Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 8. Синтез білків

255

Послідовність

Шайна – Дальгарно

IF3

f-Met-тРН

IF1

IF2•GTP

IF2•GDP

5' 3'

AUG

5' 3'

50S

30S

5' 3'

AGGAGGNNNNNAUG

Рис. 8.27. Послідовність основних подій

при ініціації трансляції у прокаріотів

Зв'язування названих трьох елементів, яке приводить до утво-

рення преініціаторного комплексу, відбувається незалежно один від

одного і в будь-якому порядку , зокрема ініціаторна тРНК взаємодіє

з преініціаторним комплексом незалежно від стартового кодона.

Наступним кроком є впізнання кодона антикодоном у Р-сайті, по-

легшуване факторами IF2 і IF3. Утворення кодон-антикодонової

подвійної спіралі індукує конформаційну зміну маленької субоди-

ниці, унаслідок якої відбувається звільнення факторів IF1, IF3

і зв'язування великої рибосомної субодиниці. Взаємодія між вели-

кою субодиницею та IF2 індукує GTPазну активність останнього:

відбувається гідроліз GTP та дисоціація IF2.

У результаті система трансляції є готовою для першого елонгацій-

ного циклу: А-сайт напоготові прийняти аа-тРНК з другою амінокис-

лотою поліпептидного ланцюга, на яку при транспептидації буде пе-

ренесено f-Met з ініціаторної тРНК.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

256

Ініціація трансляції в еукаріотів

Еукаріотична рибосома поза процесом трансляції також дисоці-

йована на дві субодиниці, завдяки взаємодії маленької з фактором

eIF3 (складається з 9–11 субодиниць). Крім того, дисоційований

стан субодиниць підтримується кількома іншими факторами, що

взаємодіють з маленькою (eIF3С) і великою (eIF6) субодиницями.

З комплексом маленька субодиниця – eIF3 зв'язується потрійний

комплекс ініціаторна метіонінова тРНК – eIF2·GTP (eIF2 є аналогом

фактора елонгації eEF1).

eIF3

eIF2•GTP

Met-тРНК

eIF4E

eIF4G

eIF4A

PAB

60S

40S

AAAAAAA

кеп

AUG

AAAAAAA

кеп

Рис. 8.28. Послідовність основних подій

при ініціації трансляції в еукаріотів.

Паралельно (рис. 8.28) відбувається впізнання кепа на 5'-кінці

мРНК факторами ініціації групи eIF4: субодиниця eIF4E зв'язується

з кепом, eIF4G є структурним модулем, що забезпечує цілісність

комплексу та його взаємодію з іншими елементами ініціації, eIF4A

є АТР-залежною РНК-геліказою, фактор eIF4В (не показаний на рис. 8.28)

Розділ 8. Синтез білків

257

взаємодіє з мРНК, стимулює АТРазну активність гелікази і при скану-

ванні мРНК бере участь у впізнанні стартового кодона.

Наступним кроком є об'єднання кеп-асоційованого комплексу

з таким, що асоційований з маленькою субодиницею (ініціаторна тРНК

має бути присутньою на маленькій субодиниці, щоб ця остання могла

приєднатися до кепу). Ефективність утворення цього преініціаторного

комплексу на кепі підсилюється за рахунок взаємодії polyA-зв'язаних

білків (PABP) з eIF4G: polyA-послідовність на 3'-кінці мРНК також при-

єднується до преініціаторного комплексу, замикаючи мРНК у кільце.

Далі за рахунок геліказної активності eIF4A преініціаторний ком-

плекс (залишаючи на кепі лише eIF4E) починає транслокацію: eIF4A

здійснює гідроліз АТР і пересувається вздовж мРНК у напрямку до

3'-кінця, одночасно руйнуючи дволанцюгові шпильки, якщо вони зу-

стрічаються. Під час транслокації преініціаторний комплекс сканує

послідовність мРНК, перевіряючи її на наявність стартового кодона.

