Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 10. Рекомбінація ДНК

325

довгі кінцеві повтори (200–600 пар основ), які й надали назву цим

мобільним елементам.

Кодуюча

частина

Транскрипція

Трансляція

мРНК

Зворотна

ранскриптаза

Зворотна

ранскрипція

Інсерція

Інтеграза

Цитоплазма

дро

Рис. 10.16. Механізм переміщення LTR-ретропозона

Процес переміщення копії LTR-ретропозона нагадує життєвий цикл

ретровірусів. Першим етапом є транскрипція ретропозона: синтез

мРНК РНК-полімеразою ІІ (рис. 10.16). Ця мРНК транспортується до

цитоплазми, де піддається трансляції. Зворотна транскриптаза, яка

є продуктом цієї трансляції, здійснює синтез ДНК: мРНК використо-

вується як матриця, 3'-кінець молекули тРНК – як праймер. Комплекс

синтезованої ДНК-копії ретропозона з інтегразою повертається до ядра,

де здійснюється інсерція цієї ДНК у геном.

Мобільні елементи LINE та SINE

Мобільні елементи LINE довжиною приблизно 6 тис. пар основ міс-

тять принаймні два гени – зворотної транскриптази та ендонуклеази –

і невеликі специфічні послідовності на кінцях. Процес переміщення

копії елемента починається так само, як і у випадку ретропозонів –

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

326

із транскрипції РНК-полімеразою ІІ (рис. 10.17). Після трансляції в ци-

топлазмі синтезовані білки зв'язуються з мРНК, цей комплекс поверта-

ється до ядра, де й відбувається зворотна транскрипція: ендонуклеаза

здійснює одноланцюговий розріз у геномній ДНК, 3'-кінець у місці роз-

різу використовується як праймер. Після синтезу другого ланцюга ДНК

нова копія елемента остаточно вбудовується в геном.

Кодуюча

частина

мРНК

Зворотна

ранскриптаза

Зворотна

ранскрипція

Кінцеві

елементи

Цитоплазма

дро

Рис. 10.17. Механізм переміщення мобільного елемента LINE

Синтез мРНК при транскрипції елемента LINE, як і для більшості

інших еукаріотичних мРНК, закінчується на polyA-сигналі (див. розділ 7).

Цей polyA-сигнал є слабким, що дозволяє елементу вбудовуватись

в інтрони звичайних генів без особливих перешкод для експресії цих

генів: система процесингу часто не помічає слабкий polyA-сигнал.

Елементи LINE є, відповідно, найпоширенішими мобільними елемен-

тами в геномі вищих еукаріотів (~20 % геному людини представлено

послідовностями LINE) і основним джерелом зворотної транскриптази

у клітинах. З часом накопичуються мутації й окремі елементи LINE

стають неактивними (тобто вже не кодують зворотну транскриптазу),

Розділ 10. Рекомбінація ДНК

327

але переміщуються, використовуючи білки, що кодуються активними

елементами. Найчастіше в геномі людини зустрічається елемент типу

LINE, котрий позначається як L1 (кілька сотень тисяч копій).

Іноді мобільні елементи є не просто ділянками “егоїстичної ДНК”,

що автономно розмножуються в геномі, а виконують певні конкретні

біологічні функції. Наприклад, у дрозофіли відсутня теломеразна сис-

тема й елемент LINE певного типу виконує функцію подовження кін-

ців хромосом після реплікації: зворотна транскриптаза виступає як

теломераза, мРНК мобільного елемента – як теломеразна матрична

РНК (див. рис. 9.22). Цікаво, що послідовності ДНК гена теломерази

та елементів LINE характеризуються високою гомологією: цілком мож-

ливо, що теломеразна система походить від мобільних елементів LINE.

Мобільні елементи SINE – короткі (100–300 пар основ) елементи по-

слідовності, які не кодують білків і містять лише промотор для РНК-

полімерази ІІІ. Процес їхнього переміщення є таким самим, як зобра-

жено на рис. 10.17: елементи SINE “паразитують” на системі LINE,

використовуючи її ферменти. На відміну від усіх інших мобільних

елементів, елементи SINE сконцентровані в ділянках геному, збагаче -

них на гени. Імовірною причиною цієї закономірності є те, що РНК-

продукт SINE має спорідненість до певної протеїнкінази, яка гальмує

процес трансляції. Відповідно, зв'язування РНК із протеїнкіназою

блокує останню, що приводить до загального підвищення рівня білко-

вого синтезу. Таким чином, підвищення рівня транскрипції SINE ра-

зом з активацією інших генів стимулює трансляцію.

КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ

1. Як саме починається гомологічна рекомбінація? Як здійсню-

ється точна репарація дволанцюгових розривів за рекомбінаційним

механізмом?

