Сиволоб А.В. Молекулярна біологія. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

346

Одну з можливостей замінити нуклеотид за допомогою ПЛР ілюст-

рує рис. 11.10. Як матриця для ампліфікації використовується плаз-

міда, котра містить послідовність-мішень. Реакція проводиться у двох

варіантах – із різними наборами праймерів. Один із двох праймерів

у кожному наборі містить замінений нуклеотид, як показано на рису-

нку. Результатом ампліфікації є лінійні молекули ДНК із заміненою

нуклеотидною парою. Об'єднання продуктів ампліфікації, денатура-

ція і потім ренатурація приводять до того, що половина молекул обмі-

нюється ланцюгами: оскільки дволанцюговий розрив має різне поло-

ження у продуктах ампліфікації, утворюються дві циркулярні молеку-

ли з одноланцюговими розривами. Після трансформації в бактеріаль-

ну клітину лінійні молекули (друга половина матеріалу ) руйнуються

бактеріальними нуклеазами, а одноланцюгові розриви в циркулярних

молекулах репаруються. У результаті відбувається клонування послі-

довності-мішені, яка містить замінену нуклеотидну пару.

Праймери

Замінений

нуклеотид

ПЛР ПЛР

енатурація

–

ренатурація

Рис. 11.10. Спрямований мутагенез за допомогою ПЛР.

Послідовність-мішень зафарбована блакитним кольором

Велика кількість білків (у тому числі, ферменти, що використо-

вуються в рекомбінантних технологіях) виробляються шляхом екс-

пресії в бактеріальних клітинах. Поряд із прокаріотичними розроб-

Розділ 11. Методи молекулярної біології

347

ляються й використовуються також системи експресії рекомбінант-

них білків в еукаріотичних клітинах. Особливо важливими еукаріо-

тичні системи експресії є для еукаріотичних білків, котрі не можуть

бути синтезовані бактеріальною клітиною в активній формі. Це, зок-

рема, стосується білків, які піддаються суттєвим посттрансляцій-

ним модифікаціям – наприклад, глікопротеїдів.

Методи аналізу структури й експресії генів і геномів

Блот-гібридизація

Саузерн-блотинг. Потужним засобом аналізу складних сумішей

ДНК щодо наявності там специфічних елементів послідовності є блот-

гібридизація на нітроцелюлозних фільтрах за Саузерном (Edward

Southern). Назва процедури, яку схематично зображено на рис. 11.11,

походить від слова blotting (промакування): фрагменти ДНК розділю-

ються за допомогою гель-електрофорезу (залишаючись невидимими

в гелі), після чого на гель накладають нітроцелюлозний фільтр, а під

та над цим “сендвічем” розміщують фільтрувальний папір і занурю-

ють нижній шар паперу в лужний розчин. Під дією капілярних сил

розчин піднімається до верхнього шару паперу, “захоплюючи” при

цьому ДНК і переносячи її з гелю на нітроцелюлозу. Одночасно при

цьому ДНК денатурується лугом. У результаті одноланцюгова ДНК

опиняється на фільтрі – середовищі, придатному для подальшої гіб-

ридизації, а сам фільтр є точною реплікою вихідного гелю. Так само

можна перенести ДНК на нітроцелюлозу, застосувавши електрофорез

у поперечному напрямку – із гелю на фільтр. Далі проводять обробку

фільтра зондом – одноланцюговим фрагментом ДНК певної послідов-

ності, який містить радіоактивну мітку. Зонд гібридизується з ком-

плементарною ДНК у певних досі невидимих смугах, що можна зафік-

сувати за допомогою авторадіографії.

У такий спосіб можна встановити, наприклад, наявність у геномі

додаткових копій послідовності, що є гомологічними вже відомій; при-

сутність у невивченому геномі генів, гомологічних відомим генам; при-

сутність специфічних послідовностей ДНК у препаратах, що отримані

з білково-нуклеїнових комплексів. Прикладом одного з численних за-

стосувань Саузерн-блотингу є метод

фингерпринтингу ДНК (DNA fin-

gerprinting). Метод базується на факті наявності в еукаріотичних гено-

мах мінісателітних повторів (див. розділ 4) – невеликих елементів

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

348

послідовності, що тандемно повторюються в різних місцях геному кіль-

ка разів. Розподіл локусів за кількістю повторів є індивідуальним – так

само, як відбитки пальців. З метою ідентифікації особини (чи особи –

у криміналістиці, судових справах тощо) геномну ДНК обробляють рес-

триктазою, що не має своїх сайтів усередині повтору. Фрагменти роз-

діляються шляхом електрофорезу, здійснюється блотинг і гібридизація

радіоактивно міченим елементом послідовності мінісателіта. У ре-

зультаті на авторадіограмі представлено специфічний для особини на-

бір фрагментів різної довжини, тобто різної кількості повторів мініса-

теліта – своєрідний молекулярний відбиток (DNA fingerprint).

