Петрищев Н.Н., Папаян Л.П. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний

Подождите немного. Документ загружается.

Рис. 14. Относительное уменьшение длины сгустка из плазмы крови

здоровых людей на 20 минуте после его образования при различном

содержании тромбоцитов

В прогретую при 37°С центрифужную пробирку наливают 3,5 мл фи-

зиологического раствора натрия хлорида (рН 7,4) и 0,5 мл раствора кальция

хлорида (0,025 М). Добавляют 0,5 мл раствора тромбина (10 ед/мл) и 0,5 мл

исследуемой плазмы. Включают секундомер. Пробирку закрывают пробкой,

быстро переворачивают два раза, содержимое переливают в подготовленный

цилиндр, который помещают в водяную баню при 37°С.

В процессе ретракции сгусток, занимавший вначале весь объем 5

миллилитрового цилиндра, начинает постепенно уменьшаться и подниматься

кверху, оставаясь фиксированным у верхнего его края. Показатели

регистрируют или в динамике каждые 10 мин в течение 40 мин или

однократно в более раннее время - на 20-й минуте. Отмечают укорочение

сгустка в делениях цилиндра, что соответствует его относительному

укорочению в процентах, т.к. исходная длина сгустка -100 делений).

Наиболее адекватным и диагностически значимым методом иссле-

дования ретрактильной активности тромбоцитов является прямое измерение

силы сокращения сгустка из плазмы с помощью прибора - анализатора

гемокоагуляции АГК1-02, разработанного в ВНИКИ медицинской

лабораторной техники и в Российском НИИ гематологии и трансфу-

зиологии. В этом приборе в термостатированной кювете сгусток, образо-

ванный из плазмы при добавлении тромбин-кальциевой смеси, оказывается

фиксированным между двумя металлическими дисками, из которых нижний,

у дна кюветы, неподвижен, а верхний через измерительную систему связан с

самопишущим прибором. При развитии ретракции на диски начинает

действовать сила сокращения актомиозиновых тромбоцитарных структур.

Постепенное нарастание величины ретракции регистрируется в виде кривой -

ретрактограммы и измеряется в единицах силы. Оценка величины силы

ретракции, приходящейся на определенное число тромбоцитов (10

/л) при

фиксированном объеме пробы (т.е. по удельной ретрактильной активности),

позволяет сравнивать результаты различных проб вне зависимости от общего

числа тромбоцитов в них. Таким образом, зная число кровяных пластинок в

плазме обследуемого, можно определять их удельную ретрактильную

активность без предварительной стандартизации числа клеток в пробе.

Метод весьма чувствителен и позволяет регистрировать начало сокращения

уже через 1-3 мин. После достижения максимальной величины ретракции

при длительной регистрации может быть отмечен период уменьшения силы

сокращения, связанный как с постепенным ослаблением ретрактильного

процесса, так и с разрушением межтромбоцитарных фибриновых связей под

влиянием фибринолитических факторов.

В заключение необходимо еще раз подчеркнуть, что при освоении всех

методов в каждой лаборатории рекомендуется получить свои пределы

нормальных величин у людей разного пола для проверки постоянства

соблюдения условий и степени овладения техникой исследования, для учета

особенностей состояния гемостаза у здоровых лиц в данных климатических

условиях и при преобладающем возрасте обследуемых.

Маркеры дисфункции эндотелия

Дисфункция эндотелия может быть следствием: нарушения

гемодинамики, сопровождающегося изменением гидростатического

давления, скорости и структуры потока, деформацией и окклюзией сосудов;

• нарушения реологических свойств крови вследствие гемоконцен-

трации, внутрисосудистой агрегации форменных элементов крови,

увеличения вязкости;

• структурно-функциональных нарушений эндотелия, связанных с

метаболическими расстройствами, действием цитокинов, иммунных ком-

плексов и т.д.

Одним из проявлений дисфункции эндотелия является изменение

содержания в крови тромборегуляторов вследствие изменения их синтеза,

секреции, лабилизации с поверхности эндотелиоцитов. Циркулирующие в

крови тромбомодуляторы являются своего рода маркерами дисфункции

эндотелия. В настоящее время в клинике наиболее часто для оценки

тромбогенной активности и тромборезистентности сосудов используют

определение vWF, t-PA, PAI-1, PGI

, тромбомодулина, ингибитора ТФ,

секреция которых наиболее специфична для эндотелия, а также количество

циркулирующих в крови эндотелиоцитов.