Зовсім не обов'язково при цьому перший кодон AUG, що зустрічаєть-

ся, сприймається як стартовий. Упізнання стартового кодона зале-

жить від контексту послідовності, в якій він розташований. Найкра-

щим контекстом, який максимально сприяє ініціації трансляції, є так

звана послідовність Козак (Marilyn Kozak): GCC(A/G)CCAUGG.

Упізнання стартового кодона викликає відповідні конформаційні

зміни комплексу, звільнення факторів eIF3 і eIF4 (останній повер-

тається на кеп разом polyA-ділянкою мРНК), приєднання великої

рибосомної субодиниці та дисоціацію eIF2·GDP після гідролізу GTP.

Дисоціація eIF3 і eIF2 полегшується фактором eIF5. Рибосома після

цього вступає в етап елонгації трансляції, а на кепі починається

збирання наступної рибосоми.

Таким чином, на мРНК одночасно працює кілька рибосом, які

утворюють так звану полісому (рис. 8.29). Зациклення полісоми:

1) сприяє залученню зруйнованої при термінації трансляції у 3'-кін-

цевій зоні мРНК рибосоми до нового раунду ініціації; 2) забезпечує

додатковий захист 3'-кінця мРНК (унаслідок його взаємодії з кеп-

асоційованим комплексом) від нуклеазної деградації; 3) підвищує на-

дійність системи трансляції – оскільки деградація мРНК може розпо-

чинатися тільки з 3'-кінця (див. розділ 7), лише повноцінні матриці,

що містять polyA-послідовність (і автоматично – кодуючу частину)

залучаються до білкового синтезу.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

258

кеп

ААААА

Рис. 8.29. Циркулярна полісома

Термінація трансляції

Термінація білкового синтезу здійснюється за подібною для про- та

еукаріотів схемою (рис. 8.30). Коли після чергового елонгаційного ци-

клу (який стане останнім) в А-сайті опиняється один із трьох стоп-

кодонів, він упізнається фактором термінації трансляції RF1 або RF2

(RF – Release F

actor) – жодна тРНК не містить відповідних антикодо-

нів. Цей фактор рекрутує до рибосоми комплекс RF3·GTP (аналог

EF1). Під дією останнього спрацьовує пептидилтрансферазний центр

рибосоми, намагаючись здійснити перенесення пептидилу. Оскільки

в А-сайті немає звичайного субстрату транспептидації, відбувається

перенесення на молекулу води – гідроліз зв'язку С-кінцевої амінокис-

лоти з рибозою у складі пептидил-тРНК. На цьому закінчується власне

термінація трансляції – з рибосоми звільняється поліпептид. Наступні

події стосуються вже підготовки рибосоми до нового раунду трансляції.

Після гідролізу GTP здійснюється дисоціація факторів термінації та

зв'язування замість них фактора відновлення рибосоми RRF

(Ribosome R

ecycling Factor) і фактора елонгації EF2 в комплексі з GTP.

Сумісна дія цих факторів у координації з гідролізом GTP спричиняє

дисоціацію рибосомних субодиниць. Із маленькою субодиницею замість

дисоційованих RRF і EF2 зв'язується фактор ініціації трансляції IF3

(який, таким чином, можна вважати також і фактором термінації).

IF3 сприяє визволенню тРНК і мРНК з маленької субодиниці й запобі-

гає взаємодії між субодиницями. У результаті субодиниці рибосоми

знов можуть залучитися до ініціації трансляції.

Розділ 8. Синтез білків

259

RF1/2

RF3•GTP

RRF

EF2

IF3

5' 3'

UAG

UAA

UGA

5' 3'

GTP

5' 3'

GDP

Рис. 8.30. Послідовність основних подій при термінації трансляції

Регуляція трансляції

Прокаріотична мРНК має досить невеликий час життя – практично

вона існує під час транскрипції та відразу після неї. Регуляція експре-

сії гена у прокаріотів здійснюється переважно на рівні транскрипції

(хоча білковий синтез може бути залученим до такої регуляції – див.

