Петрищев Н.Н., Папаян Л.П. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний

Подождите немного. Документ загружается.

является источником генерации тромбина как во внешнем, так и во

внутреннем пути активации свертывания крови, то при его дефиците должны

быть нарушены тесты, характеризующие оба пути коагуляции. Однако

практически у больных с дефицитом протромбина в основном снижен только

протромбиновый индекс, и лишь при выраженном его дефиците менее 5%

может быть умеренное удлинение АПТВ.

Нарушение третьей группы реакций, связанное с количественным или

качественным дефектом синтеза фибриногена, проявляется при ла-

бораторном исследовании изменением во всех трех группах тестов. У

больных с указанной патологией удлинено время свертывания венозной

крови, рекальцификации плазмы, каолиновое время, АПТВ, протромби-новое

и тромбиновое время, что объясняется задержкой появления сгустка фибрина

из фибриногена, единственным источником которого в этих тестах служит

плазма больного. Снижена при этом или не определяется концентрация

фибриногена, а также ускорена растворимость фибринового сгустка в

мочевине в результате неполноценности фибриногена.

Недостаточность фактора XIII не отражается ни на одном из тестов

коагулограммы, поскольку этот фактор принимает участие в стабилизации

фибрина уже после появления видимого сгустка на самом последнем этапе

процесса свертывания крови. У больных с указанной коагуло-патией

нарушение плазменно-коагуляционного звена гемостаза выявляется только с

помощью специального исследования - определения способности

нестабилизированного сгустка фибрина к растворению в мочевине, что

отражает действие фактора XIII.

Анализ вариантов сочетаний результатов описанного этапа лабора-

торных исследований, таким образом, позволяет выделить три группы

коагулопатии, обусловленные недостаточностью факторов: 1)ХИ, XI, IX,

VIII;2)X,V,I; 3) VII, II (рис.15).

В дальнейшем для определения конкретного дефекта,

обусловливающего коагулопатию, должны быть выполнены или

специальные исследования активности отдельных факторов свертывания

крови или заменно-перекрестные пробы, выполнение которых доступно для

любой лаборатории (табл 10). В их основе лежит коррекция коагуляционного

дефекта, выявленного у больного на этапе предварительного обследования,

путем введения в исследуемую плазму одного из корригирующих

компонентов, которые имеют известный набор факторов свертывания крови.

Установлено, что плазма здорового человека после адсорбции сульфатом

бария (ВаЗО

-плазма) содержит факторы XII, XI, VIII, V и I. Напротив,

сыворотка здорового человека, полученная после свертывания крови,

является источником факторов XII, XI, IX, VII и X.

Если ,в результате проведенных исследований предполагалась не-

достаточность факторов XII, XI, IX или VIII, для которых характерно на-

рушение тестов, оценивающих внутренний путь, то могут быть получены

следующие варианты заменно-перекрестных проб. При положительной

коррекции от добавления ВаЗО

-плазмы и отсутствии таковой после до-

бавления сыворотки можно сделать вывод, что причиной коагулопатии

является дефицит фактора VIII, отсутствующий в сыворотке. Если же

коррекция достигнута сывороткой, но не ВаSО

-плазмой, то дефект обу-

словлен снижением фактора IX, который имеется в сыворотке, но отсут-

ствует в ВаSО

-плазме. Может быть и другой исход заменно-перекрестных

проб, когда коагуляционный дефект, имеющийся у больного, будет

исправляться одновременно при добавлении и Ва5О

-плазмы, и сыворотки.

Оба реагента содержат два общих фактора - XII и XI. Следовательно, в

случае достижения указанного эффекта коррекции можно предположить

дефицит фактора XII или XI. Для разграничения последних большое

значение имеют анамнестические сведения. Известно, что у лиц с дефицитом

фактора XII не бывает геморрагических проявлений, так называемая

"гемофилия без гемофилии", в то время как недостаточность фактора XI

клинически проявляется геморрагическим диатезом.

