналогом siRNA: один з її ланцюгів

є комплементарним ділянці мРНК певного білкового гена, молекула

мікро-РНК зв'язується з білками RISC і спрямовує їх до мРНК-мішені.

Результатом взаємодії з мРНК може бути її посттранскрипційна де-

градація (більш характерно для рослин), зупинка білкового синтезу

(що є більш характерним для тварин – у цьому разі взаємодія з мРНК

відбувається в цитоплазмі), а також рекрутування до хроматину гіс-

тон-метилтрансфераз із наступною репресією даного гена. Дещо по-

дібне відбувається і в гетерохроматині.

RISC

HMT

dsRNA

Повтори ДН

Рис. 6.29. РНК-інтерференція як механізм підтримання

гетерохроматинового стану послідовностей ДНК, що повторюються

Участь РНК-інтерференції в підтриманні герехроматинового стану

центромер ілюструє рис. 6.29. При порушенні компактизації на

центромерних повторах може відбуватися спонтанна транскрипція

в різних напрямках. Оскільки матрицею є повтори, існує висока ймо-

вірність синтезу комплементарних молекул РНК: утвориться дволан-

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

197

цюгова РНК, яка запустить процес інтерференції. Крім деградації

транскриптів, інтерференція має інший наслідок: RISC, який опиня-

ється в зоні повторів, рекрутує до хроматину гістонметилтрансфера-

зу, що здійснює метилювання Lys9 гістону Н3. За вже відомою схе-

мою (рис. 6.25, 6.26) відбувається зв'язування НР1 і компактизація

гетерохроматину.

КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ

1. Порівняйте структуру РНК-полімерази ІІ з такою бактеріальної

полімерази. Що є спільного між ними та чим вони відрізняються?

2. Яку будову й функціональне значення має С-кінцевий домен

(CTD) РНК-полімерази ІІ?

3. Яку будову має промотор РНК-полімерази ІІ?

4. Охарактеризуйте базальні фактори транскрипції РНК-

полімерази ІІ та основні етапи ініціації транскрипції.

5. Яке значення має білок ТВР? Яку роль відіграють фактори TFIIB

та TFIIН у ініціації транскрипції РНК-полімеразою ІІ?

6. Що таке медіатор? Яку роль він відіграє?

7. Яку спеціалізацію мають еукаріотичні РНК-полімерази різних

типів? Порівняйте системи ініціації транскрипції РНК-полімераз І та ІІІ.

Що спільного між ними та системою ініціації РНК-полімерази ІІ?

8. Що таке енхансосома? Поясніть принципи модульності та коопе-

ративності при взаємодії факторів транскрипції з еукаріотичними

промоторами?

9. Що таке гормоновий рецептор? Дайте визначення сигнальної

трансдукції?

10. Яка посттрансляційна модифікація гістонів позитивно коре-

лює з транскрипційною активністю? У чому полягають механізми

такої кореляції?

11. Охарактеризуйте комплекси ремоделювання хроматину? Яким

є головний результат їхні дії. У чому полягають механізми такої дії?

12. Яку роль відіграють білки HMG в активації транскрипції?

13. За якими механізмами здійснюється елонгація РНК-полімерази

через нуклеосоми?

14. Опишіть функціональну роль білка НР1 у підтриманні гетеро-

хроматинового стану центромер.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

198

15. Яку роль відіграє метилування ДНК у репресії транскрипції?

Що називається CpG-острівцями?

16. Що таке РНК-інтерференція? Яку роль вона відіграє в підтри-

манні гетерохроматинового стану?

17. Дайте визначення мікро-РНК і опишіть їхню роль у регуляції

транскрипції?

РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА

Agresti, A., Bianchi, M.E. HMGB proteins and gene expression // Curr.

Op. Gen. Dev. – 2003. – Vol. 13. – P. 170–178.

Becker, P.B., Hörz, W. ATP-dependent nucleosome remodeling

// Annu. Rev. Biochem. – 2002. – Vol. 71. – P. 247–273.

Bernstein, B.E., Liu, C.L., Humphrey, E.L. et al. Global nucleosome occu-

pancy in yeast // Genome Biol. – 2004. – Vol. 5, № 9. – Р. R62

(http://genomebiology.com/ 2004/5/9/R62).

