Петрищев Н.Н., Папаян Л.П. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний

Подождите немного. Документ загружается.

конечной концентрации в стабилизированной крови (соотношение крови и

стабилизатора 4:1). При такой стабилизации число тромбоцитов в богатой

тромбоцитами плазме здоровых людей закономерно находилось в пределах

(250-450)х10

/л, спонтанная агрегация не обнаруживалась и при

микроскопическом контроле, и при оценке ее в агрегометре. В течение 10

мин в богатой тромбоцитами плазме здоровых людей, стандартизованной до

200x10

/л, без добавления индуктора агрегации повышение трансмиссии

(обусловленное спонтанной агрегацией в кювете агрегометра) составило

только 3,9±0,3%.

Техника исследования на агрегометре АТ-1 или ФРМ-1. Путем

пункции локтевой вены прямо из иглы набирают кровь в мерную центри-

фужную силиконированную или пластиковую пробирку с 3,8% раствором

основного цитрата натрия в соотношении 4:1. Стабилизированную кровь

центрифугируют при 150д и комнатной температуре в течение 10 мин.

Богатую тромбоцитами плазму силиконированной или пластиковой пипеткой

переносят в другую пробирку, аналогичную вышеописанной, а часть этой

плазмы (приблизительно половину) в такой же пробирке центрифугируют

при 2300д и 20° С в течение 20 мин для получения обедненной тромбоцитами

плазмы.

Определяют число тромбоцитов в исследуемой плазме или методом

Брехера и соавторов, или по установленной (для каждого агрегометра)

зависимости между числом тромбоцитов в плазме и трансмиссией света этой

же плазмы. Эта зависимость дает возможность по трансмиссии света богатой

тромбоцитами плазмы обследуемого (при установлении 100%-ной

трансмиссии в его бедной тромбоцитами плазме) приблизительно определить

число тромбоцитов - или графически, или по формуле (рис.4).

Рис.4. Зависимость трансмиссии света и оптической плотности в

анализаторе агрегации тромбоцитов (АТ-1) от числа кровяных пластинок в

богатой тромбоцитами плазмы здоровых людей.

Шкалы - логарифмические.

Каждая точка - среднее из 8-10 определений

Показатели трансмисии бестромбоцитной плазмы каждого образца

приняты за 100% трансимиссии.

По рассчитанной пропорции, с учетом содержания тромбоцитов в

плазме обследуемого и требуемой их концентрации, смешивают соот-

ветствующие объемы бедной и богатой тромбоцитами тестируемой плазмы

так, чтобы содержание пластинок в последней составляло 200x10

/л.

В кювету агрегометра, куда помещена магнитная мешалка, наливают

определенное количество исследуемой плазмы (обычно 0,45 мл), включают

графическую регистрацию и через одну минуту прогревания вводят

агрегирующий агент, как правило, в объеме 1/10 от объема плазмы. Запись

проводят в течение 5 мин. Скорость движения ленты 15 мм/мин.

Графическая регистрация процесса дает характерную агрега-ционную

кривую (рис.5). Оценивая общий вид агрегационных кривых, получаемых с

различными дозами ряда общепринятых индукторов агрегации, можно

выделить следующие основные их типы.

Однофазная агрегация,

нередко обратимая

Двухфазная необратимая агрегация:

тип I тип II

Однофазная необратимая агрегация с длительным латентным начальным

периодом

Рис. 5. Основные типы агрегационных кривых

Ось Х- время реакции Ось У - трансмиссия света

Однофазная агрегация, нередко обратимая, развивается после

применения малых доз агрегирующего агента. Введение индуктора агрегации

практически сразу или после очень короткого латентного периода в

несколько секунд вызывает умеренное повышение трансмиссии света,

которое после достижения определенной величины (обычно до 20-30%

трансмиссии) постепенно начинает возвращаться к исходному уровню.

Такая кривая отражает фазу первичной агрегации и процесс дезагрега-

ции при отсутствии в связи с малой дозой агониста процесса тромбоци-

тарной секреции. Механизм развития первой волны связан со взаимо-

действием агонистов с их тромбоцитарными мембранными рецепторами,

развитием доступности рецепторов для фибриногена, образованием

фибриногеновых связей между этими рецепторами в прилежащих кровяных

пластинках.