Таблица 10

Диагностика коагуляционного дефекта с помощью заменно-перекрестных

проб

Время рекальцификации или АПТВ,

(Протромбиновое время для ф VII)

с корригирующим компонентом

Недос

таточ

ность

факто

ра

без

корригирующего

компонента

Нормальная

плазма

(I, II, V, VII,

VIII, IX, X,

XI.XII)

BaSO

плазма

(I, V, VIII,

XI, XII)

Сыворотка

(VII, IX, X, XI,

XII)

Протромбиновый

индекс

VIII Удлинено Укорочено Укорочено Удлинено Не изменен

IX " " Удлинено Укорочено Тоже

X " " " " Снижен

VII " " " " Снижен

V " " Укорочено Удлинено Снижен

XI " " " Укорочено Не изменен

XII " " " Укорочено Не изменен

II* " " Удлинено Удлинено Снижен

I* Не определяется " Укорочено Не

определяется

Не определяется

Инги

битор

Удлинено Удлинено Удлинено Удлинено

*Изменения отмечаются при уменьшении содержания фактора II ниже 5 %

** Сгусток не образуется в системе, где источником фибриногена служит

плазма больного, даже при добавлении тромбина.

При коагулопатиях, обусловленных недостаточностью факторов X, V

или I, для которых характерно нарушение тестов внутренней и внешней

системы свертывания крови, могут наблюдаться следующие варианты

заменно-перекрестных проб. Первый - корригирующий эффект оказывает

сыворотка (источник фактора X), в то время как добавление BaSO

-плазмы

(источник факторов V и I) не сопровождается исправлением имеющегося у

больного коагуляционного дефекта. Следовательно, коагулопатия

обусловлена снижением активности фактора X. Второй вариант -

корригирующее действие оказывает Ва5О

-плазма, но не сыворотка. В этом

случае причиной коагулопатии может быть дефицит как фактора V, так и

фибриногена (фактора I), поскольку сыворотка данных факторов не

содержит. Для дифференциации этих нарушений необходимо учитывать

результаты исследования тромбинового времени и концентрации

фибриногена. При недостаточности фактора V эти показатели всегда в

пределах нормы, при коагулопатиях вследствие количественного или

качественного нарушения синтеза фибриногена тромбиновое время

значительно удлинено, а концентрация фибриногена или снижена, или

вообще не определяется.

Если необходимо уточнить, не обусловлена ли.коагулопатия недос-

таточностью фактора VII или II , то следует помнить, что этот дефект

проявляется в основном снижением протромбинового индекса, то есть

нарушением второй группы тестов внешней активации свертывания.

Корригирующий эффект проверяется в тест системе одноступенчатого

протромбинового времени. Укорочение последнего после добавления

сыворотки свидетельствует о том, что коагулопатия обусловлена недос-

татком фактора VII, присутствующего в сыворотке. В отличие от дефицита

фактора VII при недостаточности протромбина подобного корригирующего

действия сыворотка не оказывает, поскольку протромбин в ней не

содержится.

Отсутствие коррекции при добавлении к плазме больного всех реа-

гентов, в том числе и нормальной не адсорбированной плазмы здорового

человека, является доказательством наличия в крови исследуемого больного

ингибитора против фактора свертывания крови (чаще всего против фактора

VIII).

По такому алгоритму проводят исследование системы гемостаза для

установления причины кровоточивости и дифференциации различных форм

врожденных коагулопатии и тромбоцитопатий. Изложенные принципы

диагностики врожденных форм патологии гемостаза являются основой и для

определения приобретенных нарушений, которые в отличие от первых

обычно имеют множественный комбинированный характер дефектов.

