Петрищев Н.Н., Папаян Л.П. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний

Подождите немного. Документ загружается.

ОТЕЧЕСТВЕННОЕ И ИМПОРТНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА

Санкт-Петербургский государственный медицинский

университет имени академика И.П.Павлова Российский НИИ гематологии и трансфузиологии

Гемостаз

Физиологические механизмы,

принципы диагностики основных форм

геморрагических заболеваний

Учебное пособие

Под редакцией: проф. Н.Н.Петрищева проф. Л.П.Папаян

Санкт-Петербург 1999

УДК 616-005.2:616.151.5-07

Авторский коллектив:

Т.В. Вавилова, О.Г. Головина, М.С. Зайнулина, В.И. Иванов, И.В.

Миндукшев, Л.П. Папаян, Н.Н. Петрищев, А.С. Шитикова, В.Л. Эмануэль.

Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики

основных форм геморрагических заболеваний. /Под ред. Н.Н.Петрищева,

Л.П.Папаян.

ISBN 0340-6245

В учебном пособии изложены современные представления о меха-

низмах гемостаза, описаны наиболее доступные методы исследования

тромбоцитарных, плазменных и сосудистых компонентов системы гемостаза,

а также ряд информативных методов, которые еще не нашли широкого

применения в клинических лабораториях. Большое внимание уделено

алгоритмам диагностики нарушений гемостаза и вопросам обеспечения

качества лабораторных исследований.

Пособие предназначено для врачей-лаборантов, специализирующихся в

области гемостазиологии, а также может быть полезным и врачам других

специальностей.

УДК 616-005.2:616.151.5-07

ISBN 0340-6245

Настоящее пособие рассчитано на тех, кто решил ознакомиться с

физиологией и патологией системы гемостаза и основными методами её

исследования. Эти знания требуются не только врачам клинической и

лабораторной диагностики. Они необходимы клиницистам любого профиля,

поскольку нет такой специальности, при которой врач не сталкивался бы с

больными, страдающими кровоточивостью или тромбозами. Понимание

основ гемостаза позволяет лечащему врачу назначить больному адекватное

лабораторное исследование и соответственно патогенетическое лечение.

Преподавание основ физиологии и патологии гемостаза,

практическое обучение методам оценки сосудисто-тромбоцитарных и

коагуляционных реакций проводятся на специальном цикле

"КЛИНИЧЕСКАЯ ГЕМОСТАЗИОЛОГИЯ" факультета постдипломного

образования СПб Государственного

Медицинского Университета им. акад. И.П. Павлова. Обучение

проходит на базе лаборатории свертывания крови Российского НИИ

гематологии и трансфузиологии. После окончания цикла слушатели

получают удостоверение о повышении квалификации; сдавшим

сертификационный экзамен выдается сертификат врача по клинической

и лабораторной диагностике. Продолжительность цикла 2,5 мес., для

иногородних слушателей возможно очно-заочное обучение.

ЗАПИСЬ НА ОБУЧЕНИЕ – ПО ТЕЛ. 277-35-82 (ЛАБОРАТОРИЯ

СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ).

На базе лаборатории свертывания крови Российского НИИ

гематологии и трансфузиологии проводится также исследование

больных, с целью установления причины повышенной кровоточивости

или повышенной склонности к развитию тромбозов (тромбофилии).

Запись на исследование системы гемостаза проводится по телефону 277-

35-82 с 10 до 16 часов по рабочим дням.

ПОМНИТЕ, ЧТО КАЧЕСТВЕННАЯ ДИАГНОСТИКА – ОСНОВА ЭФФЕКТИВНОГО ЛЕЧЕНИЯ!