розділ 5). Для еукаріотів регуляція трансляції є, навпаки, дуже важ-

ливим окремим елементом загальної регуляції експресії.

Регуляція на рівні ініціації трансляції – це один із найважли-

віших механізмів . Ефективність ініціації трансляції залежить на-

самперед від:

• Контексту послідовності, в якій знаходиться стартовий ко-

дон – відхилення цього контексту від послідовності Козак

(див. вище) утруднює впізнання стартової точки і, відповідно,

зумовлює необхідність позитивної регуляції.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

260

• Відстані стартового кодона від 5'-кінця мРНК – довге скану-

вання матриці під час ініціації підвищує ймовірність руйну-

вання преініціаторного комплексу.

• Наявності / відсутності дволанцюгових шпильок у 5'-кінцевій

зоні мРНК, що не транслюється (див. рис. 7.10), які гальмують

процес сканування.

• Присутності / відсутності регуляторних білків, які зв'язуються

у 5'-кінцевій зоні.

Крім того, у деяких випадках (РНК пікорнавірусів, мРНК факторів

росту фібробластів) процес ініціації відбувається за ефективним вну-

трішнім механізмом незалежно від сканування: завдяки наявності

особливих послідовностей (IRES – Internal R

ibosome Entry Site), що

безпосередньо впізнаються елементами системи ініціації.

Один із прикладів участі білків у негативній регуляції ініціації

трансляції наведено на рис. 8.31. Білок, який утримує залізо в клі-

тині – феритин – має з 'являтися негайно після проникнення в цито-

плазму цього необхідного, але отруйного у вільному вигляді мікро-

елемента. Тому мРНК феритину завжди міститься в цитоплазмі,

відсутності заліза – у неактивному стані. Інактивація забезпечується

за рахунок зв'язування репресора (який блокує процес сканування)

зі шпилькою у 5'-кінцевій зоні.

AAAAAA

кон

таза

Феритин

Рис. 8.31. Регуляція синтезу феритину

Як репресор виступає аконітаза (один із ферментів циклу Кребса

(Hans Adolf Krebs)). При появі заліза воно зв'язується аконітазою, що

викликає звільнення аконітази від мРНК і, як наслідок, активацію

Розділ 8. Синтез білків

261

трансляції феритину. Синтезований феритин зв'язує залізо, забираю-

чи його в аконітази, яка повертається на мРНК і зупиняє трансляцію.

Мішенню глобальної регуляції на рівні ініціації є також фактори

ініціації. Наприклад, фосфорилювання / дефосфорилювання eIF-2

приводить, відповідно, до його деактивації / активації.

Крім регуляторних білків, до регуляції трансляції залучаються та-

кож маленькі РНК. Серед них є такі, що мають стимулюючий вплив

на трансляцію : РНК деяких вірусів, РНК-продукти транскрипції

Alu-повторів гальмують фосфорилювання eIF-2, сприяючи активації

трансляції. Молекули мікроРНК (див. розділ 6), навпаки, гальмують

трансляцію (частіше на етапі сканування матриці) за рахунок ком-

плементарної взаємодії з мРНК.

Елонгація трансляції також є мішенню регуляторних впливів.

Швидкість елонгації варіює в досить широких межах відносно серед-

нього значення, іноді рибосома може зупинятися на певний час. Паузи

відбуваються на кодонах, які відповідають мінорним тРНК, зміна

концентрації яких є одним зі шляхів регуляції швидкості трансляції.

Підвищення загальної швидкості трансляції пов'язане з адаптацією

наборів аа-тРНК – узгодженням між частотою найуживаніших кодо-

нів і відповідних ізоакцепторних тРНК.

Наявність шпильок усередині кодуючої частини мРНК також гальмує

елонгацію, як і репресори, які впізнають елементи послідовності мРНК.

Однією з мішеней регуляції є також фактори елонгації, котрі

(як і фактори ініціації) піддаються певним модифікаціям, що зу-

мов люють активацію / інактивацію факторів. Екстремальний при-

клад – дифтерійний токсин, який інактивує фактор eEF-2 і повніс-

тю вимикає білковий синтез.