2. Що таке гетеродуплекс? Яку роль відіграє білок recA при гомо-

логічній рекомбінації?

3. Дайте визначення структури Холідея. В якій формі вона реалі-

зується під час гомологічної рекомбінації? За рахунок чого стабілі-

зується така форма?

4. За яким механізмом відбувається міграція гілки під час гомо-

логічної рекомбінації?

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

328

5. Як здійснюється поділ структури Холідея під час гомологічної

рекомбінації? З якою імовірністю відбувається обмін ділянками

між двома гомологічними молекулами ДНК і від чого залежить реа-

лізація такого обміну ?

6. Що відбувається з гетеродуплексом після завершення гомоло-

гічної рекомбінації?

7. Чим відрізняється сайт-специфічна рекомбінація від гомологічної?

8. Що таке незаконна рекомбінація?

9. Як побудовані кластери імуноглобулінових генів? Які події при

дозріванні імуноглобулінового гена можна віднести до сайт-специ-

фічної рекомбінації?

10. Якими механізмами забезпечується необмежене зростання роз-

маїття послідовностей імуноглобулінових генів при їхньому дозріванні?

11. Яка різниця між реплікативним і нереплікативним механізма-

ми переміщення ДНК-транспозонів?

12. Яка різниця між механізмами переміщення LTR-ретропозонів

і мобільних елементів типу LINE?

13. Чим різняться мобільні елементи типів LINE і SINE?

РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА

Boeke, J.D., Chapman, K.B. Retrotransposition mechanisms // Curr.

Opin. Cell Biol. – 1991. – Vol. 3. – P. 502–507.

Grindley, N.G.F., Leschziner, A.E. DNA transposition: from a black box

to a color monitor // Cell. – 1995. – Vol. 83. – P. 1063–1066.

Haniford, D.B., Chaconas G. Mechanistic aspects of DNA transposition

// Curr. Opin. Genet. Dev. – 1992. – Vol. 2. – P. 698–704.

International Human Genome Sequencing Consortium. Initial se-

quencing and analysis of the human genome // Nature. – 2001. – Vol. 409.

– P. 860–921.

Kazazian, H.H., Moran, J.V. The impact of L1 retrotransposons on the

human genome // Nature Gen. – 1998. – Vol. 19. – P. 19–24.

Kuzimov, A. Unraveling the late stages of recombinational repair: me-

tabolism of DNA junctions in E. coli // BioEssays. – 1996. – Vol. 18.

– P. 757–765.

Labhart, P. Nonhomologous DNA end joining in cell-free systems

// Eur. J. Biochem. – 1999. – Vol. 265. – P. 849–861.

Розділ 10. Рекомбінація ДНК

329

Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-

specific recombinations // Annu. Rev. Biochem. – 1989. – Vol. 58.

– P. 913–949.

Levin, K.L. It's prime time for reverse transcriptase // Cell. – 1997.

– Vol. 88. – P. 5–8.

Sadofsky, M.J. The RAG proteins in V(D)J recombination: more than

just a nuclease // Nucl. Acids Res. – 2001. – Vol. 29. – P. 1399–1409.

Singer, M. F. LINE1: a human transposable element // Gene. – 1993.

– Vol. 135. – P. 183–188.

Stahl, F. Meiotic recombination in yeast: coronation of the double-

strand-break repair model //Cell. – 1996. – Vol. 87. – P. 965–968.

West, S.F. Enzymes and molecular mechanisms of genetic recombina-

tions // Annu. Rev. Biochem. – 1992. – Vol. 61. – P. 603–640.

West S. Processing of recombination intermediates by the Ruv ABC

proteins // Annu. Rev. Genet. – 1997. – Vol. 31. – P. 213–244.

Розділ 11

МЕТОДИ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ

… блоха действительно была

на все ноги подкована на на-

стоящие подковы, а Левша доло-

жил, что и это еще не всё удиви-

тельное.

Н. Лесков. Левша

Клонування, ампліфікація і секвенування ДНК

Клонування ДНК

Перша проблема, котра постає перед дослідником, – це отримання

в достатній кількості предмета свого дослідження. Ефективним під-

ходом, що дозволяє розмножити будь-який конкретний фрагмент

ДНК, є техніка клонування цієї ДНК у бактеріальних клітинах: фраг-

мент, що цікавить, вбудовується у ДНК-вектор з утворенням реком-

бінантної молекули ДНК, яка вводиться у клітину (так звана транс-

формація). Далі залишається зачекати зростання бактеріальної куль-

тури – бактерія використовується як своєрідний біореактор.

Як вектор часто використовують бактеріальні плазміди – порівняно

невеликі циркулярні молекули ДНК, що існують у клітині незалежно

від бактеріальної хромосоми. Основними вимогами до плазміди як

вектора є наявність у її складі ориджина реплікації, унікального

(одного на плазміду) сайта, що впізнається певною рестриктазою,

і гена стійкості до одного з антибіотиків (рис. 11.1).