МЕХАНИЗМЫ ГЕМОСТАЗА

Тромбоцитарное звено гемостаза

Адгезия и агрегация тромбоцитов

Остановка кровотечения при повреждении стенки сосуда начинается с

сосудисто-тромбоцитарных реакций. Уже через доли секунд после травмы в

зоне повреждения наблюдается спазм сосудов и развивается цепь реакций

кровяных пластинок, которая приводит к образованию тромбоцитарной

пробки. Прежде всего, происходит прилипание (адгезия) тромбоцитов к

коллагеновым волокнам, находящимся в сосудистой стенке, к другим

адгезивным белкам субэндотелия (фактору Виллебранда, фибронектину,

витронектину, ламинину, тромбоспондину), а также к поступающему из

плазмы фибриногену (рис. 1). Из адгезировавших тромбоцитов

высвобождается аденозиндифосфат (ADP) - важнейший индуктор агрегации

кровяных пластинок. Под влиянием ADP циркулирующие кровяные

пластинки присоединяются к уже фиксированным на раневой поверхности и

друг к другу (агрегируют). Процесс агрегации вызывается также всеми

активными субстанциями, которые высвобождаются в области повреждения

не только из стимулированных при адгезии тромбоцитов, но и из форменных

элементов крови и эндотелия (например, ADP из гемолизированных

эритроцитов, активирующий пластинки фактор - PAF и ADP из стенки

сосудов). Агрегация индуцируется и первыми малыми количествами

тромбина, генерируемого по внешнему и внутреннему пути коагуляции. В

результате в процесс вовлекается все большее число тромбоцитов,

поступающих в зону повреждения. Однако на данной стадии, определяемой

как стадия обратимой или первичной агрегации, связи между

тромбоцитами еще не прочные, и часть из них может отрываться током

крови.

Позже на стадии необратимой или вторичной агрегации агрегаты

уплотняются, становятся непроницаемыми для крови и плотно закрывают

имеющийся дефект в сосудах малого и среднего размера. Таким путем

достигается первичный гемостаз, т.е. ранняя начальная остановка

кровотечения за счет спазма сосудов и образования тромбоцитарной пробки.

Поэтому первичный гемостаз называют также сосудисто-тромбоцитарным.

Уже на ранних стадиях тромбоцитарных реакций стимулируется коа-

гуляционная активность тромбоцитов - в плазматической мембране ста-

новятся доступными коагуляционно активные фосфолипиды, которые

принимают существенное участие во внутреннем пути свертывания крови. В

связи с этим в дальнейшем на основе тромбоцитарной пробки формируется

фибриновый сгусток. Тромбоцитарно-фибриновая гемо-статическая пробка

может противостоять повышенному кровяному давлению после

восстановления тока крови в поврежденных сосудах среднего размера. Таким

образом, на этой стадии осуществляется окончательный, или вторичный

гемостаз.

Необходимо остановиться на основных функциональных, биохими-

ческих и молекулярных процессах, которые развиваются в ходе осуще-

ствления тромбоцитарного гемост аза, поскольку без понимания механизма

гемостатических реакций, протекающих в организме, невозможно адекватно

интерпретировать результаты исследований при патологии.

В фазе адгезии прилипание кровяных пластинок к субэндотелиаль-

ным структурам, прежде всего к коллагену (рис.1), различается по своему

механизму в зонах циркуляции с малой скоростью тока (и низким напря-

жением сдвига) и с большой скоростью тока крови (и высоким напряжением

сдвига). При низком напряжении сдвига (в случае повреждения стенок

крупных артерий, вен) тромбоциты присоединяются к коллагену

непосредственно через коллагеновые рецепторы их плазматической

мембраны - гликопротеины la-lla (GPIa-lla). При высоком напряжении сдвига

(при повреждении мелких артерий и артериол) прилипание кровяных

пластинок к коллагену опосредовано высокомолекулярным кофактором

адгезии - фактором Виллебранда (vWF), который в зоне повреждения

поступает из плазмы, высвобождается из эндотелия, секретируется

тромбоцитами. vWF при большой скорости тока крови способен соединяться,

с одной стороны, с коллагеном, а с другой, - с тромбоцитарным рецептором

GPIb. Таким путем формируется «ось адгезии»: коллаген -vWF - GPIb.

Генетически обусловленное отсутствие или снижение числа названных

адгезивных рецепторов в тромбоцитарной плазматической мембране

приводит к развитию геморрагического диатеза из-за нарушения адгезии (и

как следствие - последующих стадий первичного гемостаза). Однако

подобные мембранные дефекты (дефицит GPIb при болезни Бер-нара-Сулье

и особенно дефицит GPIa-lla) наблюдаются достаточно редко. В отличие от

этого нарушение фазы адгезии из-за недостаточности или дефекта кофактора

адгезии (vWF) является причиной наиболее часто встречающегося

врожденного геморрагического заболевания - болезни Виллебранда.

