Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 9. Реплікація ДНК

305

У прокаріотів перемикання на неакуратний синтез, який дозволяє

долати перешкоди, відбувається завдяки заміні ДНК-полімерази ІІІ

на полімеразу низької точності синтезу – ДНК-полімеразу V (поліме-

раза активується у відповідь на несприятливі умови , наприклад,

ультрафіолетове опромінювання). Ця полімераза вставляє напроти

тимінового димеру дві довільні нуклеотиди (виникає мутація), після

чого замінюється на ДНК-полімеразу ІІІ, яка продовжує точний синтез.

Крім того, долати невеликі одноланцюгові прогалини при SOS-репарації

допомагає ДНК-полімераза ІІ – полімераза низької точності синтезу.

Аналогічно перемикання на полімерази низької точності (див. вище)

відбувається і в еукаріотів за наявності в матриці пошкоджених ос-

нов, піримідинових димерів тощо.

Інший шлях здійснення реплікації через тиміновий димер у складі ма-

триці отримав назву

постреплікативної (рекомбінаційної) репарації.

У разі наявності тимінового димеру реплісома може його обійти,

залишивши прогалину в ланцюзі, що синтезується (рис. 9.27). У цьому

випадку на місце прогалини шляхом гомологічної рекомбінації (див.

наступний розділ) вставляється ділянка сестринської молекули ДНК.

Прогалина, що залишається при цьому в сестринській молекулі, легко

заповнюється ДНК-полімеразою. Таким чином, як і при SOS-репа-

рації, пошкодження залишається і може бути виправлено пізніше

завдяки ексцизійній репарації.

Тиміновий димер

Рекомбінація

Рис. 9.27. Постреплікативна (рекомбінаційна) репарація

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

306

Репарація дволанцюгових розривів

Точна репарація дволанцюгового розриву ДНК можлива лише під

час реплікації, коли розірвана ділянка може бути відновлена завдяки

використанню сестринської молекули як матриці за механізмом гомо-

логічної рекомбінації (яка розглядатиметься в наступному розділі).

В інших випадках цілісність розірваних молекул ДНК відновлюється

в консервативному для всіх організмів процесі негомологічного з'єдннання

кінців (NHEJ – Non-H

omologous End Joining). З'єднуються при цьому

будь-які кінці ДНК, що, за наявності великої кількості розривів, призво-

дить до об'єднання ділянок різних хромосом, транслокацій тощо.

Ключову роль у процесі NHEJ відіграють білки Ku, які (у гетероди-

мерній формі) упізнають кінці ДНК, об'єднують їх у нековалентний

комплекс і рекрутують до цього комплексу низку інших білків.

У складі комплексу відбувається розплітання кінцевих ділянок ДНК

і пошук мікрогомології – коротких комплементарних (чи майже ком-

плементарних) одноланцюгових ділянок, які належать різним молеку-

лам (рис. 9.28). У результаті утворюється короткий дуплекс, зайві од-

ноланцюгові ділянки відщеплюються нуклеазами, лігаза зшиває одно-

ланцюгові розриви. Таким чином, у процесі з'єднання відбувається

втрата кількох пар основ. Ця особливість NHEJ-системи використову-

ється при рекомбінації імуноглобулінових генів (див. наступний роз-

діл) з метою підвищення розмаїття їхніх послідовностей.

Білки Ku

Рис. 9.28. Негомологічне з'єднання кінців ДНК

Розділ 9. Реплікація ДНК

307

КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ

1. Що таке реплікон? Охарактеризуйте основні типи репліконів.

2. Дайте визначення реплікативної вилки. Яка різниця між двома

ланцюгами ДНК, що синтезуються під час реплікації ? Що таке фраг-

менти Оказакі?

3. Які ферментативні активності мають бактеріальні ДНК-полі-

мерази? Порівняйте особливості й функціональне значення ДНК-по-

лімераз І і ІІІ.

4. Опишіть основні риси просторової структури ДНК-полімераз.

5. Які спільні риси мають РНК- і ДНК-полімерази? У чому поляга-

ють принципові відмінності між ними?

6. Як здійснюється редагування помилок при синтезі ДНК?

7. Що таке реплісома? Назвіть її основні компоненти та їхнє фун-

кціональне значення.

8. Дайте визначення гелікази. Яку роль вона відіграє в реплікації?

Що таке білки SSB?

9. Що таке праймер? Навіщо він потрібен, яка його хімічна при-

рода, який елемент реплісоми його синтезує?

10. Яку роль виконує лігаза при реплікації ДНК?

11. Як забезпечується висока процесивність ДНК-полімерази?

12. Які топологічні проблеми виникають під час реплікації та за

допомогою чого вони розв'язуються?

