Петрищев Н.Н., Папаян Л.П. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний

Подождите немного. Документ загружается.

Как в момент получения крови, так и в ходе последующих манипуля-

ций допускается контакт крови лишь с несмачиваемыми поверхностями. Для

предотвращения контактной активации тромбоцитов необходимо

производить силиконирование стеклянных поверхностей. Более эффективно

использование в этих целях посуды и оборудования из неактивных в

отношении клеток крови полимерных материалов.

Индукторами агрегации, наиболее часто используемыми при анализе

агрегации тромбоцитов, являются аденозиндифосфат (ADP), и коллаген.

Кроме того, для проверки функциональных отклонений в действии фактора

Виллебранда используется антибиотик ристоцетин/ристомицин. При

изучении дефицита пула хранения наиболее полезна арахидоновая кислота,

для проверки на максимальное выделение хранимых нуклеотидов - тромбин.

Концентрации агонистов для исследования агрегации в цельной крови

следует выбирать на пороговых значениях - т.е. в минимальных значениях,

дающих полную агрегационную волну. Обычно анализы образцов

проводятся при следующих конечных концентрациях индукторов:

Индуктор агрегации Конечная концентрация

ADP 2-10 мюM

Коллаген 0,5-4,0 мкг/мл

Ристоцетин 1,0-1,4мг/мл

Тромбин 1 единица/мл

Арахидоновая кислота 1х10

—3

Оптимальное соотношение объёмов индуктора агрегации и пробы

составляет 1:9-1:12.

Параметры агрегации тромбоцитов, определяемые при исследовании в

общем случае агрегатограммы, получаемые в цельной крови, имеют вид

сходный с кривыми агрегации, записанными в богатой тромбоцитами плазме.

В связи с этим, их анализ проводится по общепринятым характерным точкам

(рис.8).

Рис.8. Характерные параметры типичной агрегатограммы

В зависимости от условий и задач исследования возможно определение

следующих параметров:

- интенсивность (амплитуда) первичной агрегации, Ом;

- интенсивность (амплитуда) вторичной волны агрегации, Ом;

- интенсивность (амплитуда) максимальной агрегации, Ом;

- время начала дезагрегации, мин;

- время начала вторичной агрегации, мин;

tg a

, - максимальная скорость первичной агрегации, Ом/мин;

tg а

- максимальная скорость вторичной агрегации, Ом/мин;

Дополнительно измеряется латентный период. При его наличии до-

пускается определение амплитуды процесса и его максимальной скорости к

5-6 минуте от момента ввода стимулятора, когда уже ясно видны

чувствительность к дозе и интенсивность агрегации.

Оценка результатов исследования при подобии, в целом, агрегато-

грамм, получаемых в цельной крови на импедансном агрегометре и в богатой

тромбоцитами плазме на оптических приборах, в параметрах процесса

агрегации в указанных биологических субстратах имеются и существенные

различия. Для цельной крови отмечено замедление агрегации, по сравнению

с плазмой: время достижения максимальной интенсивности увеличивается до

10-15 минут. При этом наблюдается значимая корреляционная связь между

амплитудой и максимальной скоростью агрегации: r=0,96 (р<0,001) и r=0,86

(р<0,01) в случаях индукции процесса ADP и коллагеном, соответственно.

Последнее обстоятельство позволяет в условиях острого дефицита времени

сократить длительность анализа, ограничиваясь измерением только

максимальной скорости агрегации.

В цельной крови коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов

начинается сразу после ввода агониста, без латентного периода, характерного

для фотометрических измерений в богатой тромбоцитами плазме. При этом

амплитуда процесса в среднем в 2 раза превышает интенсивность агрегации,

вызываемой ADP в той же крови (конечные концентрации индукторов 4,0

мкг/мл и 5,0 (μM, соответственно).

Как и в богатой тромбоцитами плазме, ADP, при достаточно низкой

концентрации, вызывает в образцах цельной крови двухволновые агре-

гатограммы. Получение второй фазы зависит от концентрации индуктора,

которая меняется от больного к больному, и возможно примерно в 10%

случаев.