Приобретенные нарушения гемостаза чаще всего наблюдаются при

заболеваниях печени, почек, гемобластозах и при ДВС синдроме,

осложняющем многие тяжелые виды патологии. В этих случаях должны быть

проведены дополнительные исследования, направленные на оценку

активности отдельных факторов свертывания крови, естественных

антикоагулянтов (антитромбина III, протеинов С и S), определение маркеров

тромбинемии (растворимых фибрин-мономерных комплексов, фрагментов

протромбина 1+2, фибринопептида А, комплексного соединения «тромбин-

антитромбин») и плазминемии (Д-димеров, комплексного соединения

«плазмин-антиплазмин», продуктов деградации фибриногена). Кроме того,

исследование системы гемостаза должно

проводиться для контроля динамики выявленных нарушений в

процессе проведения этиотропного и патогенетического лечения, а также для

оценки отрицательного действия различных лекарств, которые могут су-

щественно нарушать процессы гемостаза. Функциональное состояние

системы гемостаза должно быть установлено и при изменении гемоста-

тических процессов противоположной направленности, а именно, при

повышении реактивности тромбоцитов и коагуляционного потенциала крови,

что может приводить к тромбоэмболическим процессам. Однако

дополнительные методы исследования гемостаза требуют дорогостоящих

реактивов, специальной подготовки персонала и, как правило, проводятся в

специализированных лабораториях.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА

Задачей любого лабораторного исследования является получение

результата, максимально приближенного к истинному значению показателя в

организме больного или максимально объективно отражающего состояние

органов и систем.

В настоящее время под контролем качества лабораторных исследо-

ваний понимают совокупность планируемых и систематически проводимых

мероприятий, дающих уверенность в том, что образцы биологического

материала оцениваются правильно. Контроль качества включает методы и

виды деятельности, направленные одновременно на управление процессом и

устранение причин неудовлетворительных результатов.

Анализ возможных ошибок при проведении лабораторного исследо-

вания должен основываться на знании этапов медицинского лабораторного

исследования, требований Госстандарта, законах статистической оценки

результатов исследований.

Коагулология, как один из разделов лабораторной диагностики, под-

чиняется всем закономерностям и правилам оценки качества исследований,

но система мер оценки качества, широко используемая в биохимических и

гематологических исследованиях с 60-70 годов, пришла в коагу-лологию

позже. Многие коагулологические исследования не являются результатом

прямых измерений концентрации того или иного вещества, отсутствует

методическая и инструментальная стандартизация многих исследований,

отсутствуют (или очень дороги) контрольные материалы и т.д.

Доаналитический этап

Доаналитический этап лабораторного исследования начинается с

формирования у клинициста диагностической гипотезы и составления заказа

на исследования. Все элементы доаналитического этапа должны быть

максимально стандартизованы для предотвращения внесения субъективной

ошибки в исследования.

Важнейшим компонентом внелабораторной части доаналитического

этапа является подготовка пациента и состояние его в момент исследования,

забор, хранение и доставка в лабораторию биологического материала.

Особое значение Доаналитический этап приобретает при проведении

коагулологических исследований. Материалом для исследований является,

как правило, венозная кровь, взятая пункцией вены у пациента натощак

после 15-минутного отдыха. Пункция вены должна быть малотравматичной.

Длительность венозного стаза не должна превышать 1 мин. Первая порция

крови, насыщенная тканевым тромбопластином, не годится для оценки

свертывающей системы, поэтому исследование проводится во второй

пробирке или после слива 1,5-2,0 мл крови. Крайне нежелательно

использование шприца: кровь должна поступать самотеком в пластиковую

пробирку. Использование стеклянных (несиликонированных) пробирок

недопустимо из-за адгезивных свойств стекла и контактной активации

факторов свертывания. При невозможности пункции периферической вены

забор крови может быть произведен из венозного катетера, но после

тщательной предварительной промывки его физиологическим раствором и

удаления 10-15 мл крови. Использование венозной крови, забранной из

катетера, таит в себе опасность неадекватной оценки коагуляционного

гемостаза из-за влияния гепарина, который используется для промывки

катетера.