Рис. 1. Тромбоцитарное звено гемостаза

Сокращения, применяемые в рис.1:

АА-арахидоновая кислота ADP - аденозиндифосфат

Са

- ионы кальция экзогенные по отношению к тромбоцитам

Са

, - свободный цитоплазматический

Са

тромбоцитов

COG - циклооксигеназа

DG-диацилглицерол

DTS- плотная тубулярная система

Fbg - фибриноген

FN - фибронектин

GP - гликопротеины: GP llb-llla,GP la-lla,GP Ib

5НТ - серотонин

1Рз- инозитол 1,4,5-трисфосфат

MLCK - киназа легкой цепи миозина

Р47 - плекстрин

PC - фосфатидилхолин

РЕ - фосфатидилэтаноламин

PG - простагландины (G

)

PI - фосфатидилинозитол

PIP - фосфатидилинозитол 4-фосфат

РIР

- фосфатидилинозитол 4,5-бифосфат

РКС - протеинкиназа С

PLA

-фосфолипаза А2

PLC - фосфолипаза С

PS - фосфатидилсерин

TFPI -ингибитор пути тканевого фактора

TSP - тромбоспондин

ТХА2 - тромбоксан A

TXSyn - тромбоксансинтетаза

VN - витронектин vWF фактор Виллебранда

I , II , III - положительные обратные связи активации тромбоцитов

Для оценки реакций адгезии тромбоцитов в зонах с высоким

напряжением сдвига протекающей крови используют антибиотики

ристомицин и ристоцетин, которые по своим адгезивно-агрегационным

свойствам оказались близкими к субэндотелиальным структурам сосудов, т.е.

для взаимодействия их с тромбоцитами необходим и vWF. и GPIb. Поэтому

состояние основных компонентов, участвующих в адгезии в области

микроциркуляции, может быть оценено на основании агрегации кровяных

пластинок in vitro с этими антибиотиками - она снижена или отсутствует как

при болезни Виллебранда, так и при болезни Бернара-Сулье. Участие

мембранных GPIa-IIa во взаимодействии с коллагеном в зонах с низким

напряжением сдвига может быть определено в агрегационных исследованиях

с коллагеном.

Следующая стадия тромбоцитарных гемостатических превращений -

первичная агрегация - является результатом последовательных реакций

активации кровяных пластинок в зоне повреждения. Стимуляция их

вызывается и химическими, и физическими воздействиями на плазмати-

ческую мембрану. Тромбоциты могут активироваться при действии на их

поверхность гемодинамических сил, возникающих при турбулентном токе

или при повышении скорости движения крови в местах сужения просвета

сосуда. Но большее значение имеет химическая мембранная активация,

опосредованная рецепторами. Так, описанное взаимодействие

субэндотелиальных субстанций с рецепторами пластинок в фазе адгезии

приводит к дальнейшей передаче сигнала активации внутрь клетки. Кроме

того, как указывалось выше, тромбоциты активируются при действии на них

целого ряда растворимых естественных агонистов, которые присутствуют в

зоне повреждения. Важно подчеркнуть, что способностью стимулировать

кровяные пластинки обладают в основном те субстанции, для которых в

плазматической мембране имеются соответствующие рецепторы.

Исключением являются немногие вещества, способные проникать через

мембрану - арахидоновая кислота, ионофор А23187.

Естественные агонисты разделяют на сильные и слабые, отличающиеся

по механизму вызываемых ими реакций активации. К сильным агонистам

относят коллаген и тромбин в больших дозах. Для осуществления их

стимулирующего действия не нужны дополнительные линии усиления

активации - так называемые положительные обратные связи (рис.1).

Напротив, для эффекта слабых агрегирующих агентов, т.е. всех остальных

естественных агонистов при больших и средних дозах (а также сильных

агонистов в малых дозах) необходимы эти сложные обратные пути

активации.