При анализе кривых агрегации важно учитывать относительную сте-

пень агрегации при воздействии различных агонистов. Так, у страдающих

болезнью Виллебранда нормальные агрегация тромбоцитов и выделение

адениловых нуклеотидов наблюдаются при воздействии коллагена, ADP и

арахидоновой кислоты, в то же время они незначительны или совсем

отсутствуют при стимуляции ристоцетином. У больных тромбасте-нией

кровяные пластинки не реагируют нормально при воздействии большинства

индукторов. Однако тромбоциты способны синтезировать достаточно

простагландинов под воздействием арахидоновой кислоты, чтобы вызвать

нормальное выделение ADP и в отсутствие агрегации! Так называемая

«аспирино-подобная» патология отличается малой степенью или полным,

отсутствием агрегации или выделения ADP в ответ на воздействие

арахидоновой кислоты. Кроме того, отмечается снижение реакции на

стимулирование ADP, коллагеном, причём выделение в случае

аденозиндифосфата полностью отсутствует. Реакция на введение

ристоцетина непостоянна, при малом или полностью отсутствующем вы-

делении ADP.

Интересные результаты получены при исследовании агрегационного

статуса тромбоцитов в цельной крови в условиях гиперлипидемии. Так, при

умеренной гинерхолестеринемии наблюдается значимая положительная

корреляция между амплитудой индуцированной агрегации тромбоцитов (в

случае стимуляции ADP и коллагеном) и уровнем фибриногена в плазме

крови. У гиперлипидемических больных, перенесших острый инфаркт

миокарда, повышенная коллаген-индуцированная агрегация в отличие от

богатой тромбоцитами плазмы сохраняется в течение длительного периода

(до 24 месяцев). Выявлено и достоверное повышение агрегационной

активности кровяных пластинок на указанном индукторе у лиц возрастной

группы 49-65 дет по сравнению с группой 35-48 лет, что хорошо коррелирует

с возрастанием частоты атеросклеротического поражения сосудов и ИБС в

пожилом возрасте.

Приведенные факты свидетельствуют о высоких диагностических и

информационных возможностях оценки функционального состояния

тромбоцитов в цельной крови.

Следует еще раз подчеркнуть, что для получения наилучших ре-

зультатов, пациент не должен есть и курить в течение минимум 8 часов до

момента проведения анализов агрегации тромбоцитов. Кроме того,

испытуемый должен избегать принятия аспирина и других лекарств, из-

вестных влиянием на агрегацию кровяных пластинок, в течение 10-12 дней

до времени исследования. Необходимо помнить, что источниками ошибок

могут быть и реактивы, в частности, различна эффективность коллагеновых

препаратов. Поэтому все реактивы периодически должны проверяться по

обычному донорскому контролю.

Определение адгезии кровяных пластинок

Адгезия тромбоцитов к элементам сосудистой стопки является на-

чальным этапом в процессах гемостаза, артериального тромбоза и ате-

росклероза, что определяет существенное информативное значение этого

показателя при лабораторной диагностике и оценке эффективности

лекарственной терапии широкого ряда гематологических и сердечно-

сосудистых заболеваний.

Существующие методы опенки адгезии кровяных пластинок либо

крайне сложны и используются поэтому только в исследовательских целях,

либо недостаточно физиологичны (адгезия к стеклу) и специфичны

(определяют, наряду с адгезией, агрегацию пластинок). Кроме того, слабая

воспроизводимость делает их малопригодными для рутинной лабораторной

практики.

В связи с этим, представляет интерес разработанный в НИИ кар-

диологии (Санкт-Петербург) количественный метод определения адгезии

тромбоцитов в цельной крови с помощью импедансного агрегометра.

Метод основан на регистрации изменений модуля комплексного со-

противления пробы крови, стабилизированной ЭДТА, под действием

коллагена (использование для предотвращения свертывания крови такого

хелатора кальция, как ЭДТА, исключает индуцирование коллагеном

процесса агрегации кровяных пластинок).

Измерения проводятся с соблюдением условий и количественных

соотношений, стандартных для определения агрегации тромбоцитов. Для

характеристики процесса адгезии оценивают его амплитуду в ОМ.

При добавлении коллагена к стабилизированной ЭДТА (7,0 тМ)

цельной крови наблюдается изменение ее комплексного сопротивления в

виде характерной кривой, связанное с прилипанием тромбоцитов к

микрофибриллам коллагена (рис. 9А).

Рис.9. Адгезия (А) и агрегация (Б) тромбоцитов в крови одного донора.

Конечная концентрация коллагена 4,0 мкг/мл

В большинстве случаев отмечается продолжительная лаг-фаза процесса

(до 3 минут). За ней следует быстрое нарастание импеданса крови с выходом

на плато к 10-12 минуте. Аналогичные концентрации коллагена вызывают в

крови тех же доноров стабилизированной цитратом натрия, агрегацию

тромбоцитов с амплитудой в 2-3 раза превышающей величину адегезии (рис.

9Б). Чувствительность кровяных пластинок к фибриллярному коллагену

широко варьирует: пороговая концентрация препарата, инициирующая

процесс адгезии, колеблется у разных доноров от 4 до 20 мкг/мл крови.