Содержание фактора Виллебранда в плазме

Определение уровня плазменного фактора Виллебранда (vWF) про-

водят для диагностики болезни Виллебранда и дифференциации тяжелых

форм этого заболевания с гемофилией А. Кроме того, vWF является одним из

маркеров повреждений сосудистой стенки, имеющих место при различных

патологических состояниях, сопровождающихся активацией

гемостатических процессов.

Одним из методов определения содержания vWF в плазме является

общепринятый «сэндвич» - метод твердофазного непрямого иммуно-

ферментного анализа (ИФА). Принцип ИФА основан на специфическом

взаимодействии антиген - антитело. Поликлональные антитела (AT) к vWF,

предварительно адсорбированные на пластиковых планшетах,

«захватывают» соответствующие им антигены из исследуемого образца,

фиксируя их таким образом на планшете. Затем в лунки планшета

добавляют моноклоналыные AT к vWF, конъюгированные с

пероксидазой хрена - ферментом, который, вступая во взаимодействие в

молярных соотношениях с определенным субстратом, в данном случае с ор-

тофенилендиамином (ОФД), приводит к возникновению окраски, по ин-

тенсивности которой судят о количестве антигена в исследуемой пробе.

Уровень vWF определяют в бестромбоцитной плазме, которую по-

лучают из венозной крови, стабилизированной 3,8% раствором цитрата

натрия в соотношении 4:1. Кровь центрифугируют при комнатной темпе-

ратуре 8 минут при скорости 1000 об/мин (в лабораторной центрифуге ЦКЛ-

1). Богатую тромбоцитами плазму отсасывают и снова центрифугируют при

20°С в течение 20 минут при 4000 об/мин (в центрифуге К-23 «Janetzki»

(Германия)) для получения бестромбоцитной плазмы. Все процедуры

выполняют в пластиковой или силиконированной посуде. Бестромбоцитную

плазму хранят до исследования при -20°С не более 3-4 месяцев. В качестве

стандартной плазмы, необходимой для построения калибровочной кривой,

используют референтную донорскую плазму с известным содержанием vWF

или пул донорских бестромбоцитных плазм от 10-20 доноров.

Для постановки анализа применяют планшеты, предназначенные для

выполнения ИФА.

Для проведения анализа необходимы реактивы, которые включают:

1. Буфер А: фосфатно-солевой буфер, рН 7,2 (0,14 М NaCI, 2,5 мМ KCI,

8 мМ Na

HPO

, 1,5 мМ КН

РО

2. Буфер В: фосфатно-солевой буфер, рН 7,2 (0,5 М NaCI, 2,5 мМ KCI,

8 мМ Na

HPO

, 1,5 мМ КН

РО

, 0,1% Tween-20).

3. Буфер С: цитратно-фосфатный буфер, рН 5,0 (3,4 мМ С

, 6,8 мМ

HPO

4. Поликпональные AT к vWF человека (фирма "Dakopatts") в разве-

дении 1:3000 на буфере А.

5. Моноклональные AT к vWF человека (разработка лаборатории он-

коиммунологии НИИ онкологии и лаборатории свертывания крови Рос-НИИ

гематологии и трансфузиологии, Петербург), конъюгированные с

пероксидазой хрена, в разведении 1:2000 на буфере В.

6. Субстрат для выявления активной пероксидазы: 0,05% раствор ОФД

в буфере С с добавлением перекиси водорода непосредственно перед

использованием до конечной концентрации 0,0198%.

7. 3 М раствор серной кислоты.

Техника исследования. В каждую лунку планшета добавляют по

ЮОмкл раствора поликлональных AT, инкубируют при +4°С в течение ночи.

Проводят трехкратную отмывку лунок от не связавшихся AT с помощью

буфера В.