Фільтрувальний

папір

Лужни

розчин

Гель після

електрофорезу

Нітроцелюлозний

фільтр

Авторадіограма

Блотинг

ро

ка зондом

Рис. 11.11. Блот-гібридизація

Нозерн-блотинг відрізняється від описаної процедури блотингу за

Саузерном лише тим, що на гель для електрофорезу наносять сумар-

ний препарат виділеної мРНК. Гібридизація з міченим фрагментом

ДНК (наприклад, кДНК із бібліотеки клонів) дозволяє встановити на-

явність певної мРНК, тобто активність гена, у клітинах певного типу,

після дії активуючих / репресуючих факторів тощо, а також оцінити

рівень цієї активності (концентрацію мРНК) за інтенсивністю забарв-

лення смуги на авторадіограмі. Назва методу (nothern) є просто жар-

тівливою аналогією з буквальним значенням прізвища Саузерна.

Розділ 11. Методи молекулярної біології

349

Вестерн-блотинг – назва, що продовжує цю аналогію – це метод

перенесення білків з гелю після електрофорезу на фільтр з метою ана-

лізу складних білкових сумішей. Фільтр обробляють антитілами, спе-

цифічними до певного білка, потім міченими (наприклад, флуорес-

центною міткою) антитілами до цих антитіл. Практично, це єдиний

спосіб детектувати наявність малої кількості конкретного білка в то-

тальному білковому препараті.

Визначення стартових і кінцевих точок

та рівня активності транскрипції

Кілька описаних нижче прикладів ілюструють деякі підходи, роз-

роблені для характеристики транскриптів і дослідження рівня транс-

крипційної активності.

Картування за допомогою нуклеази S1 дозволяє не тільки визна-

чати старт і кінцеву точку транскрипції певного гена , а й оцінюват и

рівень транскрипційної активності цього гена. Процес починається

з клонованого фрагмента гена, який містить кінцеву точку, яка має

бути встановленою. Навкруг неї обирають два рестриктні сайти

однієї рестриктази, і ще один – іншої, як показано на рис. 11.12.

Перша рестриктаза вирізає фрагмент, залишаючи одноланцюгові

вирости на 5'-кінцях. Використовуючи їх як матрицю, фрагмент

Кленова ДНК-полімерази І добудовує 3'-кінці, приєднуючи радіо-

активно мічені нуклеотиди – у результаті 3'-кінці обох ланцюгів

містять мітку. Щоб позбавитись однієї з них, використовують сайт

другої рестриктази, який все ще залишається всередині. Нарешті

маємо мітку на 3'-кінці тільки матричного ланцюга (який із лан-

цюгів є матричним, треба знати при підборі рестриктаз або вста-

новити за кінцевим результатом). Денатурація цього фрагмента

дає радіоактивно-мічений одноланцюговий зонд, для якого є точ-

но відомими його довжина й локалізація в гені. На останніх ета-

пах проводять гібридизацію цього зонда із сумарним препаратом

клітинної РНК у розчині – комплементарна частина відповідної

мРНК утворює із зондом подвійну спіраль. Після цього й викорис-

товують нуклеазу S1, яка здатна гідролізувати тільки одноланцю-

гову нуклеїнову кислоту. Для локалізації кінцевої точки транскри-

пції залишається визначити точну довжину отриманого міченого

фрагмента ДНК за допомогою електрофорезу: ця довжина дорів-

нює відстані від мітки до кінцевої точки. Інтенсивність смуги після

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

350

електрофорезу дає інформацію про транскрипційну активність ге-

на: чим вищою є інтенсивність, тим більше мРНК містилося у пре-

параті, виділеному із клітини.

HindIII HindIIIXhoI XhoI

XhoI

Закінчення транскрипції

Рестриктні са

ти

НК-полімераза

+ мічені NTP

Hind

III

Xho

енатурація,

гібридизація з

сумарною РНК

Мітка

Електрофорез

Рис. 11.12. S1-картування точки закінчення транскрипції

Так само, підібравши інші рестриктази та здійснивши на від-

повідному етапі мічення 5'-кінців, можна визначити стартову то-

чку транскрипції.