Исследование влияния ацетилсалициловой кислоты на функцио-

нальную активность тромбоцитов (рис.10) показало меньшую степень

торможения аспирином процесса адгезии кровяных пластинок, чем их

агрегации.

Это свидетельствует о различных механизмах, участвующих в реа-

лизации этих двух важнейших проявлений функциональной активности

тромбоцитов.

Аналогичные результаты получены и при изучении ингибирующего

влияния RGD-содержащих пептидов, однако, их воздействие на процессы

адгезии и агрегации оказалось значительно эффективней. Именно

использование антагонистов тромбоцитарных рецепторов считается в

последние годы наиболее действенным путем предотвращения тромбо-

образования.

Рис.10. Влияние ацетилсалициловой кислоты на коллаген-индуцированные

агрегацию (1) и адгезию (2) тромбоцитов.

Конечная концентрация коллагена 4,0 мкг/мл.

По оси ординат - средняя амплитуда соответствующего процесса; по

оси абсцисс - концентрация ацетилсалициловой кислоты; (п=12)

Метод малоуглового светорассеяния

для оценки состояния тромбоцитов

Кинетика агрегации тромбоцитов является сложным многостадийным

процессом. При классической оценке агрегации в плазме богатой

тромбоцитами (БТП) по светопропусканию (метод Борна) наблюдается

двухстадийная кинетика, причем малые дозы агониста (ADP) вызывают

обратимую агрегацию, а последующее увеличение дозы приводит к по-

явлению второй стадии.

Эту кинетику, возможно, представить, в несколько упрощенном виде,

следующей схемой (рис.11). Агонисты вызывают повышение внутрикле-

точного кальция [Са

], (активируя Са

, каналы мембраны кровяных пла-

стинок и/или фосфоинозитольный цикл), что приводит к сферизации клеток

->N

). Увеличение [Ca

]j вызывает кальмодулин-опосредованную

активацию киназы легких цепей миозина (MLCK). Последующее фосфо-

рилирование цепей миозина приводит к образованию псевдоподий (N

-»N

Клетки с псевдоподиями способны при столкновении образовывать агрегаты,

первоначально - димеры (2 N

-»D).

Рис. 11. Трансформация тромбоцитов при их возбуждении:

No - диски, NS- сферизованные клетки, N

- клетки . с псевдоподиями,

(первые две стадии - shape change),

D - агрегаты (димеры), конечный процесс - свертывание (все клетки в

едином агломерате)

Кроме прямого прохождения этой цепи реакций, возможно форми-

рование двух петель обратной связи, при участии цАМФ или цГМФ в ка-

честве посредников. Эти соединения влияют на разные стадии процесса: так,

рост уровня цГМФ при участии NO-синтазы приводит к исчезновению

псевдоподий и дезагрегации клеток. Так или иначе, оба процесса вызывают

появление рефрактерных клеток (М

(

). Эти клетки должны отличаться

повышенным уровнем цАМФ и/или цГМФ, ингибирующее влияние которых

может быть преодолено повышенной дозой сильных агностов (ADP, тромбин

и т.д.).

Из этого сжатого рассмотрения видно, что начальной (ключевой)

реакцией тромбообразования, является активация тромбоцитов. Однако

метод Борна слабо чувствителен к этой стадии трансформации клеток.

На основе техники малоуглового светорассеяния, разработан новый

метод, позволяющий, регистрировать стадии активации и исследовать

агрегацию тромбоцитов при физиологической концентрации ионов калия (~1

тМ) (Патент Э.Ф. Деркачев, И.В. Миндукшев и др. Бюлл. изобретений, 10

(II), 298, 1998). Последовательность выполнения исследований методом

малоуглового светорассеяния следующая: плазма богатая тромбоцитами

(БТП) разбавляется в солевой среде (140 mM NaCI, 1 тМ СаС!

, 5 тМ tris-CI

(pH=7,8)) в 30-80 раз, с конечной концентрацией тромбоцитов <10

кл/мл.

Далее регистрацию малоуглового светорассеяния проводят на новом приборе

«Лайт-Скан» (НПФ «Люмекс», Санкт-Петербург). Принцип заключается в

следующем. Свет от лазерного источника направлен под углом 90° на

кювету. Регистрация интенсивности светорассеяния осуществляется

фотодиодами в углах: 2 и 12 градусов, сигналы с фотодиодов поступают в

первичный блок преобразования, а оттуда выводятся на самописец и ЭВМ.