Готовят пять последовательных двукратных разведений стандартной

плазмы от 1:25 до 1:400 буфером В. Образцы исследуемой плазмы разводят

буфером В в отношении 1:50. По 50 мкл каждого разведения стандартной

плазмы и исследуемых проб помещают в лунки планшета, заполняя таким

образом все лунки кроме 2-6, которые используют в качестве отрицательного

контроля, добавляя туда буфер В. Для повышения точности анализа

рекомендуется использовать для одного образца две соседние лунки, и при

расчете результатов в качестве окончательного значения оптической

плотности данной пробы брать среднее арифметическое из двух показателей.

Затем в каждую лунку добавляют по 50 мкл моноклональных антител,

содержащих ферментную метку. Проводят инкубацию при 37°С в течение 1,5

часа, за которой следует пятикратная отмывка планшета от остатков плазмы

и не связавшихся AT с помощью буфера В.

В каждую лунку добавляют по 100 мкл раствора субстрата. Реакция

окрашивания проходит в темноте при комнатной температуре. Развитие

окраски контролируют визуально (обычно достаточная интенсивность

окрашивания достигается в течение 5-30 мин).

Останавливают реакцию окрашивания, добавляя в каждую лунку в той

же последовательности, в которой прибавляли раствор субстрата, по 50 мкл

раствора серной кислоты.

Считывание результатов проводят не ранее, чем через 10 мин, и не

позднее, чем через 30 мин, после остановки реакции окрашивания на любом

спектрофотометре, предназначенном для обработки планшетов для ИФА при

длине волны 492 нм.

Оценка результатов. Содержание vWF в плазме выражают в про-

центах от нормы. Определение уровня vWF проводят с помощью калиб-

ровочной кривой, которая строится в билогарифмической системе координат

на основании данных оптической плотности, полученных для по-

следовательных двукратных разведений стандартной плазмы. Для по-

строения калибровочных кривых существуют типовые программы. При

невозможности использования таких программ, нормальную кривую строят

на билогарифмической миллиметровой бумаге, откладывая по оси ординат

величины оптической плотности, соответствующие разведениям стандартной

плазмы, отмечаемым по оси абсцисс. За 100% содержания vWF условно

принимают такое его количество, которое содержится в конечном разведении

плазменного стандарта 1:100. Конечные разведения 1:50, 1:200, 1:400 и 1:800

составляют 200, 50, 25 и 12,5% vWF, соответственно. Линия, соединяющая

полученные таким образом точки, является калибровочной кривой, по

которой, зная оптическую плотность исследуемого образца, можно

определить в нем процентное содержание vWF. В представленной ниже

таблице приводятся данные оптической

плотности последовательных разведений плазменного стандарта, ис-

пользованные для построения калибровочной кривой в одной из постановок

опыта.

Таблица 6

Показатель Конечные разведения стандартной плазмы

1:50 1:100 1:200 1:400 1:800

Концентрация фактора

Виллебранда в%

200 100 50 25 12,5

Ед. опт. плотности 2,720 1,788 0,991 0,562 0,309

Пределы нормальных колебаний: 58% -166% (Х=98%, 3=35,7)

Возможные ошибки:

Несоблюдение условий хранения образцов плазмы может привести к

значительному снижению в них процентного содержания vWF.

Определение эндотелиоцитов в крови

Наличие циркулирующих в крови эндотелиоцитов впервые было по-

казано Bouvier et al (1970). Эти же авторы продемонстрировали роль

циркулирующих в крови клеток эндотелия как маркера повреждения сосудов.

В настоящее время используются следующие методики определения

циркулирующих в крови эндотелиоцитов: количественное определение

клеток, иммуноцитометрические и иммуномагнитные методы. Наиболее

доступным для практического использования является метод, предложенный

Hladovec и Rossmann (1973). Принцип метода основан на выделении

эндотелиальных клеток вместе с тромбоцитами с последующим их

осаждением ADP. Венозная кровь в объемах 4-5 мл отбирается в пробирки. В

качестве стабилизатора используется 3,8% раствор цитрата натрия из расчета

1:9. Тромбоцитарную плазму получают центрифугированием (1000

оборотов/мин, 10 мин). Тромбоциты отделяются путем добавления ADP (из

расчета 0,4 мл раствора 1 мг/мл ADP на 1 мл суперна-тата), перемешивания

смеси в течение 10 мин с последующим центрифугированием (1000

оборотов/мин, 10-15 мин). Бестромбоцитная плазма осторожно отделяется от

осажденных тромбоцитов и повторно центрифугируется (1000 оборотов/мин,

20 мин). Полученная надосадочная жидкость сливается и к осадку

добавляется 0,1 мл 0,9% NaCI, осадок осторожно отделяется стеклянной

палочкой от стенок и дна пробирки. Подсчет количества клеток эндотелия

осуществляется в двух сетках камеры Горяева.

