Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 9. Реплікація ДНК

285

Рис. 9.10. Структура реплікативної гелікази (1G8Y)

Інші реплікативні гелікази побудовані за аналогічними принципами.

У розплітанні ДНК під час реплікації беруть також участь гелікази проти-

лежного напрямку (3'-5' – транслокація вздовж лідируючого ланцюга),

але, на відміну від DnaB, вони не є життєво необхідними. Геліказа DnaB –

це невід'ємний елемент реплісоми, через інші структурні модулі вона

зв'язана з ДНК-полімеразами та працює в тісній координації з ними.

Швидкість розплітання ДНК окремою геліказою дорівнює ~35 нуклеоти-

дів за секунду, швидкість руху окремої ДНК-полімерази вздовж однола-

нцюгової ДНК – ~1 тис. нуклеотидів за секунду, при їхньому об'єднанні

сумісна швидкість реплікації становить ~750 нуклеотидів за секунду:

геліказа трохи гальмує полімеразу, остання – штовхає геліказу.

Енергія гідролізу АТР використовується геліказою для здійснення

енергетично невигідного процесу розплітання дуплекса. Тобто одно-

ланцюгова ДНК, що виникає в реплікативній вилці внаслідок актив-

ності гелікази, має бути тимчасово стабілізована в одноланцюговому

вигляді. Цю функцію виконують білки SSB (Single S

trand Binding),

які мають високу спорідненість до одноланцюгової ДНК (рис. 9.11).

SSB білки зв'язуються з полінуклеотидним ланцюгом кооперативно,

взаємодіючи не тільки з ДНК, а й між собою. У результаті ланцюг

ефективно вкривається білковою “шубою”. SSB білки взаємодіють та-

кож з іншими компонентами реплісоми, підсилюючи їхню активність –

у тому числі активність ДНК-полімерази.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

286

ssb

геліказа

Рис. 9.11. Реплікативна вилка, що виникає

як результат дії гелікази та підтримується SSB білками

Синтез ланцюга, що запізнюється

Лідируючий ланцюг при ініціації реплікації, а кожен фрагмент

Оказакі під час реплікації, мають розпочинатися з РНК-праймера.

Його синтез здійснює

праймаза (білок DnaG E. coli). Праймаза рекру-

тується до основи реплікативної вилки геліказою (їхній комплекс на-

зивають праймосомою), робота праймази стимулюється геліказою та

SSB білками. Розпочинаючи від основи реплікативної вилки, праймаза,

яка має низьку процесивність, синтезує праймер – фрагмент РНК дов-

жиною ~12 нуклеотидів (рис. 9.12). Після цього ДНК-полімераза ІІІ,

подовжуючи 3'-кінець праймера, починає синтезувати решту фраг-

мента Оказакі, а праймаза (та сама чи інша) знову зв'язується з гелі-

казою і згодом розпочинає синтез наступного праймера.

На відміну від ДНК-полімерази, праймаза може з однаковим успі-

хом включати до праймера як дезоксирибо- так і рибонуклеотиди.

Праймер є фрагментом саме РНК просто тому, що внутрішньоклітин-

на концентрація рибонуклеозидтрифосфатів є вищою.

Зрозуміло, що РНК-праймер на початку кожного фрагмента Оказа-

кі має бути замінений на відповідну послідовність ДНК. Цю роботу

виконує

ДНК-полімераза І (рис. 9.12): за рахунок своєї 5'-екзонук-

леазної активності полімераза видаляє праймер і одночасно, викорис-

товуючи 3'-кінець попереднього фрагмента Оказакі, подовжує його,

заповнюючи прогалину.

Після здійснення останньої операції між двома фрагментами Оказакі

залишається одноланцюговий розрив (рис. 9.12, 9.13) – ДНК-полімераза

не може його зшити, оскільки здатна тільки переносити нуклеотиди

з NTP на 3'-кінцеву ОН-групу. Утворення фосфодіефірного зв'язку між

сусідніми фрагментами Оказакі, яке потребує джерела енергії, здійсню-

ється в АТР-залежній реакції, яка каталізується

лігазою (ligase).

Розділ 9. Реплікація ДНК

287

дируючи

анцюг

Пра

мер

Пра

маза

Геліказа

Фрагмент

Оказакі

DNAP I

Рис. 9.12. Робота праймази та ДНК-полімерази І

під час руху реплікативної вилки

–

AMP

–

AMP

Lys

AMP

Lys

ATP

Лігаза

Рис. 9.13. Схема роботи лігази

Схему роботи лігази показано на рис. 9.13. До активного центру

ферменту, ковалентно приєднуючись до аміногрупи Lys, переносить-

ся АМР з молекули АТР. Далі АМР приєднується до 5'-кінцевого фос-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

288

фату в місці розриву (своєрідна активація, що нагадує активацію

амінокислоти АРСазою, див. розділ 8). Видалення АМР супроводжу-

ється утворенням фосфодіефірного зв'язку.

