Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 8. Синтез білків

245

антикодонову частину аа-тРНК на кодоні мРНК. Оскільки субодиниці

рибосоми взаємодіють між собою, структурна перебудова маленької

субодиниці не залишається непомітною для великої: конформаційні

зміни відбуваються і тут. Одним із результатів перебудови є зміна

взаємодії між EF1 і відповідним сайтом його зв'язування в

основі сте-

бла L7/12, яка приводить до активації GTPази, – відбувається гідроліз

GTP, конформаційна перебудова EF1 із втратою спорідненості до ри-

босоми та тРНК і дисоціація фактора.

РН

кодон

16S

A1493

A1492

Рис. 8.19. Взаємодія в межах А-сайта на маленькій субодиниці

між кодоном, антикодоновою петлею тРНК і частиною рРНК 16S

у випадку неспорідненого (ліворуч, 1N36 – друга

кодон-антикодонова пара основ є некомплементарною)

і спорідненого (праворуч, 1IBM) антикодонів

Акомодація аа-тРНК завершує першу стадію елонгаційного циклу.

Перед гідролізом GTP розміщення аа-тРНК на рибосомі суттєво від-

різняється від “кінцевої точки” процесу зв'язування – локалізації

в А-сайті. Оскільки сайти зв'язування тРНК формуються двома суб-

одиницями (мають дві “половини”), “остаточний” А-сайт позначають

як А/А. У складі комплексу з EF1 антикодонова частина розміщена

в А-сайті на маленькій субодиниці, але акцепторна частина утриму-

ється в основі стебла L7/12 на великій – так зване А/Т положення

(рис. 8.20). При цьому антикодонове стебло суттєво вигинається – фік-

сація антикодона та акцепторного стебла підтримує напружену кон-

формацію тРНК. Після гідролізу GTP, коли EF1 дисоціює, один із фік-

саторів зникає – тРНК, ніби пружина, розпрямляється, її акцепторне

стебло автоматично опиняється в А-сайті на великій субодиниці –

у зоні пептидилтрансферазного центру. Ефективність цього процесу

акомодації (рис. 8.20) залежить від жорсткості фіксації антикодонової

петлі тРНК на маленькій субодиниці. Якщо взаємодія між кодоном

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

246

і антикодоном не є повністю комплементарною, аа-тРНК просто ди-

соціює від рибосоми – це друга (після первинного зв'язування) мож-

ливість виправити помилку впізнання кодона.

A/A

акомодація

Рис. 8.20. А/Т (1QZA) і А/А (1QZB) положення аа-тРНК

на рибосомі до й після акомодації відповідно

Загальний сценарій зв'язування аа-тРНК з рибосомою зобра-

жено на рис. 8.21.

• На першому етапі початкового відбору аа-тРНК відбуваєть-

ся швидка асоціація / дисоціація потрійних комплексів

EF1·GTP–аа-тРНК з відкритою формою рибосоми, яка фіксу-

ється за рахунок взаємодій з EF1. Відкрита форма сприяє та-

кож дисоціації деаміноацильованої тРНК з Е-сайта рибосоми

(не показано на рис. 8.21).

• При утворенні комплементарної кодон-антикодонової подвій-

ної спіралі, вона стабілізується за рахунок взаємодій з нук-

леотидами рРНК 16S. Локальна конформаційна зміна 16S,

яка є наслідком цих взаємодій, спрацьовує як тригер струк-

турної перебудови спочатку маленької, потім великої суб-

одиниць. Унаслідок перебудови антикодонова петля тРНК

жорстко замикається на маленькій субодиниці, акцепторне

стебло – на великій у основі пальця L7/12, і EF1 набуває

GTPазної активності.

• Гідроліз GTP розмикає ланцюг подій на дві частини, роблячи

його необоротним. Після гідролізу EF1·GDP дисоціює, зали-

шаючи аа-тРНК у напруженій конформації.