Кювета содержит 5 мл среды с БТП. Агрегация, дезагрегация и

свертываемость регистрируется в 2 градусном углу, в 12 градусном угле

кроме этих процессов, регистрируются активация тромбоцитов с полезной

величиной сигнала 20-60%.

На рисунке 12 показана динамика изменения интенсивности в двух

углах: 2 (нижний график) и 12 градусов (верхний график), при действии

ADP. Видно, что до внесения кальция в среду ([Са

]

<30μМ) динамика

сигнала в угле 12 градусов имеет двухфазный характер, и отражает две

реакции: сферилизацию клетки (I) и образование псевдоподий (II). Агре-

гация, после внесения кальция (III) и свертывание (IV) (в некоторых случаях

спонтанная, или вызванная тромбином) регистрируется в обоих углах,

причем, для агрегации, наблюдается инвертирование сигнала в 12-ти

градусном угле при сохранении временных показателей в обоих углах

регистрации.

Достоинством метода является его достаточная простота применения, -

отсутствует процедура отмывания клеток от плазмы, возможность проводить

исследования при сильно разбавленной плазме (>50 раз) в присутствии

физиологической концентрации ионов кальция (-1 тМ), возможность

создания модельных сред с заданными параметрами.

Метод и новый прибор, в настоящее время, применяется в научных

исследованиях, фармакологии и клинической практике: в Институте Эво-

люционной Физиологии и Биохимии (Санкт-Петербург), в Государственном

Медицинском Университете (Санкт-Петербург), и Московском Гема-

тологическом Центре.

Рис.12. Изменение интенсивности светорассеяния суспензии в двух углах-2

градуса (нижний график) и 12 градусов (верхний) в ходе трансформации

представленной на рисунке. БТП-богатая тромбоцитами плазма.

Методы исследования ретрактильной активности тромбоцитов

Ретракция - активное сжатие, уплотнение фибринового сгустка в ре-

зультате сокращения актомиозиновых структур тромбоцитов, входящих в

тромбоцитарно-фибриновую сеть гемостатической пробки. Оценка рет-

ракции используется как один из важных показателей функциональной

активности кровяных пластинок, поскольку сократительные реакции раз-

виваются только в полноценных клетках с нормальным рецепторным

аппаратом, сократительной системой и энергетическим метаболизмом. В

клинической практике используют две группы методов. В первой объектом

исследования является сгусток из крови, во второй - сгусток из плазмы.

Особенность оценки результатов исследования ретракции сгустка

крови связана с тем, что сокращение сгустка находится в прямой зави-

симости от ретрактильной, сократительной, активности каждого тромбоцита

и от их концентрации, и в обратной - от числа других форменных элементов

крови, прежде всего эритроцитов, уровня фибриногена, интенсивности

процесса фибринообразования. Это, с одной стороны, приближает условия

исследования in vitro к ситуации, имеющейся в организме, но, с другой, к

сожалению, позволяет оценивать в этих методах ретрактильную активность

кровяных пластинок только при условии нормальных значений всех других

перечисленных переменных параметров, влияющих на конечный эффект

сокращения.

Исследование ретракции сгустка крови.

В большинстве клинических методов исследования ретракции сгустка

крови степень ретракции оценивают по объему выделившейся при этом

процессе сыворотки. В предлагаемом методе исследование проводится в

специальном аппарате, который может быть изготовлен стеклодувом из

подручных средств (рис.13). Широкая часть аппарата, плотно закрываемая

резиновой пробкой, сделана из верхней трети центрифужной пробирки и

имеет у перехода в измерительную часть боковое отверстие для вливания

крови. Измерительная часть, припаянная к верхней, представляет собой

отрезок 5-миллилитровой пипетки (объемом на один мл), который запаян

снизу на уровне одного из делений. В пробку вставлен стеклянный якорек в

виде грибка; глубина его погружения в пробку рассчитывается так, чтобы

при плотно закрытом аппарате поверхность площадки якорька находилась у

верхнего уровня одного мл крови, налитой в широкую часть аппарата.

Puc 3. Аппарат для измерения в динамике ретракции сгустка крови

После свертывания крови в основном положении аппарата якорь удер-

живает сгусток у пробки.

Техника исследования. 1 мл венозной нестабилизированной крови

быстро вливают с помощью мерной пипетки через широкую часть аппарата,

который в этот момент перевернут измерительной частью вверх. После

полного свертывания крови аппарат переворачивают мерной частью вниз и в

вертикальном положении помещают в термостат при температуре 37°С.