Голофермент ДНК-полімерази

Голофермент ДНК-полімерази, який є основою реплісоми, містить дві

молекули ДНК-полімерази ІІІ (по три субодиниці в кожній – кор-фер-

мент), дві копії

τ-білка, γ-комплекс (п'ять субодиниць) та два β-білка,

зв'язані з кожною полімеразою. Призначення компонентів голофер-

менту – утримання разом і забезпечення координації роботи компо-

нентів реплісоми, підвищення процесивності ДНК-полімерази.

Проблема процесивності вирішується β

-білком, який утворює так

званий обруч (зажим), що ковзає (sliding clamp). Дві однакові субоди-

ниці обруча, міцно взаємодіючи за принципом “голова до хвоста”,

утворюють циркулярну тороподібну структуру з отвором приблизно

35 Å у діаметрі (рис. 9.14). Усередині такого кільця легко розміщу-

ється подвійна спіраль ДНК, яка практично не взаємодіє з β-білком.

Кільце може вільно рухатись уздовж ДНК, але не може дисоціювати.

С-кінцевий гідрофобний хвіст ДНК-полімерази ІІІ довжиною 11 амі-

нокислот взаємодіє з гідрофобним карманом обруча. У результаті фор-

мується своєрідний поводок, що допускає певну свободу рухів полі-

мерази, але міцно утримує її на ДНК.

Рис. 9.14. Обруч, що ковзає, – бактеріальний β-білок (2POL)

Оскільки обруч – білкове кільце, що оточує ДНК, його завантажен-

ня на подвійну спіраль виконується АТР-залежним шляхом, ця функ-

ція належить

γ-комплексу. Відбувається завантаження на гібридній

Розділ 9. Реплікація ДНК

289

подвійній спіралі РНК -ДНК відразу після закінчення синтезу чергово-

го праймера.

γ-Комплекс, що складається з п'яти субодиниць та має

U-подібну структуру (рис. 9.15), зв'язує АТР і змінює свою конформа-

цію таким чином, що взаємодіє з обручем, порушуючи його цілісність –

розмикаючи кільце. Далі

γ-комплекс впізнає дуплекс, що утворений

між праймером та матрицею, забезпечуючи посадку відкритого кіль -

ця на цю подвійну спіраль. Взаємодія з дуплексом індукує АТРазну

активність

γ-комплексу. У результаті гідролізу АТР γ-комплекс втрачає

спорідненість до β-білка, що призводить до замикання обруча. Далі

γ-комплекс знову зв'язує АТР, проте обруч має вищу спорідненість до

ДНК-полімерази, ніж до

γ-комплексу: обруч залишається на ДНК і вза-

ємодіє з полімеразою та забезпечує її процесивність.

γ-комплекс•АТР

обруч

ADP

Рис. 9.15. Схема АТР-залежного завантаження обруча,

що ковзає, γ-комплексом

Головну структурну роль в організації реплісоми виконує τ-білок,

котрий взаємодіє з ДНК-полімеразою, геліказою, праймазою та утри-

мує на собі

γ-комплекс. Численні взаємодії τ-білка забезпечують фун-

кціональну координацію між елементами реплісоми.

Дві молекули

τ-білка взаємодіють між собою і кожна утримує кор-

фермент ДНК-полімерази ІІІ, кожна з яких, у свою чергу, зв'язана

з обручем (рис. 9.16). Одна з полімераз здійснює синтез лідируючого

ланцюга, інша – фрагмента Оказакі. Обидві полімерази орієнтовані

в реплісомі однаково. Оскільки вони при цьому ведуть синтез на ан-

типаралельних ланцюгах, той, що запізнюється, утворює реверсну

петлю: конфігурація реплікативної вилки нагадує тромбон.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

290

На рис. 9.16 зображено момент, коли праймаза почала синтез чер-

гового праймера, а

γ-комплекс – напоготові завантажити черговий об-

руч. Коли полімераза, яка працює на ланцюзі, що запізнюється, завер-

шить синтез фрагмента Оказакі (зустріне попередній фрагмент), вона

втратить свій зв'язок з обручем, але збереже взаємодію з

τ-білком.

Втрата спорідненості полімерази до обруча визначається одноланцю-

говим розривом між фрагментами Оказакі. Новий обруч буде при

цьому вже завантажений на черговий праймер, полімераза зв'яжеть-

ся з ним і розпочне синтез нового фрагмента Оказакі. Обруч, який

щойно втратив зв'язок із полімеразою, провзаємодіє з

γ-комплексом –

останній працює також і як “розвантажувач” обруча (див. рис. 9.15),

знімаючи його з ДНК і забезпечуючи пізніше його посадку на праймер.