Некоторые клинические ситуации (экстренные случаи, длительный

лекарственный мониторинг, нежелательность или невозможность пункции

периферических вен) заставляют обращаться к капиллярной крови как к

материалу для исследования. В настоящее время созданы приборы, которые

позволяют делать это с максимальной объективностью, экономно расходуют

реагенты и проводят исследование в минимальном количестве крови. Такие

коагулометры разработаны для исследования ПВ и АПТВ, в них

используются специальные мембранные фильтры для отделения

бестромбоцитарной плазмы. В амбулаторных условиях часто применяется

ручной метод определения ПВ из капиллярной крови. Эта методика пригодна

лишь для скрининговой оценки состояния гемостаза у пациентов с

соматической патологией, но результаты такого исследования могут вводить

клинициста в заблуждение при контроле за терапией оральными

антикоагулянтами.

Время с момента взятия крови до начала работы с ней должно быть

сокращено до минимума, т.к. основные коагулологические исследования

должны быть проведены в первые 2 часа ввиду неустойчивости факторов

свертывающей, противосвертывающей и фибринолитической систем,

тромбоцитов в условиях in vitro.

Важным элементом для правильной организации доаналитического

этапа является правильный подбор и использование стабилизатора. Ос-

новным стабилизатором в настоящее время признан 3,8% раствор цитрата

натрия. Соотношение стабилизатора и крови должно зависеть от гематокрита

и может быть рассчитано по таблице (табл.11).

Таблица 11

Соотношение объема стабилизатора и венозной крови, взятой для

исследования коагулологических показателей, в зависимости от гематокрита.

Гематокрит, % Объем стабилизатора, мл Объем крови вместе со

стабилизатором, мл

20-21 1,4 10,0

22-27 .1,3 10,0

28-33 1,2 10,0

34-39 1,1 10,0

40-45 1,0 10,0

46-51 0,9 10,0

52-57 0,8 10,0

58-61 0,7 10,0

62-65 0,6 10,0

Цитрат натрия предотвращает свертывание, связывая плазменный

кальций. В пробах с нормальным гематокритом половины взятого цитрата

достаточно для блокирования процесса свертывания. Высокий гематокрит

(малое количество плазмы) делает то же количество добавленного цитрата

избыточным, нарушает соотношение цитрата и реактивов, используемых для

рекальцификации при проведении исследований. С целью устранения этих

проблем в пробах с высоким гематокритом возможно применение цитрата

натрия меньшей концентрации - 3,2%. Так, например, фирмы, выпускающие

реагенты для исследования ПВ, позволяют использовать для стабилизации

крови цитрат натрия обеих концентраций.

Описанные выше моменты относятся к той части доаналитического

этапа, которая лежит вне стен лаборатории, однако это не снимает от-

ветственности за его проведение с сотрудников лаборатории. Только

постоянная разъяснительная работа среди лечащих врачей и совместный с

ними контроль за работой процедурных сестер позволит добиться успеха и

снизить до минимума влияние ошибок на доаналитическом этапе на

результат исследования.

Центрифугирование пробы, доставленной в лабораторию, имеет не

менее важное значение, чем ее забор. Обязателен учет величины плеча

используемой центрифуги и количества оборотов для расчета кратности

ускорения - д. Для получения бестромбоцитарной плазмы используется

ускорение 1000-1200 д, для плазмы, богатой тромбоцитами - 300 д. Же-

лательно центрифугирование проб крови объемом по 5 мл. Это позволяет

получить адекватное отделение фракций. При безотлагательном проведении

исследования перенос полученной плазмы в другую пробирку не обязателен,

но возможен. Очень важно четко соблюдать методические указания и

правила нормативно-технической документации по использованию богатой

тромбоцитами и бестромбоцитарной плазмы при проведении тех или иных

исследований.