К двухфазной необратимой агрегации следует относить те арега-

ционные кривые, которые наблюдаются при средних дозах и характери-

зуются двухфазным течением процесса. При этом, в первом, наиболее

типичном варианте двухфазной агрегации (тип I) наблюдается отчетливое

разделение первой и второй волны латентным периодом, в течение которого

нет дальнейшего изменения трансмиссии света. Установлено, что вторая

волна вызывается высвобождением из кровяных пластинок эндогенных

агонистов и поэтому ее отсутствие у больного свидетельствует о серьезном

нарушении тробоцитарной секреции. Второй вариант двухфазной

агрегационной кривой (тип II) наблюдается после введения больших доз

агрегирующих агентов, которые вызывают быстрое развитие первой волны

агрегации, быстрое и значительное индуцирование секреторного процесса,

благодаря чему вторая волна развивается рано и непосредственно примыкает

к первой без видимого латентного периода. Также относительно быстро

достигается и суммарная максимальная величина агрегации, которая может

составить 80-100% трансмиссии. Внешне при поверхностной оценке такая

кривая производит ложное впечатление одноволновой, но, в

действительности, она отражает двухфазный процесс. Это доказывается

трансформацией кривой типа I в II при постепенном увеличении дозы

агрегирующего агента. Отличительными признаками кривой типа II является

очень высокая скорость и общая интенсивность процесса и, естественно,

отсутствие дезагрегации. Кроме того, по ходу кривой может быть выявлено

изменение ее наклона в связи с изменением скорости агрегации в момент

развития второй волны.

Однофазная необратимая агрегация после длительного начального

латентного периода наблюдается при исследовании так называемой

коллагеновой агрегации. При введении суспензии коллагена в кювету

агрегометра после выраженного латентного периода (в течение которого

индуцируются реакции тромбоцитарной секреции и из кровяных пластинок

высвобождаются эндогенные агрегирующие субстанции) развивается

единственная волна агрегации. Эта единственная волна по своему

механизму соответствует второй волне двухфазных агрегационных кривых

при применении средних и больших доз различных растворимых индукторов

агрегации.

Для количественной оценки агрегации и характеристики ее динамики

наибольшее значение имеют два параметра: максимальная степень из-

менения трансмиссии света при завершении каждой волны и скорость ее

нарастания в начале развития агрегации. Ранняя точечная скорость из-

меряется в определенное фиксированное время от начала данной волны -

обычно на 30 с. Предпочтение отдают наиболее ранней скорости. Так,

именно ранняя скорость первой волны ристомициновой агрегации лучше

всего коррелирует с активностью фактора Виллебранда. Поскольку для

средних доз большинства агрегирующих агентов характерна двух-волновая

агрегация, каждая из волн характеризуется этими двумя параметрами. Оба

параметра удобно и просто оценивать в процентах трансмиссии света.

Несколько менее информативны временные показатели -время начала и

окончания первой и второй волны (рис.6).

Рис. 6. Измерение основных параметров двухфазной агрегационной кривой

Иногда, немедленно после применения малых и средних доз индук-

торов агрегации, удается отметить очень небольшой латентный период, но он

выявляется не у всех здоровых людей. Однако в патологических условиях

продолжительность этого интервала может увеличиваться, указывая на

задержку мембранной активации. В некоторых случаях в течение этого

латентного периода отмечается очень небольшое и кратковременное

снижение трансмиссии. Для понимания этих наиболее ранних изменений

после введения агониста следует уточнить то, что оптические свойства

плазмы при развитии агрегации отражают суммацию двух одновременных,

но разнонаправленных изменений: увеличения количества и размера

тромбоцитарных агрегатов, что затрудняет прохождение света, и падения

числа тромбоцитов, которое приводит к повышению трансмиссии. В самый

начальный ранний период после введения индуктора агрегации изменение

формы тромбоцитов из дискоидной в сферическую (так называемое

набухание), появление отростков и первых малых агрегатов затрудняет

прохождение света, связанное с доминированием перечисленных изменений.

(Оценка этого раннего периода снижения трансмиссии для характеристики

изменения формы тромбоцитов и появления первых мелких агрегатов

требует изменения условий исследования или применения специальных

приборов - например, лазерного анализатора агрегации тромбоцитов). В

период развернутой агрегации доминирующим влиянием на оптические

свойства плазмы становится эффект снижения числа тромбоцитов в связи с

потреблением их в агрегатах. При этом повышение трансмиссии начинается

только при достаточно выраженной агрегации, т.е. тогда, когда величина

агрегатов достигает размера 25-100 тромбоцитов в одном агрегате и сущест-

венно снижается число свободных кровяных пластинок.

Предотвращение возможных ошибок. Такие существенные для те-

чения агрегационного процесса условия как постоянство температуры (37°С),

рН (7,4-8,0), интенсивности перемешивания реакционной смеси в кювете

агрегометра, а также постоянство всех объемных отношений и конечных

концентраций агрегирующих агентов обеспечиваются нормативными

характеристиками прибора и неукоснительным соблюдением при работе

методических инструкций.