Рестриктази – специфічні до невеликих елементів послідовності

ендонуклеази, що здійснюють розрізання обох ланцюгів ДНК. Назви

рестриктаз (існує кілька сотень таких ферментів) утворюють за та-

ким принципом: перша велика літера позначає рід мікроорганізму,

дві маленькі – вид, римські цифри та іноді великі літери – порядко-

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

332

вий номер рестриктази серед інших рестриктаз даної бактерії. Напри-

клад, EcoRI – рестриктаза RI із Escherichia co

li.

Сайтом рестрикції, що впізнається рестриктазою, є невеликі (чоти-

ри, шість, іноді трохи більше пар основ) паліндромні послідовності

(див., наприклад, сайт EcoRI на рис. 11.2). Залежно від типу рестрик-

тази, два розрізи, які вона здійснює, можуть бути розташованими то-

чно один напроти одного у двох ланцюгах, що приводить до утворен-

ня так званих тупих (blunt) кінців. Частіше рестриктази залишають

взаємно комплементарні 5'-кінцеві (а іноді 3'-кінцеві) одноланцюгові

вирости (як на рис. 11.2) – липкі (sticky) кінці.

ORI

Сайт

рестрикції

Рис. 11.1. Схема організації плазмідного вектора

(Ori – ориджин реплікації, amp

– ген стійкості до ампіциліну)

CTTAA

GAATTC

CTTAAG

CTTAA

AATTC

CTTAA

AATTC

Плазміда

Фрагмент

НК

Реком

інантна

плазміда

рестрикція

ігаза

Eco

Рис. 11.2. Виготовлення рекомбінантної ДНК

на основі плазмідного вектора

Розділ 11. Методи молекулярної біології

333

Із метою створення рекомбінантної ДНК очищену плаз міду, яка

містить єдиний сайт певної рестриктази, обробляють цією рестрик-

тазою і отримують лінійний вектор з липкими кінцями (рис. 11.2).

Далі додають фрагмент ДНК, який було вилучено за допомогою тієї

самої рестриктази. За рахунок комплементарної взаємодії між лип-

кими кінцями фрагмента й вектора утворюється циркулярний неко-

валентний комплекс двох молекул ДНК. Завдяки використанню ін-

шого ключового ферменту рекомбінантної технології – ДНК-лігази

(див. розділ 9) – полінуклеотидні ланцюги зшиваються. Найзручні-

шими є плазмідні вектори, які містять так званий полілінкер – ділян-

ку з певним набором унікальних рестриктних сайтів, що дозволяє

підібрати одну з рестриктаз, найпридатнішу для кожного випадку.

Фрагменти ДНК із тупими кінцями також можна вбудувати

у вектор за допомогою лігази, хоча така реакція є на порядок менш

ефективною. За допомогою термінальної нуклеотидилтрансферази

(фермент, який без участі матриці приєднує нуклеотиди до 3'-кінця)

до 3'-кінців фрагмента ДНК можна приєднати, наприклад, однолан-

цюговий poly(dA)-хвіст, а до 3'-кінців лінійного вектора – poly(dT). При

змішуванні між комплементарними одноланцюговими кінцями відбу-

деться спарювання, остаточне зшивання завершує ДНК-лігаза.

Можна також утворити тупі кінці на фрагментах із липкими кінцями.

Для цього або здійснюють видалення одноланцюгових виростів за до-

помогою нуклеази S1 (нуклеаза, що гідролізує тільки одноланцюгову

ДНК), або липкі кінці забудовують за допомогою фрагмента Кленова

ДНК-полімерази І E. coli (див. розділ 9). Утворений фрагмент із тупими

кінцями вбудовують у вектор за щойно описаною процедурою.

Трансформація бактеріальних клітин рекомбінантною плазмідою

здійснюється зазвичай у розчині CaCl

або шляхом електропорації

(через суспензію клітин проводиться короткий імпульс електричного

струму). В обох випадках підвищується проникність клітинної стінки –

і рекомбінантна плазміда потрапляє всередину. Зрозуміло, що далеко

не всі бактерії отримують плазміду при трансформації. І тут стає

в нагоді ген стійкості до антибіотика: достатньо обробити бактеріаль-

ну культуру цим антибіотиком, щоб залишити тільки трансформовані

клітини. Далі відбувається автономна реплікація плазміди та розмно-

ження самих клітин, що призводить до значного зростання загальної

кількості плазмід (рис. 11.3). Клоновані плазміди виділяють із бактері-

альної культури, а обробка їх тією самою рестриктазою, що була ви-

користана при виготовленні рекомбінантної молекули, дозволяє вирі-

зати з вектора клонований фрагмент ДНК.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