13. Дайте визначення ориджина. Як саме здійснюється ініціація

реплікації в бактерій?

14. Укажіть особливості еукаріотичної системи реплікації порівня-

но з прокаріотичною.

15. Які ДНК-полімерази працюють в еукаріотичній клітині? Яка

полімераза здійснює ініціацію реплікації?

16. Яку функціональну роль виконує теломераза? Опишіть меха-

нізм роботи цього ферменту.

17. Порівняйте ексцизійну репарацію основ і нуклеотидів.

18. Як здійснюється репарація місметчів у ДНК?

19. Яким чином відбувається репарація дволанцюгових розри-

вів ДНК?

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

308

РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА

Agarwal, S., Tafel, A.A., Kanaar, R. DNA double-strand break repair

and chromosome translocations // DNA Repair (Amst). – 2006. – Vol. 5.

– Р. 1075–1081.

Baker, T.A., Bell, S.P. Polymerases and the replisome: machines within

machines // Cell. – 1998. – Vol. 92. – Р. 295–305.

Demeret, C., Vassetzky, Y., Méchali, M. Chromatin remodelling and

DNA replication: from nucleosomes to loop domains // Oncogene. –

2001. – Vol. 20. – Р. 3086–3093.

Donmez, I., Patel, S.S. Mechanisms of a ring shaped helicase

// Nucleic Acids Res. – 2006. – Vol. 34. – Р. 4216–4224.

Dutta, A., Bell, S.P. Initiation of DNA replication in eukaryotic cells

// Annu. Rev. Cell Dev. Biol. – 1997. – Vol. 13. – Р. 293–332.

Friedberg, E., Walker, G., Siede, W. DNA repair and mutagenesis.

– Washington, DC : ASM Press, 1995.

Hübscher, U., Maga, G., Spadari, S. Eukaryotic DNA polymerases

// Annu. Rev. Biochem. – 2002. – Vol. 71. – Р. 133–163.

Joyce, C.M., Steitz, T.A. Function and structure relationships in DNA

polymerases // Annu. Rev. Biochem. – 1994. – Vol. 63. – Р. 777–822.

Kornberg A., Baker T.A. DNA replication. – New York : W.H. Freeman

and Company, 1992.

Kuriyan, J., O'Donnell, M. Sliding clamps of DNA polymerases // J. Mol.

Biol. – 1993. – Vol. 234. – Р. 915–925.

Latt, W.L., de, Jaspers, N.G.J., Hoeijmakers, J.H.J. Molecular mecha-

nism of nucleotide excision repair // Genes Dev. – 1999. – Vol. 13.

– Р. 768–785.

Lindahl, T., Wood, R.D. (1999) Quality control by DNA repair // Science.

– Vol. 286. – Р. 1897–1905.

Lohman, T.M., Bjornson, K.P. Mechanisms of helicase-catalyzed DNA

unwinding // Annu. Rev. Biochem. – 1996. – Vol. 65. – Р. 169–214.

O'Donnell, M. Replisome architecture and dynamics in Escherichia coli

//J. Biol. Chem. – 2006. – Vol. 281. – Р. 10653–10656.

Stillman, B. Cell cycle control of DNA replication // Science. – 1996.

– Vol. 274. – Р. 1659–1664.

Zakian, V.A. Telomeres: beginning to understand the end //Science.

– 1995. – Vol. 270. – Р. 1601–1606.

Розділ 10

РЕКОМБІНАЦІЯ ДНК

Чекалинский снова стасовал кар-

ты: игра пошла своим чередом.

А. Пушкин. Пиковая дама

Суттєвим моментом існування ДНК у живих системах є не тільки

розглянуті в попередньому розділі процеси відновлення та збере-

ження інформації, що міститься в послідовності нуклеотидів,

а й різноманітні операції, спрямовані на перетасування цієї інфор -

мації з метою створення нових комбінацій генів. Серед процесів

рекомбінації (recombination), які приводять до генетичного розмаїт-

тя, розрізняють такі:

• Гомологічна рекомбінація – обмін ділянками між досить дов-

гими молекулами ДНК із гомологічними послідовностями пар

основ. Відбувається в усіх організмів, які розмножуються ста-

тевим шляхом, між гомологічними хромосомами при мейозі

(кросинговер), а також при мітозі та в прокаріотів – напри-

клад, після кон'югації двох бактеріальних клітин і проникнен-

ня ДНК з однієї в іншу.

• Сайт-специфічна рекомбінація – вирізання / вбудовування

однієї молекули ДНК із/в іншу, або зміна орієнтації (інверсія)

фрагмента ДНК у межах однієї молекули. Рекомбінація цього

типу здійснюється за рахунок упізнання специфічними біл-

ками коротких елементів послідовності ДНК.

