Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 8. Синтез білків

225

а можуть бути продуктами одного гена, розрізняючись модифікаці-

ями основ. Оскільки типів тРНК менше, ніж кодонів, одна тРНК

здатна впізнавати кілька синонімічних кодонів, що забезпечується

неоднозначністю спарювання між першою позицією антикодона

і третьою (за якою, головним чином, розрізняються синонімічні ко-

дони, див. розділ 4) – кодона. А саме, U і G здатні впізнавати по два

нуклеотиди у третій позиції кодона, I (який досить часто зустрічаєть-

ся в першій позиції антикодона) упізнає три нуклеотиди (табл. 8.1).

Таблиця 8.1. Відповідність між нуклеотидами

в першій позиції антикодона і третій позиції кодона

Антикодон Кодон

UA, G

GU, C

I U, C, A

Аміноацилювання тРНК

Порядок залучення амінокислот до поліпептидного ланцюга, що

утворюється при білковому синтезі, залежить лише від взаємодій між

нуклеїновими кислотами – кодоном і антикодоном; амінокислота, яку

несе тРНК, жодним чином не розпізнається рибосомою. Отже, акцеп-

тування певної амінокислоти молекулою тРНК відповідного типу

(і тільки відповідного) є одним із найважливіших моментів білкового

синтезу: від точності процесу акцептування буде залежати й точність

синтезу білка в цілому.

Процес приєднання амінокислот до тРНК каталізується аміноацил-

тРНК-синтетазами (АРСаза, aaRS – aminoa

cyl-tRNA-Synthetase). Кожна

з 20 типів (за кількістю амінокислот) цих ферментів каталізує дві хі-

мічні реакції (рис. 8.3):

• На першій стадії відбувається так зване активування аміно-

кислоти – її приєднання до АМР з утворенням аміноацил-

аденілату, коли пірофосфат (рр) у складі АТР замінюється на

амінокислоту (аа). Активування амінокислоти супроводжуєть-

ся зниженням вільної енергії, але при цьому значна частина

вільної енергії, що “звільняється” при відщеплені пірофосфату

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

226

від АТР, заощаджується у формі аміноациладенілату – молеку-

ли, гідроліз якої також супроводжується великим енергетич-

ним ефектом. Молекула АТР, що використовується на етапі

активування амінокислоти, – єдине джерело енергії для май-

бутнього синтезу пептидного зв'язку на рибосомі.

• Аміноациладенілат утворює проміжний комплекс з активним

центром ферменту й ефективно атакує ОН-групу рибози

3'-кінцевого аденозину тРНК (3'- або 2'-ОН групу залежно від

класу АРСази): відбувається перенесення амінокислоти на

тРНК. Після дисоціації від АРСази у складі аа-тРНК має місце

спонтанний обмін амінокислоти між двома ОН-групами рибо-

зи; при зв'язуванні з рибосомою амінокислота фіксується на

3'-ОН групі. Аа-тРНК – також “макроергічна” сполука: руйну-

вання зв'язку між амінокислотою та тРНК є енергетично вигід-

ним, що й забезпечує утворення пептидного зв'язку на рибосомі.

OHOH

OPO

OHOH

NCH

OOH

OHOH

1. aa + ATP

aa-AMP + pp

2. aa-AMP + tRNA

aa-tRNA + AMP

Рис. 8.3. Приєднання амінокислоти до тРНК,

яке каталізується АРСазою

Розділ 8. Синтез білків

227

Отже, АРСази не тільки залучають амінокислоти до білкового синтезу,

приєднуючи їх до тРНК, а й забезпечують заощадження вільної енергії,

необхідної для приєднання амінокислоти до поліпептидного ланцюга.

Двадцять типів АРСаз, між якими немає майже нічого спільного на

рівні первинної структури, можна поділити на два класи, по десять

у кожному (табл. 8.2). Це завжди мультидоменні білки зі складною

структурою (рис. 8.4), що зумовлено розмаїттям функцій – необхідністю

специфічно зв'язати три субстрати й каталізувати дві хімічні реакції.

Крім того, еукаріотичні АРСази різних типів взаємодіють між собою

та з мембраною ендоплазматичного ретикулуму, утворюючи так зва-

ну кодосому, що розташована поблизу від рибосом. Мультисубодини-

чні АРСази (гомодимери, гомотетрамери або гетеротетрамери) містять

два ідентичні набори активних центрів та сайтів зв'язування.