Правила работы с оборудованием, используемым для проведения

коагулологических исследований, идентичны таковым для любых лабо-

раторных работ. Все используемое оборудование, в том числе коагуло-

метры, пипетки и дозаторы, должно соответствовать требованиям Гос-

стандарта и быть поверенным не менее чем за 12 месяцев до применения.

Если используются ручные методы исследования, это относится также к

температурному режиму водяной бани (наличие контрольного термометра),

секундомерам, весам. Ежедневно должен контролироваться и фиксироваться

температурный режим холодильника, в котором хранятся реактивы.

Проведение плановых поверок, ремонта и профилактики оборудования

должно быть указано в соответствующих журналах и сертификатах.

Аналитический этап исследования

Обеспечение контроля качества исследований на аналитическом этапе

исследования основывается на проведении мероприятий по внут-

рилабораторному контролю качества. Систематический контроль качества

считается не только обязательным условием для аккредитации лаборатории,

но и показателем профессиональной культуры и ответственности

сотрудников. Практика показывает, что до 70% причин ошибок связано с

недостаточно ответственным отношением специалистов к своей работе и

только 30% - с низкой профессиональной подготовкой или недостаточным

материально-техническим обеспечением. Ошибка врача в лаборатории имеет

высокую цену - 7,5% лабораторных ошибок влекут за собой реальные

опасности для пациентов. Врач клинической лабораторной диагностики

всегда должен иметь возможность отстоять свое мнение, быть уверенным в

результатах исследований, обезопасить больного от возможных последствий

неправильно проведенного анализа.

Внутрилабораторный контроль качества коагулологических исследо-

ваний подчиняется тем же законам и проводится теми же методами, что и

контроль любых лабораторных исследований (биохимических, гемато-

логических и т.д.). Деятельность лабораторий в этой области регламен-

тирована Приказом Минздрава РФ № 295 от 21.12.93 г. «Об утверждении

положения об аккредитации клинико-диагностических лабораторий». К

одним из основных критериев оценки деятельности лабораторий в этом

приказе отнесены вопросы контроля качества:

П.2.5. Наличие в лаборатории калибровочных и контрольных мате-

риалов, разрешенных Минздравом РФ к применению в здравоохранении.

П.2.9. Наличие в лаборатории регулярного внутрилабораторного

контроля качества лабораторных исследований.

П. 10. Участие во внешнем (межлабораторном) контроле качества,

осуществляемом на федеральном и региональном уровне.

Общие подходы к внутрилабораторному контролю качества и

терминология

Критерием качества служит погрешность измерения или исследования.

Чем меньше погрешность, тем выше качество исследований. Различают

систематическую, случайную и общую погрешность. Последняя включает в

себя случайную и систематическую погрешности. Систематическая

погрешность характеризует правильность исследования. Случайная

погрешность характеризует воспроизводимость исследования. Общая

погрешность определяется в том случае, когда невозможно точно

дифференцировать систематическую и случайную погрешности. Это имеет

место при малом числе исследований, например, при межлабораторном

контроле качества.

Точность измерений - качество измерений, отражающее близость их

результатов к истинному значению измеряемой величины, при котором малы

все виды погрешностей, как систематические и случайные (правильность и

воспроизводимость близки к идеальным).

Правильность - качество измерений, отражающее близость к нулю

систематических погрешностей в их результатах, то есть соответствие

среднего значения результатов измерений с истинной величиной изме-

ряемого параметра. Причиной отклонения от правильного результата может

быть один и тот же фактор, который называют систематической ошибкой.

Сходимость - качество измерений, отражающее близость друг к другу

результатов измерений, выполненных в одинаковых условиях.

Воспроизводимость - качество измерений, отражающее близость друг

к другу результатов измерений, выполненных в разных условиях. Различают

воспроизводимость в серии (сходимость), во времени (день ото дня) и

межлабораторную воспроизводимость. Причин плохой воспроизводимости

больше, чем плохой сходимости, но в том и другом случае их может быть

несколько, а все вместе их определяют термином случайная ошибка.