George F., Poncelet P et al. (1991) разработали цитометрический метод

определения единичных эндотелиальных клеток в цельной крови. Этот метод

основывается на использовании нового моноклонального антитела S-Endo,

специфически реагирующего с эндотелиоцитами различного происхождения.

Существует несколько типов моноклональных антител S-Endo: I, 2 и 3,

однако лишь S-Endo-1 являются специфичными для циркулирующих в крови

клеток эндотелия. Подсчет циркулирующих в крови эндотелиоцитов

осуществляется путем сравнения с образцами крови с добавлением

известного количества эндотелиальных клеток пупочной вены. Выявлена

хорошая корреляция между добавленными и подсчитываемыми

эндотелиальными клетками (>90%), а минимум определения эндотелиальных

клеток 0,2 клеток/мкл. Используя эту методику определения, авторы

установили, что содержание эндотелиальных клеток в крови здорового

человека <0,1 клеток/мкл. Повышение концентрации циркулирующих

эндотелиальных клеток до 8 клеток/мкл определяется у пациентов после

венепункции. Таким образом, иммуноцитометриче-ский метод с

использованием S-Endo1 антител может быть использован для определения

уровня циркулирующих эндотелиальных клеток при различной патологии.

Циркулирующие эндотелиальные клетки могут быть изолированы из

крови и идентифицированы с помощью специфических эндотелиальных

антител, соединенных с иммуномагнитными элементами (George F., Brie-con

С. et al., 1992). Специфические розетки, образуемые эндотелиальными

клетками и иммуномагнитными элементами, могут быть затем изолированы

с помощью магнита. Розетки клеток выявлялись с частотой >80%. Их

эндотелиальное происхождение подтверждено обнаружением фактора

Виллебранда и тромбомодулина, а также присутствием телец Weibei-Palade.

Повышение количества циркулирующих эдотелиальных клеток в

крови, отмеченное у больных ишемической болезнью сердца, эссенциальной

гипертензией, гиперлипопротеидемией, сахарным диабетом I и II типа, у

больных хирургического профиля до оперативных вмешательств, пациентов

с посттромбофлебитическим синдромом, хронической никотиновой

интоксикацией, отражает степень поражения сосудов и позволяет судить как

о тяжести течения заболевания, так и оценить эффективность проводимой

терапии.

АЛГОРИТМ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА

Кровотечения могут быть проявлением самостоятельного геморра-

гического заболевания, а также осложнением другой основной патологии или

следствием местных сосудисто-тканевых повреждений. Причина ге-

моррагического диатеза - нарушения в системе гемостаза, которые бывают

первичными генетически обусловленными и вторичными приобретенными.

Любое изолированное или сочетанное нарушение в одном или нескольких

звеньях гемостаза может привести к развитию кровоточивости. Клинические

проявления ее в некоторой степени сходны, что крайне затрудняет

диагностику. В то же время точное определение причины нарушения

системы гемостаза является необходимым условием для проведения

адекватной гемостатической терапии. Диагностика геморрагического

заболевания должна проводиться в соответствии с определенным принятым

алгоритмом. Прежде всего, необходимо установить наличие

геморрагического диатеза, а затем определить локализацию дефекта в

системе гемостаза.

Для установления диагноза большое значение имеет тщательно со-

бранный анамнез. Этот первый этап ознакомления с историей заболевания

является основой планирования дальнейшего лабораторного исследования.