Розділ 8. Синтез білків

247

• Далі процес розгалужується: або, при недостатньо міцних

кодон-антикодонових взаємодіях, відбувається дисоціація

аа-тРНК, яка повертає систему до вихідного стану, або здійсню-

ється акомодація – релаксація напруженої аа-тРНК, яка виво-

дить її акцепторний кінець до пептидилтрансферазного центру.

GDP

3 4

Початкове

зв'язування

Впізнання

кодона

Структурна

зміна

рибосоми

Гідроліз

GTP

Акомодація

EF1

Рис. 8.21. Схема основних подій при зв'язуванні аа-тРНК

з А-сайтом рибосоми. Е-сайт тРНК не показано для спрощення

Загальним наслідком процесу зв'язування, таким чином, є повна під-

готовка системи трансляції до наступного етапу елонгаційного циклу.

Транспептидація

Реакція перенесення пептидилу – транспептидація – полягає в руй-

нуванні ковалентного зв'язку між карбоксильною групою С-кінцевої

амінокислоти пептидилу та 3'-кінцевою ОН-групою пептидил-тРНК

і утворенні натомість пептидного зв'язку між звільненою карбоксиль-

ною групою та аміногрупою амінокислоти у складі аа-тРНК. Таким

чином, при транспептидації пептидил переноситься з Р- до А-сайта

рибосоми: в А-сайті опиняється пептидил-тРНК із подовженим на од-

ну амінокислоту пептидилом, у Р-сайті залишається деаміноацильо-

вана тРНК (див. рис. 8.15).

Стандартна вільна енергія гідролізу зв'язку між пептидилом

і тРНК оцінюється приблизно в –7,5 ккал/моль, енергія гідролізу пеп-

тидного зв'язку –0,5 ккал/моль. Отже, загальний енергетичний ба -

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

248

ланс транспептидації ~ –7,0 ккал/моль: це спонтанний процес, який

не потребує джерел енергії – енергію було заощаджено при аміно-

ацилюванні тРНК (див. підрозділ, присвячений тРНК).

n+1

n-1

n+1

n-1

n+1

n-1

Рис. 8.22. Процес перенесення пептидилу з Р-сайта на аа-тРНК

в А-сайті через інтермедіатну сполуку, стабілізовану взаємодією

з аденозином (А синього кольору) рРНК 23S. Амінокислотні бокові залишки R

пронумеровані в порядку приєднання їх до поліпептидного ланцюга

Процес транспептидації, що відбувається безпосередньо після

акомодації аа-тРНК, є найшвидчим етапом елонгаційного циклу.

Каталіз реакції здійснюється пептидилтрансферазним центром ве-

ликої субодиниці рибосоми, розташованим в основі центрального

протуберанця (див. рис. 8.8) і формується пептидилтрансферазною

петлею рРНК 23S. У радіусі ~18 Å від субстратів реакції немає жод-

ної білкової хімічної групи, тобто

рибосома – це рибозим. Слід, проте,

ще раз зауважити, що вільна рРНК 23S не має каталітичної актив-

ності – активна конформація рРНК реалізується лише в комплексі

з певним мінімальним набором білків.

Розділ 8. Синтез білків

249

Реакція транспептидації проходить через утворення інтермедіатної

сполуки з формуванням зв'язку між N аміногрупи аа-тРНК і С, яким

пептидил приєднаний до тРНК, атом оксигену набуває при цьому не-

гативного заряду (рис. 8.22). Утворенню інтермедіату передує захоп-

лення протона аміногрупи атомом N3 аденіну, що знаходиться

в активному центрі. Легка іонізація N3 зумовлена його особливим мі-

крооточенням у складі рРНК 23S, протонований азот стабілізує нега-

тивно заряджений О. Далі протон переноситься на 3'-ОН групу пеп-

тидил-тРНК, яка, відповідно, стає деаміноацильованою – втрачає

зв'язок із С, замість якого остаточно формується пептидний зв'язок.