Количество выделившейся сыворотки определяют или в динамике, на 20, 30,

40-й минуте после свертывания крови, или однократно в наиболее

оптимальное для выявления недостаточности ретракции время - на 30-й

минуте (табл.4). В поздние сроки, особенно через час и больше, из сгустка

выделяется сыворотка вследствие фибринолиза, что маскирует результаты

ретрактильного процесса.

Поскольку при значительном изменении у больного показателя ге-

матокрита количество выделившейся сыворотки зависит от степени этого

отклонения, оценку ретракции сгустка проводят по процентному отношению

количества выделившейся сыворотки в указанные интервалы времени к

исходному объему плазмы; последний определяется по гема-токритному

показателю больного.

Таблица 4

Пределы нормальных колебаний показателей ретракции сгустка крови

у взрослых людей в различные периоды после свертывания

Процентное отношение объема выделившейся сыворотки

к исходному объему плазмы исследуемого образца крови:

Время оценки по-

сле свертывания

крови (мин)

пределы колебаний X

20 24-60 42

30 32-72 52

40 44-79 62

Недостатком данного метода, как и всех других, в которых объектом

исследования служит сгусток крови, является то, что по полученным по-

казателям можно судить о ретрактильной активности кровяных пластинок

только при нормальном их количестве, а также при неизмененном уровне

эритроцитов, фибриногена, не нарушенном фибринообразова-нии. При

использовании сгустка из плазмы на результат ретракции не влияют

эритроциты, а также лейкоциты лейкемической крови; в плазме легко могут

быть стандартизованы число тромбоцитов и уровень фибриногена, а

нарушения фибриногенообразования устраняются введением в плазму

раствора тромбина. Изложенное указывает на то, что для исследования

именно ретрактильной активности кровяных пластинок целесообразно

использовать и разрабатывать методы со сгустком из плазмы.

Исследование ретрактильной активности тромбоцитов в сгустке из

разведенной плазмы, модификация метода Benthaus и Kuhnke.

Ретрактильная активность оценивается по уменьшению длины сгустка,

образованного в мерном цилиндре из разведенной в 10 раз плазмы после

свертывания ее тромбин-кальциевой смесью. Сгусток, полученный из

разведенной плазмы, в начале ретракции с трудом преодолевает силу

сцепления с поверхностью цилиндра. Для уменьшения этой адгезии стенки

цилиндра обрабатывают глицерин-желатиновой смесью. Вследствие

указанного разведения плазмы исследование проводится при искусственно

сниженном числе тромбоцитов, что делает метод более чувствительным для

установления нарушения их ретрактильной активности. Для оценки

последней абсолютно необходимой является стандартизация числа

тромбоцитов в тестируемой плазме, что достаточно сложно в повседневной

клинической практике. Поэтому нами получены пределы нормальных

колебаний для показателей ретракции из плазм здоровых людей с различным

содержанием кровяных пластинок, приготовленных путем смешивания в

соответствующих пропорциях богатой и бедной тромбоцитами плазмы. С

помощью полученной графической зависимости можно определять пределы

нормальных колебаний ретракции для любого уровня тромбоцитов в

исследуемой плазме от 50x10/л до 300x10

/л и, таким образом,

необходимость стандартизации числа тромбоцитов у каждого обследуемого

больного устраняется. При оценке ретрактильной активности тромбоцитов

удобнее пользоваться относительной величиной, а именно: процентным

отношением длины сгустка у обследуемого больного к определяемой по

кривой разведения средней величине этого показателя у здоровых лиц с

таким же, как у больного, уровнем кровяных пластинок в плазме (рис.14).

При таком способе выражения результатов верхние и нижние пределы

нормальных колебаний относительной ретрактильной активности имеют

близкие величины при различном содержании пластинок (табл.5).

Техника исследования. Подготовка мерных цилиндров объемом 5 или

10 мл. Цилиндры моют хромпиком, высушивают в термостате и заливают

при 37°С на 15 мин 10% раствором желатины в глицерине.

Богатую тромбоцитами плазму получают вышеописанным способом из

венозной стабилизированной крови. Определяют в ней число тромбоцитов.

Таблица 5

Пределы нормальных колебаний ретрактильной активности тромбоцитов при

различном их содержании в плазме здоровых людей

Число тромбоцитов в плазме (х 10

/л)

300 150 100 50

Время на-

блюдения

после свер-

тывания

плазмы (мин)

% уменьшения длины сгустка

Относительная

ретрактильная

активность

(в % к средней

величине нормы)

20 22-32

27*

13-20

9-15

5-9

77-123

100

30 30-40

19-29

15-23

10-15

82-118

100

40 36-46

22-35

20-29

13-19

81-119

100

* средняя арифметическая величина