Подовження праймера (primer extension) – альтернативний метод

визначення стартової точки. Для його реалізації необхідно знати будь-

яку невелику послідовність усередині кодуючої частини гена й синте-

зувати відповідний праймер, помітивши його (рис. 11.13). Праймер

додається до сумарної мРНК і гібридизується з нею, після чого здійс-

нюється реакція зворотної транскрипції. Синтез ДНК зворотною

транскриптазою припиняється на 5'-кінці мРНК, який і відповідає

стартовій точці. Електрофорез у денатуруючих умовах дозволяє точно

встановити довжину фрагмента, тобто локалізувати стартову точку

відносно місця гібридизації праймера. Як і у випадку S1-картування,

інтенсивність електрофоретичної смуги дозволяє оцінити кількість

мРНК у препараті, тобто рівень транскрипційної активності.

Розділ 11. Методи молекулярної біології

351

Старт

ранскрипції

мРНК

Гі

ридизація з

міченим праймером

Зворотна

ранскрипція

енатурація,

електрофорез

Рис. 11.13. Метод подовження праймера

для визначення старту транскрипції

Визначення транскрипційної активності in vivo. Описані ме-

тоди визначають рівень присутності мРНК певного типу в клітині.

Цей рівень залежить не тільки від рівня транскрипційної активності,

але й від швидкості деградації мРНК. Один із методів, який дозволяє

встановити, чи відбувається транскрипція в даний момент, полягає

в тому, що клітинні ядра виділяються і до них додаються мічені нук-

леозидтрифосфати. Нові акти ініціації транскрипції вже не відбува-

ються в таких відокремлених ядрах, і РНК-полімераза просто продов-

жує добудовувати транскрипти, синтез яких розпочався до виділення.

Зрозуміло, що такі подовжені транскрипти виявляються міченими.

Після виділення РНК їх треба ідентифікувати, що можна зробити

шляхом гібридизації з ДНК генів, які цікавлять дослідника.

Аналіз експресії геному

Проаналізувати повну програму транскрипції організму чи клі-

тин певного типу за певних фізіологічних умов або у процесі роз-

витку, а також вирішувати інші завдання, пов'язані з вивченням

функціонування цілого геному, дозволяють методи, що базуються

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

352

на використанні так званих ДНК-мікроареїв (DNA-microarrays) або

ДНК-чіпів (DNA-microchips).

Фрагмент ДНК довжиною до 1 тис. пар основ, для якого відомо

його розташування в геномі, ампліфікується, і одноланцюгові про-

дукти ампліфікації пришивають до невеликої зони на поверхні пред-

метного скла мікроскопа. Скло розміром 2 × 2 см – ДНК-мікроарей –

покрито сіткою ~6 тис. таких мікроплям, кожна з яких містить

ДНК певної геномної ділянки. На поверхні ДНК-чіпів синтезуються

короткі (до 20 нуклеотидів) олігонуклеотиди: кілька олігонуклеоти-

дів, які походять із однієї ділянки геному, синтезуються поряд.

Таким чином, невелика зона містить ДНК, комплементарну індиві-

дуальній геномній ділянці.

Одну з типових схем використання мікроарея зображено на

рис. 11.14. Сумарна мРНК, отримана з клітин певного типу, вико-

ристовується як матриця в реакції зворотної транскрипції. Поряд

зі звичайними, до реакційної суміші додається флуоресцентний

аналог одного з NTP.

Сумарна мРНК

кДНК

НК-мікроарей

Зворотна транскриптаза +

флуоресцентний аналог

NTP

Рис. 11.14. Аналіз сумарної мРНК

за допомогою ДНК-мікроарея

Розділ 11. Методи молекулярної біології

353

У результаті отримують препарат флуоресцентно міченої кДНК.

Після гібридизації з цією кДНК мікроарей аналізують за допомогою

флуоресцентного мікроскопа: наявність флуоресцентної плями свід-

чить про активність певного гена, інтенсивність флуоресценції –

про рівень цієї активності.

Експерименти такого типу дозволяють з'ясувати зміни загальної

програми експресії генів при змінах зовнішніх умов, активність різ -

них генів у різних тканинах багатоклітинного організму, зміни ак-

тивності груп генів у процесі диференціювання клітин. Техніка

ДНК-мікроареїв широко використовується також у дослідженнях

ДНК-білкових взаємодій.

Методи дослідження ДНК-білкових взаємодій

Вивчення тонких механізмів білково-нуклеїнових взаємодії є зде-

більшого доступним для різноманітних фізичних методів (див. ни-

жче). У цьому підрозділі описано підходи, що дозволяють встанови-

ти сам факт взаємодії та з'ясувати локалізацію певного білка на

ДНК in vitro та in vivo.

Гель-електрофорез білково-нуклеїнових комплексів

Оскільки рухливість макромолекул при електрофорезі залежить

від їхньої маси та форми , факт зв'язування певного білка з певним

фрагментом ДНК легко встановити за допомогою шифт-тесту (shift

assay). Принцип методу є дуже простим: ДНК-білковий комплекс

(якщо він утворюється) суттєво гальмується в гелі порівняно з віль-

ною ДНК, що приводить, як правило, до наявності двох смуг ДНК

після електрофорезу (рис. 11.15, а ).