Таблиця 8.2. Порівняльна характеристика двох класів АРСаз

Клас 1 Клас 2

Кількість субодиниць 1 (іноді 2) 2 або 4

Спільний структурний мо-

тив, що оточує

активний центр

Укладка Россмана

Паралельний β-шар

із 7 β-ділянок

Амінокислоти,

що акцептуються

Leu, Ile, Val Cys, Met, Glu,

Gln, Arg, Tyr, Trp

His, Pro, Ser, Thr, Phe,

Asp, Asn, Lys, Gly, Ala

Група рибози,

що аміноацилюється

2'-ОН 3'-ОН

Центральна частина поліпептидного ланцюга АРСази формує акти-

вний центр (сайт зв'язування амінокислоти), в оточенні якого реалізу-

ється спільний для ферментів одного класу структурний мотив: для

першого класу – укладка Россмана (див. розділ 2), для другого – при-

близно плоский паралельний β-шар із семи β-ділянок (рис. 8.4).

Як видно з табл. 8.2, амінокислоти з подібними властивостями часто

є субстратами АРСаз різних класів залежно від розміру амінокислот:

великі потрапляють до першого класу, маленькі – до другого (напри-

клад, Tyr і Phe, Glu і Asp, Arg і Lys). Відповідно, активний центр

АРСаз першого класу розташований у порівняно неглибокій порож-

нині на поверхні ферменту, другого класу – у глибшому кармані.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

228

1 2

Рис. 8.4. Структури АРСаз першого (мономерна Glu-тРНК-синтетаза, 1G59)

та другого (Asp-тРНК-синтетаза, гомодимер, 1ASY) класів

Із частини молекули, яка утворює спільний структурний мотив,

випетльовуються інші структурні домени, які, разом із N або С-кін-

цевими доменами беруть участь у взаємодії з тРНК. АРСази двох кла-

сів упізнають різні елементи структури тРНК: маленький жолобок ак-

цепторного стебла, D-петля та антикодонова петля для першого класу;

великий жолобок акцепторного стебла, варіабельна та антикодонова

петлі для другого (рис. 8.5). Причому специфічність упізнання тРНК

залежить у першу чергу від взаємодій з акцепторним стеблом: штучна

акцепторна частина (міні-тРНК) здатна специфічно зв'язатися з АРСазою

та акцептувати амінокислоту.

1 2

Рис. 8.5. Комплекси тРНК

Glu

(1 клас, 1G59) і тРНК

Asp

(2 клас, 1ASY)

з відповідними АРСазами. З димерною АРСазою зв'язано дві молекули тРНК.

На даній проекції видно лише одну з них

Розділ 8. Синтез білків

229

Phe

Tyr

Val

Ala

Ile

Val-AMP

Ala-AMP

Ile-AMP

Val

Ala

Ile-тРНК

Ile

Рис. 8.6. Подвійне сито на прикладі Ile-тРНК-синтетази

Специфічність зв'язування АРСазою такого великого ліганду, як

тРНК, не становить значної проблеми: велика кількість контактів дозво-

ляє досить легко дискримінувати різні типи тРНК за рахунок різниці

у вільній енергії зв'язування. Амінокислоти, навпаки, є маленькими лі-

гандами (до того ж іноді з дуже схожою структурою), з яким неможливо

реалізувати велику кількість взаємодій. Тим не менш, середня частота

помилок при аміноацилюванні тРНК становить приблизно 10

–6

– такий

рівень точності неможливо досягти просто за рахунок різниці у вільній

енергії зв'язування, яка не може сильно відрізнятися для різних аміно-

кислот. Відповідно, АРСази використовують певну систему корекції по-

милок за механізмом так званого подвійного сита. Наприклад, активний

центр Ile-тРНК-синтетази (рис. 8.6) здійснює первинне вибракування

частини амінокислот досить великого розміру на етапі зв'язуван-

ня / активування, інші амінокислоти (включаючи Ile) піддаються акти-

вуванню. На другому етапі всі аміноациладенілати, що містять більш

маленькі порівняно з Ile амінокислоти, гідролізуються в іншому актив-

ному центрі (центр редагування), а Ile переноситься на тРНК, оскільки

його розмір не дозволяє йому зв'язатися з центром редагування. У ре-

зультаті дуже близький до Ile за структурою Val акцептується тРНК

Ile

в одному випадку з 180 тис. Інші АРСази можуть здійснювати редагу-

вання помилок уже після акцептування амінокислоти, коли аа-тРНК

упізнається як ціле, і неспоріднена амінокислота відщеплюється.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