Заболевания системы крови, печени, почек, диспротеинемии, ревма-

тизм, инфекционно-токсические и радиационные воздействия при отри-

цательном наследственном анамнезе указывают на большую вероятность

вторичного системного нарушения, связанного с основным заболеванием или

экзогенным воздействием. (Следует особо подчеркнуть, что заболевания,

закономерно вызывающие изменения в системе гемостаза, должны быть

исключены не только на основании сведений, полученных от больного, но и

на основании тщательного объективного обследования больного). При

опросе больного с кровоточивостью врач также должен помнить, что

геморрагические проявления могут быть результатом длительного приема

некоторых лекарственных препаратов, способных в той или иной мере

нарушить гемостатический процесс (в частности, прием ацетилсалициловой

кислоты, антикоагулянтов). Должна быть исключена возможность

кровотечений, вызванных местными изменениями (например, при

фиброматозе матки, при локальном расширении сосудов носовой

перегородки или ее повреждением).

Наличие у больного врожденного геморрагического заболевания ус-

танавливается на основании совокупности характерных анамнестических и

клинических данных (геморрагические проявления с детства, различная их

локализация, закономерное повторение кровотечений на протяжении всей

жизни больного, аналогичные случаи заболевания в семье). Для определения

характера наследования в каждом отдельном случае необходимо выяснить

возможные гемостатические нарушения у кровных родственников и

составить при положительном наследственном анамнезе родословное дерево.

Однако следует помнить, что отрицательный семейный анамнез не

исключает возможности выявления врожденного геморрагического

заболевания. Оно может возникнуть в семье впервые (спорадические случаи),

кроме того, нередко больные не располагают сведениями о своих

родственниках.

Установление врожденного геморрагического диатеза в случаях тя-

желого течения заболевания не представляет особой сложности, в то время

как умеренно протекающие формы длительно могут оставаться не

диагностированными. При легко протекающих формах геморрагических

диатезов кровоточивость может проявиться только после большой травмы

или операции. Поэтому у больных с подозрением на врожденный ге-

моррагический диатез особое внимание следует обратить на течение

послеоперационного периода, в частности после удаления зуба, тонзил-

лэктомии.

Анализ клинико-анамнестических данных и осмотр больного позво-

ляют дифференцировать коагуляционный тип кровоточивости, в основе

которого лежат изменения плазменно-коагуляционного звена гемостаза, от

капиллярного, который наблюдается при нарушениях в сосудистом или

тромбоцитарном звеньях, то есть при вазопатиях и тромбоцитопатиях

(табл.7).

У больных с дефектом в сосудисто-тромбоцитарном звене гемостаза

кровотечения обычно начинаются сразу после травмы, так как у них на-

рушено образование первичной гемостатической пробки. У этих больных

может быть нарушен окончательный гемостаз вследствие недостаточной

коагуляционной функции тромбоцитов и затруднения образования фиб-

ринового сгустка.

Поздние кровотечения характерны для коагулопатий, обусловленных

дефектом плазменных факторов свертывания крови. Между моментом

нанесения травмы и началом кровотечения проходит значительный

промежуток времени, у некоторых больных от нескольких часов до суток.

Отсутствие кровоточивости сразу после травмы объясняется тем, что

сосудистый спазм и образование тромбоцитарной гемостатической пробки у

больных с плазменным дефектом не нарушены. Однако гемо-статическая

пробка у них нестабильна из-за недостаточного образования плотного

фибринового тромба, способного противостоять давлению крови и

обеспечить гемостаз в сосудах среднего калибра. В результате через 1 - 2

часа после восстановления нормального уровня кровяного давления в зоне

повреждения развивается кровотечение. Поэтому указания на

продолжительные или вновь возникающие кровотечения через несколько

часов после травмы или хирургической процедуры (в том числе и после

удаления зуба) указывают на коагуляционный дефект.