Взаимодействие слабых агрегирующих агентов со своими рецепторами

плазматической мембраны, прежде всего, приводит к развитию доступности

фибриногеновых рецепторов - GPIIb-IIIa. После этого фибриноген, который

является симметричной молекулой, в присутствии ионов Са

связывается с

рецепторами двух близлежащих тромбоцитов. Необходимое для

осуществления связей столкновение отдельных пластинок достаточно часто

происходит в условиях тока крови в организме или в перемешиваемой

плазме в агрегометре. При соблюдении всех этих дополнительных условий

именно образование фибриногеновых мостов между рецепторами

тромбоцитов обусловливает первичную агрегацию. Поэтому основными

причинами ее нарушения являются снижение (или отсутствие) в

тромбоцитарной мембране GPIIb-IIIa (при врожденном наследственном

заболевании - тромбастении Гланцмана) и полное отсутствие фибриногена -

плазменного кофактора агрегации (при врожденной афибриногенемии).

Тромбоцитарная секреция и вторичная агрегация. Первичная аг-

регация - это только одна из начальных ступеней в цепи гемостатических

реакций тромбоцитов, и она не способна обеспечить эффективный гемостаз.

Для этого необходимо осуществление всех последующих стадий и

финальных функциональных реакций клетки - реализации ее коагуляционной

активности, секреции, образования вторичных консолидированных

агрегатов, непроницаемых для крови. Стимулы слабых агонистов для этого

не достаточно сильны и для завершения гемостаза требуется включение ряда

дополнительных механизмов активации с развитием положительных

обратных связей, что «происходит следующим образом (рис.1). Изменения,

вызываемые в плазматической мембране при взаимодействии рецепторов с

экзогенными слабыми агонистами, при контакте мембран в процессе

первичной агрегации и связи их с фибриногеном, в результате последующего

начального повышения уровня свободного ионизированного

цитоплазматического кальция (Са

) приводят к активации мембранной

фосфолипазы А

(PLA

). PLA

, в свою очередь, индуцирует цепь реакций

простагландин-тромбоксановой системы, которая начинается с

высвобождения из мембранных фосфолипидов арахидоно-вой кислоты и

завершается образованием таких активных продуктов как лабильные

простагландины (PGG

,PGH

) и особенно тромбоксан А

(ТХА

). Последний

является вазоконстриктором, ионофором и эндогенным агонистом агрегации.

Выделяясь из тромбоцитов и связываясь с рецепторами плазматической

мембраны (как данной клетки, так и других кровяных пластинок,

приносимых током крови), ТХА

и PGG

с PGH

осуществляют первую

положительную обратную связь, т.е. рекрутируют дополнительное

количество фибриногеновых рецепторов, расширяют плацдарм агрегации и

усиливают сигнал активации, передаваемый к внутренним эффекторным

структурам клетки. При этом большое значение имеет способность ТХА

активировать фосфолипазу С (PLC) и включать полифосфоинозитидный путь

активации. ТХА

является также ионофором и вызывает выделение в

цитоплазму ионов Са

из плотной тубулярной системы (DTS), где они

находятся в интактных кровяных пластинках. Повышение уровня Са

создает необходимые условия для всех Са

-опосредованных ферментных

реакций финальных стадий тромбоцитарного гемостаза. К этим реакциям

прежде всего относится стимуляция тромбоцитарной актомиозиновой

системы. Для последней, помимо повышения концентрации Са

, необходима

стимуляция процессов фосфорилирования белков этой системы, что также

является результатом полифосфоинозитидного пути активации (рис.1). Этот

путь начина-.ется со стимуляции фосфолипазы С (PLC) и завершается

активацией протеинкиназы С (РКС) с образованием инозитолтрисфосфата

(1Р

), способного, как и ТХА

, повышать уровень Са

. PLC может быть

стимулирована как в процессе первичной агрегации, так и прямо при

взаимодействии сильных агонистов с их рецепторами в плазматической

мембране. Необходимо отметить, что следующая обратная связь

осуществляется именно через взаимодействие сильнейшего тромбоцитарного

активатора - тромбина, который генерируется по внутреннему пути с

участием фосфолипидов тромбоцитов. Фосфорилирование белков

тромбоцитарной сократительной системы с участием активированной РКС,

энергетическое обеспечение процесса и само сокращение актомиозина

принципиально осуществляются теми же механизмами, что и в

сократительной системе гладкомышечных клеток. Сокращение

тромбоцитарного актомиозина имеет два важнейших последствия - благодаря

этому процессу осуществляются секреторные реакции кровяных пластинок и

происходит уплотнение тромбоцитарно-фибриновой пробки.