Boeger, H., Bushnell, D.A., Davis, R. et al. Structural basis of eukaryotic

gene transcription // FEBS Letters. – 2005. – Vol. 579. – P. 899–903.

Chromatin structure and gene expression: frontiers in molecular biology

/ ed. S. Elgin, J.L. Workman. – Oxford : Oxford University Press, 2002.

Chromatin structure and dynamics: state-of-the-art. // New Compre-

hensive Biochemistry / ed. J. Zlatanova, S.H. Leuba. – Amsterdam : Elsev-

ier, 2004. – Vol. 39.

Geiduschek, E.P., Kassavetis, G.A. The RNA polymerase III transcrip-

tion apparatus // J. Mol. Biol. – 2001. – Vol. 310. – P. 1–26.

Hahn, S. Structure and mechanism of the RNA polymerase II transcription

mashinery // Nature Sruct. Mol. Biol. – 2004. – Vol. 11. – P. 394–403.

Heintzman, N.D., Ren, B. The gateway to transcription: identifying,

characterizing and understanding promoters in the eukaryotic genome

// Cell. Mol. Life Sci. – 2007. – Vol. 64. – P. 386–400.

Krauss, G. Biochemistry of signal transduction and regulation.

– Weinheim : WILEI-VCH Verlag, 2003.

Längst, G., Becker, P.B. Nucleosome remodeling: one mechanism, many

phenomena? // Biochim. Biophys. Acta. – 2004. – Vol. 1677. – P. 58–63.

Maison, C., Almouzni, G. HP1 and the dynamics of heterochromatin

maintenance // Nature Rev. – 2004. – Vol. 5. – P. 296–304.

Matzke, M.A., Birchler, J.A. RNAi-mediated pathways in the nucleus

// Nature Rev. – 2004. – Vol. 6. – P. 24–35.

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

199

Orphanides, G., Reinberg, D. A unified theory of gene expression // Cell.

– 2002. – Vol. 108. – P. 439–451.

Russell, J., Zomerdijk, J.C. The RNA polymerase I transcription ma-

chinery // Biochem. Soc. Symp. – 2006. – Vol. 73, P. 203–216.

Richards, E.J., Elgin, S.C.R. Epigenetic codes for heterochromatin for-

mation and silencing: rounding up the usual suspects // Cell. – 2002.

– Vol. 108. – P. 489–500.

Sims, R.J., Belotserkovskaya, R., Reinberg, D. Elongation by RNA

polymerase II: the short and long of it // Genes Dev. – 2004. – Vol. 18.

– P. 2437–2468.

Simpson, R.T. Nucleosome positioning: occurrence, mechanisms, and

functional consequences // Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. – 1991. – Vol. 40.

– P. 143–184.

Strahl, D.D., Allis, C.D. The language of covalent histone modifications

// Nature. – 2000. – Vol. 403. – Р. 41–45.

Studitsky, V.M., Walter, W., Kireeva, M. et al. Chromatin remodeling by RNA

polymerases // Trends Biochem. Sci. – 2004. – Vol. 29. – P. 127–135.

Розділ 7

ПРОЦЕСИНГ ЕУКАРІОТИЧНИХ мРНК

Ёжик сел на чью-то узкую

скользкую спину и через минуту

оказался на берегу.

С. Козлов. Ёжик в тумане

Безпосереднім продуктом еукаріотичної РНК-полімерази ІІ є на-

справді пре-мРНК – попередник функціональної мРНК. Пре-мРНК не

може бути використана як матриця для білкового синтезу – принайм-

ні тому, що вона містить у своєму складі інтрони. Дозрівання пре-

мРНК з утворенням функціональної матриці називають процесингом

(processing). Він складається з трьох операцій:

• Кепування – модифікація 5'-кінця з утворенням так званого

кепу (cap).

• Сплайсинг (splicing) – вирізання інтронів і зшивання екзонів

– процес, у результаті якого мРНК стає копією лише кодую-

чої частини гена або її фрагментів: сплайсинг часто може

відбуватися кількома альтернативними шляхами (альтерна-

тивний сплайсинг).