Механізм каталізу транспептидації є цілком аналогічним до тако-

го білкових ферментів (див. розділ 2): рибосома здійснює жорстке

взаємне орієнтування субстратів у активному центрі (і ця обстави-

на – ентропійний каталіз – є головним фактором прискорення реак-

ції транспептидації), а також завдяки створенню специфічного мік -

рооточення певної хімічної групи (аденіну) забезпечує стабілізацію

проміжного високоенергетичного стану.

Транслокація

Результатом транспептидації є значне перегрупування лігандів, зв'я-

заних з рибосомою: пептидил-тРНК опиняється в А-сайті, деаміноаци-

льована тРНК – у Р-сайті. Ураховуючи підвищену спорідненість акцеп-

торної частини пептидил-тРНК до Р-сайта, рибосома має спонтанно пе-

ресунутися вздовж мРНК у напрямку до її 3'-кінця, і таке пересування –

транслокація – має розпочатися з руху великої субодиниці (рис. 8.23).

На проміжній стадії виникають гібридні сайти А/Р і Р/Е – стани, коли

акцепторні частини тРНК уже знаходяться в Р (або Е) сайті на великій

субодиниці, але антикодонові частини – ще в А (або Р) сайті.

Зрозуміло, що рух субодиниць передбачає послаблення взаємодій

між ними – певний розблокований після транспептидації, відкритий

структурний стан рибосоми. Зрозуміло також, що послаблення взає-

модій між субодиницями є енергетично невигідним. Відповідно, хоча

транслокація є внутрішньою властивістю рибосоми і відбувається

спонтанно (вільна енергія знижується в кінцевому стані за рахунок

високої спорідненості пептидил-тРНК до Р-сайта), швидкість руху

є дуже повільною в позафакторній системі in vitro, оскільки процес

проходить через проміжний високоенергетичний стан. In vivo факто-

ром прискорення процесу є білок EF2 (інше позначення –

EF-G).

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

250

EPA

пептидил

РН

Велика

субодиниця

Маленька

субодиниця

Рис. 8.23. Схема транслокації рибосоми

через проміжну стадію гібридних сайтів

Частина молекули EF2 є гомологічною білку EF1 – також має сайт

зв'язування GTP/GDP і також взаємодіє з великою субодиницею ри-

босоми в основі пальця L7/12. Але у складі білка є ще один додатко-

вий домен, який мімікрує під структуру антикодонової частини тРНК, –

структура білка в цілому нагадує комплекс EF1–тРНК (рис. 8.24).

РН

EF1 EF2

Рис. 8.24. Поверхня комплексу EF1–тРНК

(структура з рис. 8.17) і білка EF2 (2EFG)

Фактор EF2 існує у принаймні чотирьох структурних станах зале-

жно від типу зв'язаного ліганду:

1) EF2·GTP поза рибосомою – має високу спорідненість до рибосоми;

2) EF2·GTP на рибосомі – активна GTPаза;

3) EF2·GDP·P

– після гідролізу GTP (P

– неорганічний фосфат);

4) EF2·GDP після дисоціації фосфату – має низьку спорідненість до

рибосоми.

Розділ 8. Синтез білків

251

Вільний від будь-якого ліганду білок не має впливу на транслока-

цію, однак у комплексі з будь-яким гуаніновим нуклеотидом (вклю-

чаючи також аналоги GTP, що не можуть бути гідролізовані) фактор

прискорює транслокацію за рахунок своєї спорідненості до проміж-

ного відкритого стану рибосоми. Проте у випадку гідролізу GTP (який

передує остаточній транслокації) швидкість переміщення рибосоми

підвищується ще в ~50 разів: найефективнішим “стабілізатором” від-

критого стану рибосоми виявляється форма EF2·GDP·P

Отже, сценарій транслокації можна уявити наступним чином

(рис. 8.25).