Критерии качественного измерения для многих видов деятельности

определены ГОСТ 16263-70 «Государственная система обеспечения единства

измерений. Метрология. Термины и определения».

Статистический анализ вероятных ошибок часто иллюстрируют на

хорошо известном примере мишени._При многократной стрельбе по мишени

(повторные лабораторные исследование одного и того же биологического

материала) могут иметь место следующие варианты:

Мишень с указанием цели (правильного значения).

Правильная стрельба – попадание близко к цели, в

область «десятки» - хорошая воспроизводимость и

хорошая правильность.

Все стрелы попали близко друг к другу, но не

достигли цели – плохая правильность стрельбы при

хорошей воспроизводимости.

Стрелы летели в правильном направлении, но

при этом попадали в разные части мишени. Такая

ситуация характеризуется плохой сходимостью /

воспроизводимостью при достаточной правильно-

сти.

Стрелы вообще не попали в мишень. Такие,

так называемые грубые, ошибки нельзя полностью

исключить, но, используя соответствующие

организационные меры, можно попытаться свести

их к минимуму.

Главными аналитическими характеристиками лабораторного иссле-

дования являются воспроизводимость и правильность. По рекомендации

Международной федерации клинической химии (IFCC) воспроизводимость

выражается в виде стандартного отклонения или коэффициента ариации

результатов повторных измерений одной и той же пробы, а правильность - в

виде разности между средним значением серии повторных измерений и

истинным значением.

Статистические характеристики случайных величин оцениваются в

рамках так называемого нормального распределения. Нормальное рас-

пределение характеризуется тем, что 68,26 % всех значений случайной

величины сосредоточено в пределах ± 1 σ (одного стандартного отклонения),

95,44 % всех значений - в пределах ± 2 σ, а 99,72 % случайных значений - в

пределах ± 3 σ.

Для оценки качества лабораторных исследований чаще всего рас-

считываются следующие общепринятые статистические показатели:

1. среднее арифметическое значение в серии однотипных исследований

(вариационный ряд);

2. стандартное или среднее квадратичное отклонение (σ - "сигма", SD,

стандартная девиация, дисперсия); характеризует степень варьирования

вариационного ряда;

3. коэффициент вариации (V или CV, %). Коэффициент вариации

отражает воспроизводимость в относительном значении (процентах). Его

легко можно использовать для характеристики и сравнения различных

лабораторных показателей. Чем меньше коэффициент вариации, тем выше

воспроизводимость и сходимость результатов. Коэффициент вариации,

характеризующий сходимость, всегда меньше, чем коэффициент вариации,

характеризующий воспроизводимость изо дня в день. Допустимые пределы

аналитической вариации для различных лабораторных исследований

приведены в Приказе МЗ СССР № 545 от 23.04.85 г. в соответствии с

Compendium metodorum in laboratories diagnostics CMLD-A-9.2.

4. допустимый предел ошибки (ДПО, %). При оценке результатов

лабораторных исследований встает задача не только сравнить разные методы

(способы, подходы и т.д.), но и сопоставить получаемые результаты с

возможными биологическими вариациями. Допустимая ошибка связана с тем

диапазоном, который свойственен исследуемой величине здоровых людей.

Вопрос о медицинских допустимых пределах ошибок является

сложным и окончательно нерешенным. При установлении ДПО необходимо

ориентироваться на референтные величины. Однако эти величины

определены не для всех компонентов, они зависят от многих факторов, в том

числе от уровня лабораторной оснащенности и метода, использованного при

определении данного показателя.

Таблица 12

Допустимые пределы погрешности (коэффициента вариации, %) при

проведении контроля качества коагулологических исследований (по

Киселевскому Ю. С соавт., 1997)

Уровень контроля ПВ АПТВ Фибриноген

Внутрилабораторный

- одновременная серия

- неодновременная серия

Внелабораторный

- региональный

- межрегиональный

<10