• Поліаденілування – приєднання до 3'-кінця polyА послідовно-

сті, яке тісно пов'язане з термінацією транскрипції.

Усі операції процесингу відбуваються під час транскрипції на

РНК-полімеразному комплексі

, тобто процесинг є невід'ємною час-

тиною транскрипції. Місцем збирання машинерії процесингу служить

С-кінцевий домен (CTD) РНК-полімерази ІІ, який відходить від полі-

мерази поряд із каналом виходу РНК (розділ 6).

Кепування

Хімічну структуру кепу та процес його утворення показано на

рис. 7.1. У складі пре-мРНК до 5'-атома рибози першого нуклеозидт-

рифосфату, який був включений до ланцюга РНК, залишаються при-

єднаними три фосфатні залишки.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

202

Перша стадія кепування: відщеплення одного фосфату (γ-фосфату)

із 5'-кінця, що здійснюється фосфатазою.

Друга стадія: перенесення гуанозинмонофосфату (GMP) з гуанозин-

трифосфату (GTP) на два фосфатні залишки, що залишились на

5'-кінці (відповідний фермент – гуанілілтрансфераза). Результатом пе-

ренесення є утворення ковалентного зв'язку між 5'-фосфатом GMP та

5'-кінцевим β-фосфатом пре-мРНК, тобто формування нехарактерно-

го для нуклеїнових кислот зв'язку між нуклеотидами.

Третя стадія: метилювання метилтрансферазою кінцевого G з утво-

ренням 7-метилгуаніну (7mG).

OHO

P P P

5'5'

ppp

GTP

ppp

N7mG

Кеп

5'-кінець

пре-мРНК

Рис. 7.1. Стадії утворення та хімічна структура кепу

Три ферментативні активності, які здійснюють кепування, міс-

тяться в трьох (дріжджі) або двох (ссавці) білках. Ці ферменти рекру-

туються на CTD і 5'-кінець пре-мРНК після синтезу перших 20–30 нук-

леотидів транскрипту (рис. 7.2).

Функціонування CTD як платформи для збирання машинерії про-

цесингу мРНК залежить від патерна фосфорилювання залишків Ser,

які входять до складу гептапептиду, що повторюється (розділ 6).

Наприкінці ініціації транскрипції за рахунок кіназної активності

TFIIH здійснюється масоване фосфорилювання Ser5 у складі повто-

Розділ 7. Процесинг еукаріотичних МРНК

203

рів, що приводить до втрати зв'язку CTD із базальними факторами

транскрипції та початку руху полімерази.

Під час руху, що почався, за рахунок спорідненості до фосфори-

льованого Ser5 із CTD зв'язується білковий фактор DSIF (DRB-S

ensi-

tivity Inducing Factor, DRB – синтетичний інгібітор транскрипції,

що спрацьовує тільки за наявності фактора), який рекрутує NELF

(Negative EL

ongation Factor). Цей останній складається з п'яти суб-

одиниць, взаємодіє з DSIF, РНК і РНК-полімеразою, зумовлюючи

зупинку руху полімерази.

CTD

NELF

DSIF

Ser2

P-TEFb

РНК

Ферменти

кепування

Ser5

RNAP

CBC

Рис. 7.2. Механізм утворення кепу

в координації з транскрипцією

Під час цієї паузи (перший “кадр” на рис. 7.2) із CTD, РНК і DSIF

зв'язуються ферменти кепування. Вони спрацьовують і рекрутують

P-TEFb (Positive T

ranscription Elongation Factor b) – гетеродимер, одна

із субодиниць якого має кіназну активність: відбувається фосфори-

лювання Ser2 у складі CTD, а також фосфорилювання DSIF, що при-

водить до втрати спорідненості DSIF і, відповідно, дисоціації NELF.

РНК-полімераза продовжує рух, а сформований кеп відразу зв'язуєть-

ся з двома білками, що формують

СВС (Cap Binding Complex). Білки

СВС залишаються на кепі до моменту транспорту мРНК до цитоплазми,

де замінюються на цитоплазматичні фактори.