230

Рибосома

Склад рибосоми

Рибосома – рибонуклеопротеїдний комплекс, який складається

із двох субодиниць (рис. 8.7). Компоненти рибосоми прийнято позна-

чати коефіцієнтами седиментації – коефіцієнтами пропорційності,

що показують, наскільки зростає швидкість руху частинки при цен-

трифугуванні зі зростанням відцентрової сили (швидкості обертання

ротора центрифуги). Коефіцієнт седиментації використовується як

міра рухливості частинки, залежить від її маси, об'єму та форми, ви-

мірюється у сведбергах (S) – позастистемних одиницях, які мають

розмірність часу (1S = 10

–13

с).

Маленька субодиниця прокаріотичної рибосоми з коефіцієнтом се-

диментації 30S, містить одну молекулу рРНК (16S) і 21 молекулу рибо-

сомних білків, що позначаються як S1–S21 (від Small subunit). Велика

субодиниця містить дві молекули рРНК (23S і 5S) і білки L1–L36 (від

Large subunit) – цей комплекс седиментує з коефіцієнтом 50S. Об'єд-

нання субодиниць дає рибосому з коефіцієнтом седиментації 70S –

оскільки коефіцієнт седиментації залежить від форми частинки, він

не є адитивною величиною. Еукаріотична рибосома містить трохи біль-

шу 18S рРНК замість 16S, дві рРНК, що міцно взаємодіють між собою

(28S і 5,8S), замість 23S і більшу кількість білків. Структура обох ри-

босом і принципи їхньої роботи подібні.

Синтез еукаріотичних рРНК 18S, 5,8S і 28S здійснюється в ядерці,

яке формується на тандемних повторах кластера відповідних генів

рРНК (див. рис. 4.6). Первинний транскрипт, що синтезується РНК-полі-

меразою І, має константу седиментації 45S і містить три фрагменти

майбутніх рРНК, розділені спейсерами. Процесинг рРНК – деградація

спейсерів, а також модифікація певних основ і метилування 2'-ОН груп

специфічних рибоз – здійснюється за участю близько 150 типів малень-

ких ядерцевих РНК (snoRNA – small nucleolar RNA), які, аналогічно до

маленьких ядерних РНК, визначають специфічні сайти деградації та

модифікацій. Частина маленьких ядерцевих РНК синтезується на пев-

них генах РНК-полімеразами ІІ та ІІІ. Але велика кількість цих РНК є інт-

ронами, що визволяються в результаті сплайсингу мРНК білкових генів.

5S рРНК синтезується РНК-полімеразою ІІІ на окремих кластерах відпо-

відних генів поза ядерцем. В ядерці, практично одночасно з процесин-

Розділ 8. Синтез білків

231

гом рРНК відбувається її поступова взаємодія з рибосомними білками,

до ядерця ж дифундує комплекс 5S рРНК з білками: утворюються суб-

одиниці рибосоми, які далі транспортуються до цитоплазми.

23S

2900 н

120 н

L1…L36

16S

1540 н

S1…S21

28S • 5.8S

4800 н • 160 н

120 н

L1…L50

18S

1900 н

S1…S33

Прокаріоти Еукаріоти

рРН

білки

50S 30S

70S

60S 40S

80S

Рис. 8.7. Склад про- та еукаріотичної рибосом. рРНК позначено

їхніми коефіцієнтами седиментації та довжиною в нуклеотидах (н)

Первинний транскрипт, що синтезується на бактеріальному рибо-

сомному опероні, містить ділянки, які відповідають усім трьом про-

каріотичним рРНК, а також кілька майбутніх тРНК. Часткова дегра-

дація транскрипту приводить до утворення зрілих молекул, які взає-

модіють з рибосомними білками, формуючи дві субодиниці рибосоми.

In vivo остаточне збирання рибосоми із двох субодиниць, як у про-,

так і в еукаріотів, здійснюється при ініціації трансляції.