• Після транспептидації рибосома перебуває в рівновазі між

закритою та відкритою формою. Тільки друга форма здатна

до транслокації, але вона у той самий час є більш високоенер-

гетичною – рівновага зсунута в бік закритої форми.

• Взаємодія з EF2·GTP стабілізує відкриту форму рибосоми.

Швидко після зв'язування, за рахунок взаємодії з сайтом

G-білків у основі стебла L7/12, EF2 набуває GTPазної актив-

ності – відбувається гідроліз GTP і перехід EF2 у структурну

форму, що найефективніше сприяє розблокуванню рибосоми.

• У розблокованій формі рибосома рухається вздовж мРНК

(зв'язок мРНК з молекулами тРНК зберігається, тобто вона пе-

реміщується також відносно тРНК). Цей рух є броунівським

(одномірна дифузія під дією теплових флуктуацій), але спорід-

неність пептидил-тРНК до Р-сайта робить напрямок до

3'-кінця мРНК більш імовірним. Крім того, “тРНК-подібний”

структурний домен EF2 взаємодіє з маленькою субодиницею

в межах А-сайта, сприяючи витісненню звідти антикодонової

частини пептидил-тРНК.

• Одночасно з переміщенням, і незалежно від нього, відбува-

ється дисоціація неорганічного фосфату. EF2, який залиша-

ється в комплексі з GDP, втрачаючи спорідненість, дисоціює

від рибосоми, яка, у свою чергу, повертається до закритого

структурного стану.

У результаті система є готовою до наступного елонгаційного циклу :

новий кодон опинився в А-сайті, сам А-сайт є вільним від тРНК.

Деаміноацильована тРНК, яка в результаті транслокації опинилася

в Е-сайті рибосоми, може дисоціювати звідти відразу, або залишити-

ся до етапу зв'язування наступної аа-тРНК.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

252

4 GTP

4 GDP

GDP

Зв'язування

EF2

Гідроліз GTP,

розблокування

рибосоми

исоціація

фосфату, рух

рибосоми

исоціація EF2,

блокування

рибосоми

EF2

Рис. 8.25. Послідовність основних подій при транслокації рибосоми

Описані механізми функціонування рибосоми під час елонгаційно-

го циклу дозволяють стверджувати, що рибосома працює за принци-

пами молекулярної машини (див. розділ 2) – пристрою, який з висо-

кою швидкістю (у середньому 10–15 елонгаційних циклів за секунду)

і точністю (частота помилок ~10

–4

) здійснює білковий синтез. Під час

елонгаційного циклу рибосома осцилує між закритим структурним

станом, який забезпечує каталіз реакції нарощування амінокислотно-

го ланцюга, і відкритими станами, в яких здійснюється специфічний

відбір амінокислот згідно з генетичним кодом та переміщення рибо-

соми вздовж матриці. Перемикання конформацій залежить від взає-

модій з факторами елонгації, які фіксують проміжні відкриті стани

рибосоми, забезпечуючи прискорення перебудов. Гідроліз двох моле-

кул GTP під час елонгаційного циклу використовується для звільнення

факторів і повернення рибосоми до закритої жорсткої конформації.

Рушійною силою для переміщення рибосоми та її частин є хаотичний

тепловий рух, але молекулярна конструкція рибосоми, її взаємодії

з тРНК, матрицею та факторами елонгації, і зміни цих взаємодій уна-

Розділ 8. Синтез білків

253

слідок хімічних реакцій (транспептидація, гідроліз GTP) задають пев-

ну траєкторію рухів і каналізують їх у певних напрямах. Аналогічні

механізми використовуються й при ініціації та термінації трансляції.