• Незаконна рекомбінація – об'єднання двох молекул ДНК, які

не мають ані гомології, ані специфічних елементів послідо-

вності.

• Переміщення в межах геному мобільних елементів послідов-

ності ДНК.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

310

Гомологічна рекомбінація

Необхідною умовою для здійснення гомологічної рекомбінації

є загальна гомологія між двома молекулами ДНК по всій довжині.

Загальну модель початкового етапу гомологічної рекомбінації зо-

бражено на рис. 10.1. Ініціюючою подією є дволанцюговий розріз

в одній з гомологічних молекул. Цей розріз “розширюється” шляхом

5'-екзонуклеазної деградації ДНК – у результаті в місці розрізу зали-

шаються два одноланцюгові 3'-хвости. Один із них здійснює інвазію –

утворює подвійну спіраль з антипаралельним ланцюгом інтактної го-

мологічної молекули ДНК. Інший ланцюг цієї останньої, відповідно,

виштовхується з дуплекса у вигляді одноланцюгової D-петлі. D-петля

(від displacement), разом із 3'-хвостом, здатна переміщуватись у по-

шуку гомології – максимальної комплементарності в межах подвійної

спіралі, що утворилася між ланцюгами двох гомологічних молекул

ДНК. На наступному кроці відбувається репараційний синтез ДНК:

два 3'-кінці розірваної молекули ДНК подовжуються ДНК-поліме-

разами з використанням у ролі матриць двох ланцюгів інтактної мо-

лекули. До цього моменту схема на рис. 10.1 є одночасно схемою

точної репарації дволанцюгового розриву в одній із двох сестринських

молекул ДНК під час реплікації.

Під час рекомбінації відновлення цілісності ДНК є тільки завер -

шенням початкового етапу. У результаті інвазії та репараційного син-

тезу дві молекули ДНК об'єднуються в чотириланцюгову структуру

з двома перехрестями ланцюгів –

структурами Холідея (Robin

Holliday). Кожна структура Холідея може переміщуватись (так звана

міграція гілки), результатом чого є подовження

гетеродуплекса –

подвійної спіралі між двома майже комплементарними ланцюгами

двох гомологічних молекул ДНК.

Вважається, що за схемою на рис. 10.1 відбуваються початкові ста-

дії гомологічної рекомбінації в більшості про- та еукаріотів. Але меха-

нізми цих процесів найкраще вивчені для бактерій. В E. coli два кінці

розірваної молекули ДНК упізнаються комплексом трьох білків –

recBCD (рис. 10.2), який має геліказну та екзонуклеазні активності.

Комплекс починає рухатися, руйнуючи подвійну спіраль і одночасно

деградуючи ДНК за рахунок своїх 5'- та 3'-екзонуклеазних активнос-

тей. У так званому χ-сайті (сайт підвищеної частоти рекомбінації

в E. coli – послідовність довжиною вісім пар основ, що зустрічається із

середньою періодичністю у 5 тис. пар основ) 3'-екзонуклеазна актив-

Розділ 10. Рекомбінація ДНК

311

ність гальмується, результатом чого є утворення одноланцюгового

3'-кінцевого хвоста. Цей хвіст відразу вкривається білком

recА.

Останній має два сайти зв'язування з ДНК, за рахунок першого з них

і відбувається (у присутності АТР як кофактора) кооперативна взає-

модія з одноланцюговою ДНК: молекули білка оточують полінуклеоти-

дний ланцюг, формуючи на його поверхні праву спіраль. Саме цей

комплекс і здійснює інвазію в подвійну спіраль інтактної гомологічної

молекули ДНК: другий сайт взаємодії recА з ДНК використовується на

цій стадії для утворення комплексу з двома ланцюгами гомологічних

молекул ДНК. За умови комплементарності двох ланцюгів здійсню-

ється гідроліз АТР, після чого recА втрачає спорідненість до ДНК,

залишаючи сформований гетеродуплекс.

воланцюговий

розріз

еградація

5'-кінців

Інвазія

Репараційний

синтез ДНК

Міграція гілки

Гетеродуплекси

Структура Холідея

D-петля

Рис. 10.1. Початкові стадії гомологічної рекомбінації

Повертаючись до останньої панелі на рис. 10.1, розглянемо окрему

структуру Холідея. Як показано на рис. 10.3, її можна піддати ізоме-

ризації, повернувши два дволанцюгові кінці на 180°. Саме у формі

без перехрестя ланцюгів (праворуч на рис. 10.3) структура Холідея

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

312

фіксується завдяки її взаємодії з гомотетрамерним білком ruvA: білок

зв'язується з центром хреста, утримуючи чотири одноланцюгові діля-

нки у приблизно планарній квадратній конфігурації (рис. 10.4, а).