Праймаза

Фрагмент

Оказакі

Лідуючи

анцюг

Геліказа

DNAP III

Рис. 9.16. Схема організації реплісоми

Топологічні проблеми, пов'язані з реплікацією

Ще одним невід'ємним елементом системи реплікації є ДНК-топоізо-

мерази (див. розділ 3). Рух реплікативної вилки з одночасним руйнуван-

ням подвійної спіралі супроводжується прокруткою спіралі, що створює

позитивні надспіральні витки – еластичні напруження попереду від

вилки (див. рис. 3.24). Це стосується як еукаріотичних систем, де петлі

ДНК зчеплені своїми кінцями з ядерним матриксом, так і прокаріотич-

Розділ 9. Реплікація ДНК

291

них циркулярних хромосом: зустрічний рух двох реплікативних вилок

(рис. 9.3) створює позитивні напруження на ділянці, яка ще не є реплі-

кованою. Еластична напруга має час від часу зніматися, інакше врешті-

решт вона повністю зупинить рух реплісоми. Відповідно, процес реплі-

кації потребує допоміжної дії топоізомераз, основна функція яких як

раз і полягає в релаксації надспіралізованої ДНК: штучне вимикання

активності топоізомераз повністю блокує реплікацію.

В еукаріотичній клітині завдання релаксації можуть виконувати

як топоізомерази І, так і топоізомерази ІІ. Прокаріотична топоізо-

мераза І (топоізомераза Іа) не підходить для виконання цієї ролі,

оскільки здатна знімати тільки негативну надспіралізацію. Релаксація

позитивної надспіралізації при реплікації у бактерій забез печується

гіразою – ферментом, що відноситься до класу топоізомераз ІІ. Гіраза

вносить негативну надспіралізацію в циркулярну ДНК, що й ком-

пенсує позитивні напруження.

Ще одна топологічна проблема виникає при закінченні процесу

реплікації в циркулярному репліконі. Коли дві реплікативні вилки

зустрічаються, вони зупиняються за кілька витків подвійної спіралі

одна від одної: еластичну напругу на маленькій ділянці зняти вже

неможливо (рис. 9.17).

Дволанцюгова

ДНК

Катенан

Рис. 9.17. Термінація реплікації у циркулярному репліконі

Відбувається руйнування короткої подвійної спіралі, яка не піддала-

ся реплікації, але це неможливо зробити без відповідного перекручення

двох дочірніх кільцевих молекул ДНК десь у

іншому місці. Одноланцю-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

292

гові прогалини далі заповнюються ДНК-полімеразами. Але після цього

дві остаточно синтезовані циркулярні молекули так і залишаються

топологічно зчепленими одна з одною – утворюється так званий

катенан (рис. 9.17). Таке саме перекручення двох дочірніх молекул

ДНК реалізується при закінченні реплікації на двох сусідніх еукаріо-

тичних репліконах (див. рис. 9.2).

Зрозуміло, що декатенація – розділення двох молекул – є немож-

ливим без дволанцюгового розриву в одній із них. За цю операцію

також відповідають топоізомерази класу ІІ (еукаріотична топоізоме-

раза ІІ, яка зв'язана з ядерним матриксом під час реплікації, і гомо-

логічна до неї топоізомераза ІV у прокаріотів), що роблять тимчасо-

вий дволанцюговий розріз.

Ініціація реплікації у бактерій

Сайт ініціації реплікації E. coli – ориджин oriC – є ділянкою довжи-

ною 245 пар основ, яка містить чотири сайти по дев’ять пар основ

кожний, що мають спорідненість до білка DnaA, а також кілька

АТ-збагачених ділянок по 13 пар основ зі зниженою стабільністю по-

двійної спіралі. Передумовою ініціації реплікації є створення за раху -

нок активності гірази певного рівня негативної надспіралізації в цир-

кулярній хромосомі. По-перше, негативна надспіралізація сприяє ло-

кальному руйнуванню подвійної спіралі в межах ориджина. По-друге,

оскільки введення надспіралізації є можливим тільки за умови ціліс-

ності полінуклеотидних ланцюгів (хоча б один одноланцюговий роз-

рив знімає будь-яку еластичну напругу), це є ефективною перевіркою

готовності матриці (по всій довжині) до реплікації.