Тромбоцитарные секреторные реакции имеют большое значение для

завершения эффективного гемостаза. Сокращение актомиозина обеспечивает

передвижение гранул хранения, контакт их мембран с мембранами открытой

канальциевой системы (OCS) и плазматической, а также повышение

внутриклеточного давления и выброс содержимого этих гранул в

окружающую среду.

Из 8 гранул (плотных телец) высвобождаются гемостатически актив-

ные субстанции, необходимые для усиления активации и агрегации

тромбоцитов в зоне сосудистого повреждения. Через секрецию ADP,

серотонина, адреналина после их связи с соответствующими мембранными

рецепторами пластинок реализуется важнейшая вторая положительная

обратная связь, которая вместе с первой, делает возможной развитие

вторичной агрегации при действии слабых агонистов.

Из а гранул секретируется более 30 протеинов, которые играют

большую роль не только в гемостатических реакциях, но и в других

физиологических и патологических процессах организма. Такие белки этих

гранул как фибриноген, фактор V, XIII, тромбоцитарный фактор 4 и др.,

принимают участие в процессах коагуляции; адгезивные протеины (фиб-

риноген, фактор Виллебранда, тромбоспондин, фибронектин, витронек-тин) -

в дальнейшем развитии процесса адгезии и укреплении фибрино-геновых

связей агрегировавших тромбоцитов; фактор роста тромбоцитов (PDGF -

platelet derived growth factor) - в репарации поврежденных стенок сосудов, а в

патологических условиях - в развитии атеросклероза.

Из у гранул (лизосом) высвобождаются лизосомальные энзимы,

принимающие участие в реканализации сосуда после завершения гемостаза.

Итак, на основании изложенного понятно, почему рассмотренная фаза

агрегации называется вторичной (в основе ее лежит более позднее

высвобождение из тромбоцитов агрегирующих агентов) и необратимой

(тромбоциты не могут отделяться от агрегата, поскольку они максимально

сближены вследствие сокращения актомиозиновых структур, а

фибриногеновые связи укреплены секретированными адгезивными про-

теинами). Фазу необратимой агрегации называют также фазой секреции и

необратимой вторичной агрегации, т.к. секреторные реакции достигают в это

время своей кульминации и являются основой развития этой фазы агрегации.

О значении фазы секреции может, свидетельствовать нередко на-

блюдаемая и приводящая к кровоточивости недостаточность секреторного

процесса, которая особенно часто бывает приобретенной, т.е. возникает в

результате инфекционных, токсических, лекарственных, иммунных,

радиационных воздействий. Среди тромбоцитопатий высвобождения

выделяют два основных вида: функциональную тромбоцитопатию

высвобождения при нарушении внутриклеточной передачи сигнала

активации, чаще всего в простагландин-тромбоксановой системе, и

структурную, связанную с неполноценностью гранул хранения - со сни-

жением их числа и/или наполнения хранимыми в них субстанциями.

Определение механизма нарушения секреции достаточно сложно, т.к.

требует проведения тонких биохимических исследований. В клинических

условиях факт нарушения тромбоцитарной секреции обычно устанавливают

с помощью агрегометра на основании оценки характера агрегационных

кривых с несколькими индукторами агрегации. О снижении или отсутствии

секреции свидетельствует уменьшение или отсутствие второй волны

агрегации с оптимальными средними дозами всех агрегирующих агентов и

единственной волны агрегации с коллагеном, т.к. эти агрегационные

феномены опосредованы секреторным процессом.

Поскольку актомиозиновые филаменты пересекают всю цитоплазму

тромбоцита и с внутренней стороны мембраны связаны с теми же

трансмембранными гликопротеинами IIb-IIIa, с которыми с наружной

стороны соединены межтромбоцитарные фибриногеновые (фибриновые)