При цьому, якщо білок, як це часто буває, вигинає ДНК у сайті

взаємодії, рухливість комплексу буде залежати від позиції білка на

фрагменті ДНК: максимальну рухливість мають комплекси, у складі

яких білок розташований на одному з кінців фрагмента, мінімальну –

ті, де білок займає центральну позицію (рис. 11.15, б ). Причиною цієї

закономірності є те, що довші (і тому рухливіші) кінцеві ділянки віль-

ної ДНК легше проходять через пори гелю. Відповідно, це дозволяє

оцінити локалізацію білка відносно кінців фрагмента ДНК або розді-

лити комплекси, що розрізняють за такою локалізацією.

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

354

Білок

Комплекс

Вільна ДНК

б а

Рис. 11.15. Гальмування рухливості ДНК-білкового комплексу

при гель-електрофорезі (а) та залежність ступеня гальмування

від позиції білка на ДНК у випадку вигину ДНК на поверхні білка (б)

Футпринтинг

Іншим підходом, який використовують для точної локалізації білка

на фрагменті ДНК, є футпринтинг ДНК (DNA footprinting). Принцип

методу схематично зображено на рис. 11.16. Кінець одного з ланцюгів

мітять радіоактивною міткою. Зазвичай

Р у складі фосфатного за-

лишку приєднується до попередньо дефосфорильованих 5'-кінців полі-

нуклеотидкіназою, після чого один із кінців фрагмента відрізається ре-

стриктазою (аналогічно відповідному етапу процедури на рис. 11.12).

Якщо внести в цю ДНК обмежену кількість одноланцюгових розрізів

(наприклад, один розріз на фрагмент у середньому), отримаємо випад-

ковий набір мічених фрагментів різної довжини, який можна роз-

ділити за допомогою гель-електрофорезу в денатуруючих умовах.

Як агенти, що вносять розриви, найчастіше використовують ДНКазу І

або гідроксил-радикали: обидва агенти розрізають один з ланцюгів

ДНК через маленький жолобок. У випадку, коли з фрагментом ДНК

взаємодіє білок, ДНК виявляється захищеною в сайті взаємодії: на ге-

лі після електрофорезу можна побачити зону, де відсутні смуги ДНК,

або інтенсивність смуг є нижчою порівняно з контрольним результа-

том деградації вільної ДНК. Довжини верхньої та нижньої смуг, які

оточують цю зону, є межами сайта взаємодії відносно мітки.

Аналогічний підхід у комбінації з блот-гібридизацією (так зване

непряме кінцеве мічення) дозволяє встановити ступінь захищеності ДНК

білками в конкретних геномних зонах. Першим етапом процедури

є обмежена деградація ДНК нуклеазою у клітинних ядрах. Після цього

Розділ 11. Методи молекулярної біології

355

виділяють сумарну ДНК і обробляють її рестриктазою: у результаті пре-

парат містить фрагменти ДНК від рестриктного сайта до місця розрізу

нуклеазою. Усі ці фрагменти розділюють шляхом електрофорезу, здійс-

нюють блотинг і обробляють нітроцелюлозний фільтр радіоактивно

міченим зондом до певної ділянки генома. На авторадіограмі візуалізу-

ються (або ні, якщо ДНК захищена білком) фрагменти ДНК з цієї зони.

Радіоактивна

мітка

Одноланцюгові

розрізи

Білок

Гель-електрофорез

у денатуруючих

умовах

НК

Рис. 11.16. Футпринтинг ДНК

у складі білково-нуклеїнового комплексу

Імунопреципітація хроматину

Метод імунопреципітації (ChIP – Chromatin ImmunoPrecipitation)

є потужним засобом установлення наявності білка на певній ділянці

ДНК in vivo (рис. 11.17). Для цього клітини обробляють формальдегідом

із метою ковалентного пришивання всіх білків до ДНК. Далі здійснюють

лізис клітин, виділяють ДНК і частково її фрагментують. Ковалентні

ДНК-білкові комплекси осаджують антитілами, специфічними до конк-

ретного білка (або пропускають через колонку, на якій іммобілізовані

антитіла). Отримані комплекси руйнують, видаляючи зшивку хімічним

шляхом, і аналізують ДНК, яка була зв'язаною у клітині з даним білком.

Одним із варіантів аналізу може бути ампліфікація ДНК за допомо-

гою ПЛР і наступне секвенування або гібридизація з міченим зондом.

Якщо, наприклад, зробити зшивання в різні моменти після регулято-

рного сигналу, то можна встановити послідовність зв'язування білків

з регуляторними ділянками промотора певного гена.