На першій стадії ініціації кілька копій DnaA (у комплексі з АТР)

зв'язуються з ориджином (рис. 9.18) та індукують АТР-залежне локальне

плавлення подвійної спіралі. Білок DnaС завантажує на одноланцю-

гові ділянки геліказу DnaВ, яка, у свою чергу, рекрутує праймазу та

інші елементи реплісоми. Праймаза здійснює синтез праймерів на лі-

дируючих ланцюгах і замінюється на ДНК-полімеразу ІІІ: починається

рух двох реплікативних вилок у протилежних напрямках. Напря-

мок руху задається напрямком транслокації гелікази по ланцюгу, що

запізнюється. Присутність гелікази саме на цьому ланцюзі забезпечує

рекрутування до нього праймази під час елонгації реплікації на почат-

ку синтезу кожного фрагмента Оказакі.

Розділ 9. Реплікація ДНК

293

Dna A

Dna B

Dna C

Рис. 9.18. Ініціація реплікації в E. coli. Жовтим позначено

13-мерні ділянки ДНК зі зниженою стабільністю

На діаметрально протилежному щодо oriC боці циркулярної хромо-

соми розташовано 6 ділянок по 22 пари основ – сайтів термінації ре-

плікації (Ter A, B, C, D, E, F), які утворюють комплекс із білком Tus

(Terminus u

tilization substance). На сайтах термінації, зв'язаних із цим

білком, реплікативні вилки зупиняються. Зона між ними піддається

далі локальному плавленню і після цього відбувається добудова прога-

лин і декатенація (див. рис. 9.17).

Особливості еукаріотичної системи реплікації

Загальні принципи й механізми реплікації є спільними для про- та

еукаріотів, розрізняючись у деталях:

• Еукаріотична реплікативна вилка містить дві ДНК-поліме-

рази, процесивність яких забезпечується ковзним циркуляр-

ним обручем. Різниця лише в тому, що обруч (PCNA – Prolife-

rating Cell Nuclear Antigene) складається з трьох субодиниць.

Крім забезпечення процесивності ДНК-полімерази, PCNA вза-

ємодіє ще з багатьма білками, залученими до виконання різ-

номанітних функцій при реплікації.

• Одна з полімераз веде синтез лідируючого ланцюга, інша синте-

зує фрагменти Оказакі довжиною 200–400 пар основ. РНК-прай-

мер на початку кожного фрагмента Оказакі видаляється спе-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

294

цифічною нуклеазою. Прогалина потім заповнюється ДНК-полі-

меразами, одноланцюговий розрив зшивається лігазою.

• Основним структурним модулем реплісоми є мультибілковий

комплекс RF-C (Replication F

actor C), що виконує функції,

аналогічні до бактеріального τ-білка та γ-комплексу.

• Вважається, що основною реплікативною геліказою еукарі-

отів є моногексамерний білок МСМ (MiniC

hromosome

Maintenance). Одноланцюговий стан ДНК у реплікативній

вилці підтримується білками RPA (Replication Protein A – ана-

лог білків SSB).

Еукаріотичні ДНК-полімерази

П'ять основних типів еукаріотичних ДНК-полімераз прийнято по-

значати грецькими літерами.

Полімераза α складається з чотирьох субодиниць: одна виконує

структурну роль, друга має ДНК-полімеразну активність , ще дві суб-

одиниці відповідають за активність РНК-полімеразну. Відповідно,

полімераза

α виконує роль праймази: саме вона синтезує короткий

РНК-праймер (6–10 нуклеотидів), який далі трохи подовжує як ДНК.

Полімераза

α характеризується низькою процесивністю і, на відміну

від інших ДНК-полімераз, не має екзонуклеазної активності.

Полімераза β – мономерний білок, основна роль якого полягає

заповненні однонуклеотидних прогалин при ексцизійній репара-

ції основ (див. нижче).

Полімераза γ – реплікативна ДНК-полімераза мітохондрій. Склада-

ється з двох субодиниць, крім ДНК-полімеразної має обидві (3'- та 5'-)

екзонуклеазні активності.

Полімерази δ та ε – основні реплікативні ДНК-полімерази еука-

ріотів. Складаються з чотирьох (ε) або трьох–п’яти в різних видів (δ)

субодиниць. Обидві полімерази можуть працювати в реплікативній

вилці (у комплексі з PCNA та RF-C) на обох ланцюгах (лідируючому

та тому, який запізнюється). Функціональну різницю між двома по-

лімеразами остаточно не з'ясовано. Вважається, що полімераза δ

є суто ДНК-синтезуючою машиною, тоді як полімераза ε викорис-

товується також як “сенсор” пошкоджень ДНК, сприяючи активації

репараційних процесів. Крім реплікативного синтезу ДНК, поліме-

рази δ і ε здійснюють заповнення довгих багатонуклеотидних про-

галин як при з'єднанні сусідніх фрагментів Оказакі, так і при ре-

параційних процесах, які розглядатимуться далі.