З ruvA та двома дуплексами, що виходять з хреста у протилежних

напрямках, взаємодіє білок

ruvВ (шість субодиниць, які оточують по-

двійну спіраль кільцем). RuvВ працює як АТР-залежна геліказа (або,

швидше, як комплекс ремоделювання хроматину, див. рис. 6.16): два

гексамери ruvВ генерують обертальні рухи подвійної спіралі у проти-

лежних напрямках, що приводить до протягування ланцюгів через

комплекс ruvА/ruvВ (рис. 10.4, б). Саме активність ruvВ і забезпечує

переміщення структури Холідея – міграцію гілки з одночасним по-

довженням гетеродуплекса.

-сайт

RecBCD

RecA

D-петля

Рис. 10.2. Механізм початкових стадій

гомологічної рекомбінації в E. coli

Рис. 10.3. Ізомеризація структури Холідея

Розділ 10. Рекомбінація ДНК

313

а б

ruvB

ruvA

Рис. 10.4. (а): Комплекс ruvA зі структурою Холідея

(1BDX, показано лише С

-атоми білка та Р-атоми ДНК).

(б): Схема переміщення структури Холідея за рахунок

активності ruvB: стрілки вказують напрямок обертання

дуплексів та напрямок руху ланцюгів через комплекс

ruvA/ruvВ (колір стрілок збігається з таким ланцюгів)

Зі схеми на рис. 10.5 видно, як можна ототожнити протягування

чотирьох полінуклеотидних ланцюгів із міграцією гілки. На схемі

у два етапи проведено формальну ізомеризацію планарної конфігура-

ції структури Холідея в конфігурацію з перехрестям: на першому ета-

пі два ланцюги у складі хреста випрямляються, на другому – нижня

частина отриманої конфігурації обертається на 180°. Очевидно, що

зображене на рис. 10.4, 10.5 протягування ланцюгів через комплекс

ruvA/ruvВ є еквівалентним зсуву перехрестя у правий бік.

Останньою подією рекомбінації є розділення (resolution) структури

Холідея

резольвазою – білком ruvС. Резольваза є ендонуклеазою, дві

молекули якої взаємодіють з комплексом ruvА/ruvВ і двома ланцю-

гами хреста, розташованими один навпроти одного: є два рівноймо-

вірні варіанти такого зв'язування. Отже, резольваза робить дволан-

цюговий розріз через хрест двома можливими шляхами (рис. 10.6).

Після наступного зшивання розривів лігазою залишаються дві дво-

ланцюгові молекули ДНК.

На рис. 10.6 показано ізомеризовану чотириланцюгову структуру

з рис. 10.1 – дві структури Холідея з перехрестями перетворені на

планарні (ділянки, синтезовані шляхом репарації, не позначено) –

і результат її розділення. Із чотирьох можливих комбінацій розділення

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

314

двох структур Холідея показано дві. Одна з цих комбінацій викликає

рекомбінацію (аналогічно, рекомбінантною є і пара розрізів 2 + 4): дві

гомологічні молекули ДНК обмінялися ділянками й умовна “абетка”,

якою позначено фрагменти ДНК, змінює регістр – великі літери замі-

нюються на маленькі й навпаки. Пари розрізів 1 + 4 і 2 + 3 не приво-

дять до рекомбінації. Таким чином, рекомбінація при розділенні

структур Холідея відбувається з імовірністю 50 %.

Рис. 10.5. Спрощена схема комплексу ruvВ зі структурою Холідея з рис. 10.4

та її формальні перетворення у дві топологічно еквівалентні конфігурації.

Остання конфігурація збігається з правою структурою Холідея з рис. 10.1.

Кольорові стрілки вказують напрямок руху ланцюгів через ruvВ,

чорні – напрямок руху дуплексів і перехрестя

Незалежно від того, чи відбулася рекомбінація, усі продукти міс-

тять гетеродуплекси (середня частина всіх кінцевих молекул на

рис. 10.6). Оскільки гетеродуплекси складаються з майже комплемен-

тарних ланцюгів, вони містять місметчі. Відповідно, кінцевою опера-

цією, яка завершує процес гомологічної рекомбінації, є репарація цих

місметчів описаною в попередньому розділі системою mutHLSU.

На відміну від того, як ця система спрацьовує після реплікації, після

рекомбінації ланцюг, де відбувається заміна нуклеотидів, обирається

випадково. Наприклад, центральний фрагмент першої молекули на

рис. 10.6 перетворюється або на В/В', або на b/b'. Якщо на цій ділян-

ці розташований ген, шляхом репарації обирається один із його але-

лів – В або b. Отже, побічним ефектом рекомбінації є відоме в гене-

тиці явище конверсії гена. Білки системи mutHLSU якимось чином