Паун Г., Розенберг Г., Саломаа А. ДНК-компьютер. Новая парадигма вычислений

Подождите немного. Документ загружается.

1.2. Операции над ДНК 41

Г Г Г Г

ЦЦЦЦ Г Г Г Г

ЦЦЦЦ

ДНК лигаза

Г Г Г Г

ЦЦЦЦ

терминальная

трансфераза

Ц нуклеотиды

терминальная

трансфераза

Г нуклеотиды

Рис. 1.27. Соединение молекул с прямыми концами

за счет присоединения гомополимерного конца.

(см. рис. 1.12). Действие, показанное на рис. 1.12, по вполне

очевидной причине называют присоединени ем «гомополимер-

ного хвоста». Этот прием можно использовать для сшивки

прямых концов способом, изображенным на рис. 1.27.

Хотя тер мин «сшивка» означает закрывание насечки, его

часто используют и для описания процесса соединения липких

концов с последующим закрыванием насечек.

Модификация нуклеотидов ДНК. Для управления раз-

личными манипуляциями над ДНК очень полезны фермен-

ты, изменяющие молек улы путем присоединения или удаления

некоторых химических компонентов. Эти ферменты называют

модифицирующими.

Метилазы — это ферменты, которые in vivo работают как

партнеры рестрикционных ферментов. Основная роль рестрик-

таз in vivo — защита организма-хозяина (например, бактерии)

от организмов-агрессоров (например, вирусов). Рестрикцион-

ные ферменты переваривают ДНК агрессора, разрезая его на

42 1. Как устроена ДНК и как с ней работают



OHOH



Рис. 1.28. Действие щелочной фосфатазы.

куски, причем чем разнообразнее сайты узнава ния рестриктаз,

тем большее количество агрессоров может быть разрушено.

Однако ДНК хозяина тоже может содержать сайты узнавания

некоторых из его рестрикционных ферментов, и если эти сайты

не защищены, то организм-хозяин, расщепляя ДНК агрессора,

разрушит и свою собственную ДНК.

Метилаза, служащая партнером некоторого рестрикцион-

ного фермента, имеет тот же сайт узнавания, что данный фер-

мент; когда она связывается с сайтом узнавания, она моди-

фицирует один из нуклеотидов внутри этого сайта, добавляя

к нему метильную группу. Обработанный таким образом сайт

узнавания уже недоступен для соответствующей рестриктазы,

что предохраняет ДНК от разрушения этим ферментом.

Щелочная фосфатаза удаляет фосфатную группу с 5

-кон-

ца ДНК, оставляя на этом месте 5

-гидроксильную группу —

см. рис. 1.28. Ясно, что получающаяся при этом молекула не

может сшиваться сама с собой, образуя кольцевую молекулу,

так как между ее концами не может образоваться фосфоди-

1.2. Операции над ДНК 43



POH



Рис. 1.29. Действие полинуклеотидкиназы.

эфирная связь. Это важно, если нео бходимо сшить молекулы

α и β и при этом избежать сшивки α с α или β с β.

Полинуклеотидкиназа действует противоположным обра-

зом: она переносит фосфатные группы (от молекул АТФ) на

-гидроксильные концы, образованные щелочной ф осфатазой,

как показано на рис. 1.29.

Если переносимые фосфатные группы помечены радиоак-

тивным атомом, то полученные при этом молекулы могут быть

обнаружены при помощи методов, использующих радиоактив-

ность (см. выше обсуждение гель-электрофореза). Кроме того,

восстановление ранее утраченного 5

-фосфатного конца позво-

ляет таким молекулам вновь сшиваться.

Размножение ДНК. Одной из центральных проблем генети-

ческой инженерии является увеличение количества специфи-

ческих фрагментов ДНК (например, фрагмента, кодирующего

определенный ген). Проблема становится особен но острой, если

небольшое количество необходимого фрагмента затеряно среди

44 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

z }| {

| {z }

z }| {

α :

. . .

Рис. 1.30. Молекула ДНК с известными границами.

огромного числа других фрагментов, как пресловутая иголка

в стоге сена.

К счастью, существует прием, называемый полимеразной

цепной реакцией (ПЦР), который решает эту проблему. Метод

ПЦР, разработанный Кэри Маллисом в 1985 г., произвел насто-

ящую революцию в молекулярной биологии (за свое открытие

Маллис был удостоен Нобелевской премии). Этот метод неве-

роятно чувствителен и эффективен: за короткий промежуток

времени можно получить миллионы копий желаемой молеку-

лы ДНК, даже если начать всего с одного ее экземпляра. ПЦР

находит массу применений в генетической инженерии, судебно-

медицинской экспертизе, геномном анализе, археологии, пале-

онтологии и медицинской диагностике. При этом метод очень

прост и весьма элегантен. Вот как он работает.