Одним из важнейших условий обеспечения клинически значимых

объективных данных является получение богатой тромбоцитами плазмы без

сопутствующей преждевременной активации клеток еще до начала

агрегометрии. Этой цели служит правильное получение крови толстой и

короткой иглой (диаметр 1,2 мм, длина менее 5 см), использование сили-

конированной или пластиковой посуды, адекватный режим центрифуги-

рования при получении богатой и бедной тромбоцитами плазмы, завершение

всех исследований в течение полутора-двух часов после получения ее из

вены и надежная стабилизация крови.

При выраженном изменении у больного показателя гематокрита не-

обходимо проводить стабилизацию крови с коррекцией в соответствии со

степенью этого отклонения по. формуле (при стабилизации в

соотношении 1:4):

где V

- необходимый объем цитрата нагрия,

да

- объем стабилизированной венозной крови,

Ht - показатель геиатокритэ больного, содержание форменных элементов

крови, л/л.

Как и при других методах исследования сосудисто-тромбоцитарного

звена гемостаза, больной в течение 7-10 дней не должен принимать не-

стероидные противовоспалительные препараты и другие средства, от-

рицательно влияющие в течение длительного времени на функцию

тромбоцитов и эндотелий сосудов.

Для исследования не пригодна плазма с признаками гемолиза,

липемическая, содержащая примесь эритроцитов.

В заключение необходимо подчеркнуть следующее. Техническое

выполнение регистрации агрегационного процесса в агрегометре

представляется достаточно простой процедурой, но значительно сложнее

обеспечить постоянство всех влияющих на него условий. К сожалению,

нарушения некоторых их этих требований могут остаться не замеченными, а

наличие графической записи производит ложное впечатление максимальной

объективности. Для того, чтобы установить факт овладения исследователем

этим в действительности достаточно сложным методом, необходимо

неукоснительно выполнить следующее требование: сначала на плазме

здоровых лиц должны быть получены и оценены пределы нормальных

колебаний с относительно малым разбросом и хорошей воспроизводимостью

данных в разные дни. Только после этого можно переходить к обследованию

больных. При этом для заключения о наличии определенного типа

тромбоцитарных нарушений рекомендуется подтверждение выявленных

изменений при повторном обследовании больного.

Визуальный микрометод исследования агрегации тромбоцитов

Визуальный метод оценки агрегации кровяных пластинок менее рас-

пространен, чем фотометрический, поскольку не имеет графической ре-

гистрации развития процесса во времени и не позволяет оценивать сек-

реторные реакции. Тем не менее и визуальный метод имеет сбои

преимущества, т.к. не требует специального оборудования и может быть

выполнен с затратой минимального количества плазмы.

При перемешивании на предметном стекле агрегирующих агентов и

богатой тромбоцитами плазмы через некоторое время развивается агрегация

кровяных пластинок. Появляющиеся агрегаты в определенный период

достигают достаточно больших размеров и могут быть видны в проходящем

свете с помощью лупы. Это - так называемый феномен «снежной бури»,

который в плазме здоровых людей с определенным количеством

тромбоцитов развивается в одно и то же время при оптимальной дозе

агрегирующего агента. При снижении агрегирующей активности кровяных

пластинок время развития агрегации задерживается и, напротив, при

активации их «снежная буря» появляется раньше. Поэтому при стандартных

условиях исследования момент появления агрегации может служить для

характеристики функциональной активности тромбоцитов.

Техника исследования. Получение и стабилизация венозной крови такие

же, как и в предыдущем методе. В педиатрической практике или, если не

проводятся другие функциональные исследования тромбоцитов, общий

объем стабилизированной крови может быть сокращен до 2-3 мл (в этом

случае для получения богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугируют

при более мягком режиме). Богатую тромбоцитами плазму

силиконированной или пластиковой пипеткой переносят в другую

силиконированную или пластиковую пробирку, подсчитывают в ней число

тромбоцитов и хранят до исследования при комнатной температуре не более

часа.

Разными пипетками на предметное стекло наносят 0,02 мл исследуемой

плазмы, 0,02 мл одного из агрегирующих агентов (ADP, ристомицина,

коллагена, тромбина), смешивают плазму с агонистом и включают

секундомер. Смесь перемешивают стеклянной палочкой так, чтобы жидкость

занимала окружность диаметром приблизительно в 2 см.

Покачивая стекло круговыми движениями, в проходящем свете ос-

ветителя (ОИ-19) на черном фоне следят через лупу за появлением агрегатов.