334

Трансформація бактерій плазмідами є тим ефективнішою, чим

меншою за розміром є плазміда. Відповідно, існує обмеження

в розмірі фрагментів, що їх можна клонувати описаним шляхом –

до 10 тис. пар основ. Альтернативною, але цілком аналогічною техні-

кою, що дозволяє працювати з фрагментами довжиною ~20 тис. пар

основ, є клонування ДНК із використання векторів на основі бак-

теріофага

λ (див. розділ 5). За допомогою рестриктази фрагмент

ДНК вбудовується у фагову ДНК, додаються порожні фагові оболон -

ки, і здійснюється збирання фагових частинок in vitro. Рекомбінант -

ними бактеріофагами заражають бактеріальну культуру, де відбу-

вається їхнє розмноження.

Бактеріальна хромосома

Плазміда

Трансформація

Ампіцилін.

Реплікація плазміди,

розмноження клітин

Рис. 11.3. Розмноження рекомбінантної плазміди

в бактеріальних клітинах

Використовуючи вектори на основі космід, можна клонувати фра-

гменти ДНК до 40 тис. пар основ. Косміда є плазмідою, яка крім ори-

джину, сайтів рестрикції та генів стійкості до антибіотиків містить

два cos-сайти: липкі кінці лінійної молекули ДНК бактеріофага λ. Саме

за рахунок cos-сайтів лінійна молекула фагової ДНК циркуляризуєть-

ся після її проникнення в бактеріальну клітину. У лінійну косміду

з такими липкими кінцями вбудовується фрагмент ДНК, який бажа-

но клонувати. Рекомбінантна косміда упаковується in vitro у фагові

частинки, якими обробляють бактеріальну культуру. У цьому випадку

бактеріофаг використовується як ефективний засіб трансформації:

лінійна косміда проникає у клітину, де циркуляризується за рахунок

Розділ 11. Методи молекулярної біології

335

cos-сайтів і бактеріальної лігази. Далі циркулярна косміда розмножу-

ється як звичайна плазміда (див. схему на рис. 11.3).

Для клонування фрагментів ДНК від 100 тис. пар основ викорис-

товують спеціально сконструйовані вектори ВАС (Bacterial A

rtificial

Chromosome) і YAC (Yeast Artificial Chromosome). BAC-вектори створе-

но на основі F-плазмід бактерій, YAC-вектор являє собою штучну

дріжджову мініхромосому, яка містить центромеру, теломери й точку

початку реплікації. У такий вектор можна ввести чужорідний фраг-

мент ДНК розміром понад 100 тис. пар основ. Така мініхромосома,

уведена в дріжджову клітину, буде реплікуватися й поводити себе

аналогічно іншим дріжджовим хромосомам при мітотичному поділі.

Більшість сучасних векторних систем є поліфункціональними – при-

датними не тільки для клонування ДНК, а й для експресії рекомбінан-

тних білків, про що йтиметься нижче.

Гель-електрофорез

Після виділення клонованого рекомбінантного вектора та розрізан-

ня його рестриктазою постає проблема відокремити фрагмент ДНК

від вектора. З цією метою найчастіше застосовують гель-електро-

форез – надзвичайно важливий метод у молекулярній біології.

Принцип електрофорезу дуже простий (рис. 11.4). Суміш фрагмен-

тів ДНК (або РНК) наносять у лунку пластинки гелю – середовища,

сформованого полімерною сіткою . Зазвичай гель виготовляють на ос-

нові агарози або поліакриламіду. Через нього пропускають електрич-

ний струм, завдяки чому негативно заряджені молекули нуклеїнової

кислоти рухаються в електричному полі. Полімерна сітка гелю ство-

рює для цього руху суттєвий опір, якій долається тим легше, чим

меншим є розмір фрагмента. Через певний час фрагменти розділя-

ються на окремі зони – смуги гелю, які містять гомогенний набір фраг-

ментів одного розміру. Для візуалізації смуг гель забарвлюють флуо-

ресцентним барвником (найчастіше використовують бромистий ети-

дій), який зв 'язується з ДНК. Після цього смугу можна вирізати з ге-

лю, та екстрагувати ДНК.

Гель-електрофорез широко використовують також і як аналітич-

ний засіб із метою з'ясування складу суміші. Для візуалізації смуг

(особливо якщо розділюють невеликі кількості ДНК) часто застосо-

вують радіоактивне мічення ДНК шляхом уведення радіоактивного

ізотопу

Р у склад 5'-кінцевих фосфатних залишків. Після елект-

рофорезу здійснюється авторадіографія: на гель накладають фото-

пластинку, яка засвічується напроти смуг унаслідок їхньої радіоак-