Структура рибосоми

Структуру рибосоми за результатами рентгеноструктурного аналізу

її кристалів показано в різних проекціях на рис. 8.8–8.10, де також

схематично зображено зовнішню анатомію субодиниць та їхнє роз-

ташування у складі рибосоми відносно одна одної та деяких інших

елементів системи трансляції.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

232

Центральний

протуберанець

Сайт

зв'язування

G-білків

Платформа

Головка

мРН

Сайти зв'язування

РН

L7/12

23S

16S

50S

30S

70S

Рис. 8.8. Структура рибосоми Thermus thermophilus та її субодиниць (1GIX, 1GIY),

показано лише основні ланцюги РНК і білків (білки пофарбовано зеленим).

Окремі субодиниці орієнтовані інтерфейсами взаємодії між ними до глядача,

у складі рибосоми орієнтація великої субодиниці збережена. Білою стрілкою

позначено напрям зору, в якому структуру зображено на рис. 8.9.

Унизу: схематичне зображення структур субодиниць та їхнього комплексу

в тих самих проекціях, РТ – пептидилтрансферазний центр

Від основного досить монолітного тіла великої субодиниці відхо-

дять три характерні відростки: виріст L1, палець (стебло) L7/12,

сформовані відповідними рибосомними білками, і центральний

протуберанець, утворений комплексом певних білків з рРНК 5S.

Два окремі структурні домени – головка та платформа – відходять

від тіла маленької субодиниці.

У складі рибосоми можна виділити три основні зони контактів між

субодиницями: головка – центральний протуберанець; платформа – ви-

ріст L1; центральні частини основного тіла обох субодиниць. Усі струк-

турні елементи рухливі: можливим є переміщення головки й пальця

L7/12, обертання малої субодиниці навкруг нормалі до поверхні ве-

ликої субодиниці на ~6° проти годинникової стрілки тощо. Рухи струк-

Розділ 8. Синтез білків

233

турних елементів рибосоми в зонах контактів мають важливе зна-

чення для її функціонування , оскільки саме на інтерфейсі між суб-

одиницями знаходяться всі активні центри та сайти взаємодії з еле-

ментами системи трансляції:

Центральний

протуберанець

Платформа

Головка

мРН

аа-тРН

L7/12

РН

Тунель

РТ

Рис. 8.9. Структура рибосоми та її субодиниць у комплексі

з трьома молекулами тРНК з рис. 8.8 у іншій проекції – з боку входу аа-тРНК

до А-сайта. Білою стрілкою позначено напрям зору, у якому структуру

зображено на рис. 8.10. Унизу: схематичне зображення у тій самій проекції,

крайня права схема – велика субодиниця в розрізі

• В основі центрального протуберанця розташований пепти-

дилтрансферазний центр (рис. 8.8, 8.9), який відповідає

за каталіз реакції синтезу пептидного зв'язку. Від пептидил-

трансферазного центру через тіло великої субодиниці відхо-

дить тунель – канал виходу поліпептидного ланцюга, що си-

нтезується (рис. 8.9).

• В основі пальця L7/12 міститься сайт зв'язування G-білків

(рис. 8.8) – факторів трансляції, детальне описання яких

наведено нижче.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

234

• У щілині між платформою та головкою маленької субодиниці

відбувається взаємодія з мРНК (рис. 8.8, 8.9).

• Сайти зв'язування тРНК розташовані між двома субодиниця-

ми: антикодонові частини тРНК взаємодіють з мРНК і малень-

кою субодиницею, акцепторні частини – з великою субодини-

цею (рис. 8.9, 8.10). Рибосома містить три такі сайти:

А-сайт,

де відбувається зв'язування аа-тРНК;

Р-сайт, де з рибосомою вза-

ємодіє пептидил-тРНК (тРНК, до якої приєднаний пептидил –

ланцюг, що синтезується);

Е-сайт (від exit), де міститься деамі-

ноацильована тРНК перед її звільненням з рибосоми.

Акцепторні частини тРНК, розташовані в А- і Р-сайтах, наближе-

ні одна до одної (рис. 8.10, 8.11) і взаємодіють з великою субоди-

ницею в зоні пептидилтрансферазного центру. Кількість контактів

з тРНК у Р-сайті є більшою, ніж кількість контактів, що утримують

молекулу тРНК в А-сайті.

Рис. 8.10. Вид зверху (по стрілці на рис. 8.9)

на структуру рибосоми та її субодиниць

у комплексі з трьома молекулами тРНК