Секундомер выключают в момент, когда видны отчетливые агрегаты,

раствор просветляется и часть агрегатов начинает прилипать к поверхности

стекла. Реакцию повторяют два раза с каждым агрегирующим агентом.

Различия между двумя параллельными определениями не должно превышать

2-5 сек.

В случае необходимости еще большей экономии плазмы объем ее и

раствора агрегирующего агента может быть снижен до 0,01 мл. При ре-

гистрации результатов исследования указывают конечную концентрацию

применяемых индукторов агрегации.

Оценка результатов исследования. Время агрегации нормальных

тромбоцитов зависит от их числа - чем больше пластинок в богатой

тромбоцитами плазме, тем быстрее развивается реакция. Поэтому пределы

нормальных колебаний, как и средние величины времени агрегации,

различны для разного содержания кровяных пластинок в плазме, они

приведены в таблице 3 в диапазоне от 400 х10

/л до 50 х10

/л тромбоцитов.

Промежуточные величины могут быть определены графически (рис.7).

Рис.7. Зависимость времени агрегации

тромбоцитов при визуальном определении,

от их содержания в богатой

тромбоцитами плазме здоровых людей

Шкала - полулогарифмическая

Агрегирующие агенты: 1 - ADP (0,5 х

M); 2 - коллаген (разведение основной

суспензии 1:2); 3 - ристомицин (0,8 мг/мл);

4- тромбин (0,015%); 5 - норадреналин

(0,125 ЕД/мл).

Необходимость стандартизации числа тромбоцитов у каждого об-

следуемого была устранена следующим образом. Был вычислен относи-

тельный показатель агрегационной активности по формуле А/Б х 100%, где А

- определенная графически средняя величина времени агрегации у здоровых

лиц при числе тромбоцитов в плазме, которое имеется в плазме больного в

день обследования, Б - установленное в тестируемой плазме время агрегации.

При определении верхних и нижних границ нормальных колебаний

относительной агрегационной активности получены очень близкие величины

при всех исследованных уровнях тромбоцитов, что позволило принять общие

пределы нормальных колебаний для исследованного диапазона содержания

кровяных пластинок в плазме (табл.3).

Таблица 3

Пределы нормальных колебаний времени визуальной агрегации тромбоцитов

при различном их содержании в плазме здоровых людей

Число тромбоцитов в плазме (х 10

/л)

400 300 200 100 50

Агрегирующие агенты

и их конечная

концентрация

Время агрегации (с)

Относительная

агрегационная

активность (%)

ADP (0,5х10

-4

М) 37-27*

32**

43-30

50-37

62-45

75-62

86-119 100

Основная суспензия

коллагена (разведение

1 :2)

34-26

35-27

36-27

37-32

39-35

87-117 100

Ристомицин (0,8 мг/мл) 37-27

41-31

50-38

63-47

74-56

87-117

100

Норадреналин (0,015%) 93-74

95-81

102-62

91-111

100

Тромбин (0,125ед/мл) 52-10

55-44

59-48

85-65

106-79

89-114 100

*Пределы нормальных колебаний времени агрегации даны от большей

величины к меньшей с тем, чтобы это соответствовало величинам

относительной агрегационной активности

** Средняя арифметическая величина

Для исключения ошибок, связанных с неточностью определения

времени агрегации, необходимо, чтобы каждый исследователь выполнил

контрольные исследования на плазме 5-10 здоровых лиц. Для проверки

точности приготовления и сохранности реактивов такой контроль должен

проводиться систематически на плазме 3 здоровых лиц.

Исследование функциональной активности тромбоцитов в цельной крови

Определение функциональной активности тромбоцитов представляет

собой достаточно сложную задачу: с одной стороны, нужно в максимальной

степени сохранить интактное состояние пластинок до начала исследования, а

с другой - создать стандартные оптимальные условия, необходимые для

обеспечения полной реализации их функций после стимулирования in vitro.

При многих преимуществах нефелометрических методов, сделавших их

широко используемыми, они обладают одним существенным недостатком -

невозможностью проведения измерений в цельной крови. Это обусловливает

необходимость центрифугирования образцов крови в ходе приготовления

богатой тромбоцитами плазмы, в результате чего:

• кровяные пластинки подвергаются значительным механическим воз-

действиям, которые могут существенно изменить их функциональную

активность и привести к потере наиболее крупных и активных клеток;

• нарушается естественное окружение тромбоцитов, что не позволяет

учитывать влияние на них других форменных элементов крови, спе-

цифически модулирующих функции кровяных пластинок; значительно

увеличиваются время и объём крови, необходимые для подготовки пробы

к исследованию;

• увеличивается вероятность значительного изменения концентрации

лабильных медиаторов в пробе к моменту измерения. Кроме того,

оптические методы не позволяют исследовать кровь больных с

выраженной гиперлипидемией, часто встречающейся в кардиологической

практике.