Особливим випадком є включення в кілька важливих білків (присутні

в усіх організмів ферменти, що належать до класу оксидоредуктаз)

модифікованої амінокислоти селеноцистеїну (яка є елементом актив-

ного центру цих ферментів). Селеноцистеїнова тРНК (продукт особли-

вого тРНК-гена) здатна впізнавати внутрішній стоп-кодон UGA, флан-

кований (у напрямку до 3'-кінця) специфічною шпилькою. Ця тРНК

спочатку акцептує Ser, який далі перетворюється на селеноцистеїн

відповідними ферментами (відбувається заміна ОН-групи на групу

SeH, див. рис. 2.2). Селеноцистеїн-тРНК зв'язується зі специфічним

аналогом елонгаційного фактора EF1 (позначається як SelB у прокарі-

отів і як SECIS в еукаріотів). Шпилька в мРНК упізнається або самим

цим специфічним фактором елонгації (прокаріоти), або ще одним

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

262

білком, з яким цей фактор елонгації взаємодіє (еукаріоти), що й за-

безпечує зв'язування селеноцистеїн-тРНК з А-сайтом рибосоми.

Зміна часу життя мРНК – ще один шлях регуляції трансляції.

Час життя мРНК у цитоплазмі залежить головним чином від ступеня

захищеності 3'-кінця від екзонуклеаз (оскільки кеп є нечутливим до

нуклеаз). Досить типову ситуацію ілюструє приклад регуляції транс-

ляції іншого білка, який має відношення до обміну заліза, – рецептора

трансферину (рис. 8.32).

Аконітаза

Нуклеаза

AAAAAA

Рис. 8.32. Регуляція синтезу рецептора трансферину

Трансферин є позаклітинним переносником заліза, транспорт залі-

за в цитоплазму залежить від кількості рецепторів трансферину

в мембрані. У відсутності заліза всередині клітини на мРНК рецептора

здійснюється синтез білка, мРНК при цьому стабілізована: аконітаза

зв'язана зі шпильками в 3'-кінцевій зоні, що блокує нуклеазну дегра-

дацію. Зростання концентрації заліза викликає дисоціацію аконітази,

і починається швидка деградація мРНК.

Формування просторової структури білка

Термінація білкового синтезу на рибосомі не означає утворення

функціонально активної молекули білка. Серед різних важливих опе-

рацій, яким піддається синтезований поліпептидний ланцюг, слід

згадати такі, що їх можна об'єднати під назвою білкового процесингу –

дозрівання поліпептидного ланцюга.

Розділ 8. Синтез білків

263

• Часткова протеолітична деградація – відщеплення кінцевих

ділянок ланцюга, частіше на N-кінці, або іноді розрізання ла-

нцюга на окремі фрагменти. Часткова деградація є особливо

характерною для секреторних білків і ферментів, які мають

гідролітичні активності, – така деградація переводить білок

у активну форму.

• Утворення дисульфідних містків – ковалентних S-S-зв'язків

між двома наближеними у просторі залишками Cys. Форму-

вання містків прискорюється спеціальним ферментом –

дисульфідізомеразою.

• Ковалентні посттрансляційні модифікації амінокислотних за-

лишків (фосфорилювання, ацетилювання, глікозилювання

тощо), приєднання полісахаридів, ліпідів, простетичних груп

і кофакторів небілкової природи.

• Білковий сплайсинг – досить екзотична операція, описана для

кількох десятків білків різних таксономічних груп, від бактерій

до хребетних. У процесі такого сплайсингу центральна частина

ланцюга (інтеїн) вирізається, а два кінцеві фрагменти (екстеїни)

зшиваються між собою в автокаталітичній реакції. Реакція не

потребує не тільки зовнішнього ферменту, а й джерела енергії:

подібно до сплайсингу мРНК (розділ 7), білковий сплайсинг здій-

снюється шляхом заміни одних зв'язків іншими.