Ініціація трансляції

Розпочинатися процес елонгації трансляції має зі стартового кодо-

на мРНК, і в першому елонгаційному циклі, коли немає пептидил-

тРНК у Р-сайті, якась стартова – ініціаторна – аа-тРНК має виконува-

ти цю роль. Отже, сутність ініціації полягає в:

1) упізнанні стартового кодону, який задає початок і рамку зчиту-

вання інформації;

2) збиранні рибосоми з двох субодиниць на мРНК у зоні стартового

кодону;

3) завантаженні ініціаторної аа-тРНК на стартовий кодон і водно-

час у Р-сайт рибосоми.

Стартовим кодоном виступає здебільшого метіоніновий кодон AUG,

відповідно, ініціаторною є завжди Met-тРНК

Met

(індекс “і” вказує на

те, що це – саме ініціаторна метіонінова тРНК, тобто вона відрізня-

ється за своєю структурою від звичайної тРНК

Met

, яка використову-

ється при елонгації). У прокаріотів, на відміну від еукаріотів, амі-

ногрупа метіоніну ініціаторної тРНК є формільованою (N-форміл-

метіонін, f-Met – рис. 8.26).

NCHC

HN CH C

Met f-Met

Рис. 8.26. Метіонін і N-формілметіонін

Механізми ініціації трансляції суттєво відрізняються у про- та еукарі-

отів. Еукаріотична мРНК після синтезу транспортується з ядра до цито-

плазми, де й відбувається ініціація. Кожна молекула мРНК містить тіль-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

254

ки одну рамку зчитування (один стартовий кодон), елементи системи

ініціації взаємодіють спочатку з кепом на 5'-кінці молекули, після чого

відбувається сканування матриці з метою пошуку стартового кодону –

ініціація відбувається за так званим скануючим механізмом.

Прокаріотична трансляція тісно узгоджена з транскрипцією

і відбувається під час синтезу мРНК (див. розділ 5). При цьому мРНК,

що синтезується на оперонах, часто містить кілька послідовних рамок

зчитування і кілька стартових кодонів. Ініціація трансляції відбува-

ється окремо на кожному з них усередині мРНК, і впізнання цих ста-

ртових кодонів не залежить від їхнього розташування відносно

5'-кінця матриці – внутрішня ініціація.

Ініціація трансляції у прокаріотів

Послідовність подій, що відбуваються при ініціації трансляції

у прокаріотів, показано на рис. 8.27. Рибосома вступає в процес у ви-

гляді двох окремих субодиниць, дисоційований стан яких підтримується

завдяки білкового фактору IF3 (IF – Initiation F

actor), зв'язаного з мале-

нькою субодиницею. У присутності IF3 з маленькою субодиницею зв'я-

зується також білок IF1, який блокує зону майбутнього А-сайта тРНК.

Потрійний комплекс маленька субодиниця–IF3–IF1 є субстратом

взаємодії з трьома наступними елементами:

• Фактор ініціації IF2 – G-білок, який зв'язується з маленькою

субодиницею рибосоми в комплексі з GTP і дещо нагадує за

своєю структурою елонгаційний фактор EF2.

• Ініціаторна молекула тРНК – f-Met-тРНК

Met

, антикодонова ча-

стина якої взаємодіє з Р-сайтом маленької субодиниці, оскіль-

ки А-сайт є заблокованим фактором IF1.

• мРНК, яка взаємодіє з маленькою субодиницею таким чином,

що стартовий кодон розміщується в зоні Р-сайта. Загалом

з маленькою субодиницею взаємодіє ділянка мРНК довжиною

~30 нуклеотидів. Специфічне розміщення стартового кодона

в Р-сайті забезпечується комплементарним упізнанням між

ділянкою рРНК 16S (у 3'-кінцевій зоні) і консервативною по-

слідовністю Шайна – Дальгарно (John Shine, Lynn Dalgarno),

яка розміщена в мРНК за 5–9 нуклеотидів від стартового ко-

дона в напрямку до 5'-кінця. Саме наявність послідовності

Шайна – Дальгарно й робить даний кодон AUG стартовим,

відрізняючи його від звичайного метіонінового кодона.