В связи с этим, более корректными представляются методы оценки

функциональной активности тромбоцитов, позволяющие проводить ис-

следования непосредственно в цельной крови. Самыми простыми из них

являются способы, основанные на регистрации убыли одиночных тром-

боцитов в условиях перемешивания крови с каким-либо агрегантом. Су-

ществует целый ряд модификаций таких микрометодов, однако сравнительно

низкая чувствительность и воспроизводимость препятствуют их широкому

распространению в лабораторной практике.

Значительным прогрессом в рассматриваемой области можно считать

появление импедансного метода исследования функциональной активности

кровяных пластинок. Импедансный метод определения индуцированной

агрегации кровяных пластинок основан на измерении сопряженных с

формированием тромбоцитарных агрегатов изменений комплексного

сопротивления между электродами, помещенными в исследуемую пробу

крови или богатой тромбоцитами плазмы (БТП). Метод позволяет

динамически исследовать поведение тромбоцитов в их естественной среде,

что устраняет все перечисленные выше недостатки и ограничения

нефелометрических способов и делает его наиболее объективным и

перспективным современным средством изучения функционального статуса

кровяных пластинок.

На основе импедансного метода в последние годы выпущена серия

агрегометров цельной крови для научных и клинико-диагностических ла-

бораторий (агрегометры фирмы «Cronolog» (США), АИ-300 (Санкт-

Петербург). В рассматриваемых приборах электроды датчиков при со-

прикосновении с перемешиваемой кровью покрываются сначала тром-

боцитами в один слой. Если не добавлять индуктор агрегации, то даль-

нейшего взаимодействия между тромбоцитами и электродами не происходит

и полное электрическое сопротивление между электродами (импеданс)

остается постоянным. При внесении агониста развивается агрегация

тромбоцитов, в результате чего наблюдается нарастание тромбоцитов на

электродах. Утолщение покрывающего электроды слоя приводит к

увеличению импеданса между электродами, последнее отображается (в

случае агрегомегра АИ-300) на цифровом табло прибора с дискретностью 3

секунды, а также выводится в виде кривой агрегации на графический

матричный индикатор прибора. При наличии самописца или компьютера

процесс агрегации регистрируется на диаграммной ленте или экране

монитора, соответственно. Измерения ведутся при перемешивании проб со

скоростью 1100 об/мин (цельная кровь) и 600 об/мин (БТП) и температурной

стабилизации образцов (37° С).

Получение крови для исследования функциональной активности

тромбоцитов является крайне важным моментом и его корректное про-

ведение в значительной степени влияет на конечные результаты, особенно

если речь идёт о клинических исследованиях.

Получать крови следует в одно и то же время суток, поскольку ак-

тивность тромбоцитов, как и всей системы гемостаза в целом, обнаруживает

выраженные колебания на протяжении суток (суточные биоритмы) с

максимумом около 9 часов. Все пациенты не должны получать в течение 10-

12 дней до момента исследования препаратов, влияющих на функ-

циональную активность тромбоцитов. Забор производится из локтевой вены.

Для исследования агрегации тромбоцитов кровь стабилизируется 3,8%

раствором цитрата натрия в объемном соотношении: 9 частей крови на 1

часть раствора лимоннокислого натрия. Кровь, не встряхивая, тщательно

перемешивают плавно вращая пробирку. В процессе исследования пробы

сохраняют при комнатной температуре с соблюдением общепринятых мер

предосторожности при работе с клетками крови. Адекватное исследование

агрегационной активности тромбоцитов возможно в цельной крови в течение

3 часов от момента забора крови, в БТП - в течение 2 часов после осаждения

форменных элементов. Недопустим забор крови после длительного

венозного стаза. Получение крови рекомендуется осуществлять либо вообще

без наложения жгута или манжеты сфигмоманометра, либо, если это

возможно, время венозного застоя не должно превышать 1 минуты. В

противном случае выделяемые ише-мизированной сосудистой стенкой

биологически активные соединения могут существенно изменять

функциональный статус тромбоцитов. Если кровь из вены не набирается

сразу после укола, повторные пункции одной и той же вены недопустимы.

Вакуумная методика получения проб крови, используемая в совре-

менных одноразовых системах забора, при изучении функционального

потенциала кровяных пластинок в достаточной степени унифицирована с

рутинным способом отбора при свободном токе крови.