Кожна з названих операцій не є універсальною. Проте будь-який по-

ліпептидний ланцюг, незалежно від того, потребує він процесингу чи ні,

має сформувати просторову структуру для набуття певної активності

(зрозуміло, що не йдеться про неструктуровані білки, згадані в розділі 2).

Закономірності укладання білкової глобули

Перше й головне твердження щодо процесу укладання поліпептид-

ного ланцюга в нативну глобулу полягає в тому, що

просторова

структура нативного білка і шлях її формування повністю визна-

чаються амінокислотною послідовністю, і тільки амінокислотною

послідовністю

Процес укладання білка в нативну структуру – це пошук конфор-

мації, яка відповідає мінімуму вільної енергії для даної послідовності

амінокислот, і, відповідно, є найстабільнішою. Певне уявлення про

своєрідний “енергетичний ландшафт”, що відповідає загальному на-

бору різноманітних конформацій амінокислотного ланцюга, дає

рис. 8.33 (зрозуміло, що насправді кількість конформаційних коорди-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

264

нат значно більше двох – конформаційний простір є багатовимірним).

Нативна структура глобулярного білка завжди відокремлена від ін-

ших конформацій особливо глибоким мінімумом – знаходиться в ене-

ргетичній ямі (рис . 8.33). Наявність такої ями, яка відповідає стабіль-

ному щільно упакованому гідрофобному ядру (див. розділ 2), забезпе -

чує надійність функціонування білка: теплові флуктуації не здатні

вивести структуру з такої ями.

Величезна кількість конформацій, у принципі доступних для поліпеп-

тидного ланцюга, поставила проблему, відому як парадокс Левінталя

(Cyrus Levinthal). Якщо кожен амінокислотний залишок має ~10 кон-

формацій, ланцюг зі 100 залишків – 10

100

конформацій. За найнижчою

оцінкою перемикання однієї конформації відбувається за ~10

–13

с,

тобто, щоб перебрати всі конформації потрібно щонайменше 10

ро-

ків, що значно перевищує вік Всесвіту. Аналогія конформаційного

простору з ландшафтом (рис. 8.33) відразу дає рішення цього пара-

доксу: річка не перебирає увесь ландшафт, вона просто тече одним

або кількома альтернативними низькими руслами, впадаючи врешті-

решт у найнижчу яму.

Так само й для поліпептидного ланцюга існують певні “виділені”

шляхи укладки, які відповідають ієрархії структури білка (див. розділ 2).

Спочатку за рахунок локальних взаємодій утворюються елементи

вторинної структури з гідрофобними поверхнями. Водночас завдяки

гідрофобних взаємодій вони “злипаються” між собою, утворюючи

розплавлену глобулу. Цей процес відбувається досить швидко – за кілька

мікросекунд. На другому етапі, який потребує значно більшого часу

(кілька секунд чи навіть хвилин), реалізується щільна упаковка глобу-

ли за рахунок вандерваальсових взаємодій з утворенням твердої на-

тивної молекули, що відповідає глобальному мінімуму вільної енергії.

Конформація ланцюга змінюється, прямуючи через локальні мінімуми

енергії, які відокремлені один від одного невисокими бар'єрами. Бар'єри

легко долаються за рахунок теплових флуктуацій, і ланцюг нарешті

опиняється у глибокому глобальному мінімумі. Але на такому шляху

можливі енергетичні пастки (рис. 8.34) – досить глибокі мінімуми,

з яких неможливо вибратися за розумний час, оскільки глибина такої

локальної ями перевищує енергію теплових флуктуацій.

Однією з головних причин виникнення енергетичних пасток є агре-

гація поліпептидних ланцюгів. У стані розплавленої глобули, яка відріз-

няється від нативної великомасштабними рухами своїх частин, час від

часу відбувається вихід на поверхню значної частини гідрофобних за-

лишків. Відповідно, недоструктуровані поліпептидні ланцюги будуть