Таблица 7

Определение характера кровоточивости по клиническим проявлениям

Клинические

проявления

Характер кровоточивости

Коагуляционный Капиллярный

Гематомы

(синяки)

Большие Небольшие поверхностные

Гемартрозы Часто встречаются у тяже-

лых больных как основной

признак

Не характерны

Петехии Отсутствуют Типичные проявления

Носовые кровоте-

чения

Наблюдаются редко Часто основной вид

кровотечения

Кровотечения при

поверхностных

порезах

Отсутствуют Длительные

Кровотечения

после экстракции

зуба

Начинаются через несколь-

ко часов после операции и

не останавливаются после

наложения давящей повяз-

ки

Начинаются сразу после

операции и обычно

останавливаются после

наложения давящей по-

вязки

Послеоперацион-

ные кровотечения

Поздние кровотечения с

образованием раневой

гематомы

Кровотечения в основном

во время операции

Характерные про-

явления при уме-

ренных формах

Большие гематомы после

травмы и опасные кровоте-

чения после ранений и опе-

раций

Носовые и маточные

кровотечения

Существенные различия имеются в локализации кровотечений при

геморрагических диатезах, обусловленных нарушениями в сосудисто-

тромбоцитарном или плазменно-коагуляционном звеньях гемостаза. Для

коагулопатий, связанных с нарушением синтеза плазменных факторов

свертывания крови, типичны кровоизлияния в суставы и мягкие ткани. При

гемофилии А и В у больных могут быть признаки ранее возникших

кровоизлияний в суставы (утолщение суставной капсулы; ограничение

объема движений; мышечные гематомы; атрофии; контрактуры; изменения,

связанные с вовлечением в процесс нервов и др.). Но при легком

течении заболевания эти признаки нередко отсутствуют. Заболеваниям,

обусловленным сосудисто-тромбоцитарным дефектом, указанные про-

явления несвойственны. Наиболее характерными для них являются кро-

вотечения из слизистых оболочек: носовые, маточные, желудочно-кишечные,

а также поверхностные экхимозы и петехии. Следует обратить внимание, что

синяки на верхней части туловища и петехии, как правило, свидетельствуют

о тяжелом течении геморрагического диатеза. Таким образом, на основании

анализа клинико-анамнестических данных больного, страдающего

повышенной кровоточивостью, могут быть получены ответы на следующие

вопросы: 1) являются ли кровотечения у больного следствием нарушений в

системе гемостаза или они связаны с местными сосудисто-тканевыми

изменениями; 2) если имеется нарушение в системе гемостаза, то является ли

оно врожденным или приобретенным; 3) насколько тяжелы геморрагические

проявления и 4) каков тип кровоточивости - капиллярный или

коагуляционный. Последнее в определенной степени диктует необходимость

проведения направленных лабораторных исследований: плазменно-

коагуляционных процессов - при коагуляционном характере нарушений и

сосудисто-тромбоцитарных реакций - при капиллярном. Однако у любого

первичного больного с геморрагическим диатезом, независимо от типа

кровоточивости, в минимальном объеме должны быть выполнены тесты,

характеризующие функцию всех компонентов системы гемостаза. Это

необходимо для исключения сопутствующих нарушений в другом звене, а

также для установления болезни Виллебранда и афибриногенемии -

заболеваний, в основе которых лежат изменения нескольких компонентов

гемостаза и поэтому наблюдаются признаки того и другого типа

кровоточивости. Кроме того, кровотечения из слизистых оболочек могут

быть главным клиническим признаком и при ряде коагулопатий, таких как

дефицит факторов VII и X. Сочетанные нарушения нередки при

приобретенных формах кровоточивости, в частности они могут выражаться

не только в дефиците прокоагулянтов, но и в повышении активности

антикоагулянтных и фибринолитических компонентов плазмы. Поэтому,

когда при выполнении минимальной ориентировочной коагулограммы

(табл.8) получают данные, указывающие на преобладание того или иного

вида нарушений, то это требует проведения дополнительных исследований.

Таблица 8

Обязательный объем лабораторных исследований при первичном

обследовании больных с геморрагическим заболеванием

Тесты для характеристики плазменно-

коагуляционного звена гемостаза

Тесты для характеристики

сосудисто-тромбоцитарного звена

гемостаза

Время свертывания венозной крови

Время рекальцификации плазмы

Каолиновое время свертывания плазмы

Активированное парциальное тромбо-

пластиновое время (АПТВ)

Одноступенчатое протромбиновое

Длительность кровотечения

Число тромбоцитов

Адгезивно-агрегационная

активность тромбоцитов