Предположим, что нужно размножить молекулы ДНК α с

известными границами (концевыми последовательностями) β

и γ, см. рис. 1.30. Размножение осуществляется путем много-

кратного повторения основного цикла, включающего три шага:

денатурацию, праймирование и удлинение.

Для начала готовится раствор, содержащий α, синтетиче-

ские олигонуклеотиды (прай меры), комплементарные β (β-

праймеры) и γ (γ-праймеры), а также устойчивую к нагрева-

нию полимеразу и нуклеотиды.

Денатурация. На этой стадии раствор нагревается до высо-

кой температуры (часто почти до температуры кипения), так

что водородные связи между двумя цепочками разрушаются и

α разделяется на две цепочки α

и α

, см. рис. 1.31.

1.2. Операции над ДНК 45

нагрев

z }| {

| {z }

z }| {

| {z }

α :

. . .

Рис. 1.31. Денатурация.

Праймирование. Раствор охлаждают (обычно до примерно

◦

C), так что пр аймеры соединяются с комплементарными

им краями: β-прай мер с β, а γ-праймер с γ, см. рис. 1.32.

Удлинение. Раствор вновь нагревают (до 72

◦

C), при этом

полимераза удлиняет праймер (используя нуклеотиды, находя-

щиеся в растворе), в результате чего образуется две полных це-

почки ДНК, идентичных α, см. рис. 1.33. Напомним, что поли-

мераза всегда удлиняет праймер в направлении 5

−3

. Исполь-

зуемая здесь полимераза должна быть термоустойчивой, по-

скольку в процессе многократного повторения цикла она долж-

на выдержать очень высокие темпер атуры. К счастью, в при-

роде есть такие полимеразы: они могут быть выделены из тер-

мофильных бактерий, живущих в горячих источниках с тем-

пературой, близкой к точке кипения.

Очевидно, что, повторяя основной цикл n раз, можно по-

лучить 2

копий α, по крайней мере, в теории. Таким образом,

ПЦР — это очень эффективный молекулярный ксерокс!

Для простоты объяснения мы предположили, что нуклео-

тидная последовательность α — это отдельная молекула. Оче-

видно, что метод ПЦР будет раб отать и в том случае, когда α

46 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

β-прай мер

γ-праймер

z }| {

| {z }

. . .

охлаждение

z }| {

| {z }

. . .

Рис. 1.32. Праймирование.

|{z}

| {z }

. . .

α:

. . .

|{z}

. . .

α:

. . .

z }| {

z}|{

?? ??

полимеразаполимераза

. . .



. . .

Рис. 1.33. Удлинение.

1.3. Секвенирование 47

есть лишь часть более длинной молекулы, заключенная между

границами β и γ. Здесь описание работы ПЦР выглядит чуть

сложнее, но мы думаем, что читатель справится с анализом

соответствующей модификации процедуры ПЦР.

Прежде чем читатель провозгласит метод ПЦР настоящим

чудом, стоит подчеркнуть, что для размножения молекулы

ДНК α необходимо знать ее границы β и γ, чтобы синтезиро-

вать β- и γ-праймеры.

1.3 Секвенирование

Мы уже знаем, как измеряют длину молекул ДНК, однако в ко-

нечном счете большинство процедур генетической инженерии

нацелено на расшифровку точной последовательности нуклео-

тидов, образующих данную молекулу ДНК. Например, цель

проекта «Геном чело века» — полностью определить нуклео-

тидную последовательность генома человека, длина которого

составляет около 3 · 10

пар нуклеотидов!

Наиболее популярный метод секвенирования (т.е. установ-

ления точной последовательности нуклеотидов, составляющих

данную молекулы ДНК) использует полимеразы, удлиняющие

праймированную одноцепочечную матрицу, и аналоги нуклео-

тидов. Аналог нуклеотида — это нуклеотид, химически моди-

фицированный in vitro. Модифицировать можно сахар и/или

фосфатную группу и/или основание нуклеотида. Чаще всего

при секвенировании используют модификацию сахара, при ко-

торой 3

-гидроксильная группа (3

-OH) сахара заменяется на

атом водорода (3

-H). Получающиеся при этом н уклеот иды на-

зывают дидезоксинуклеотидами и обозначают ддА, ддТ, ддЦ

и ддГ. Метод секвенирования, основанный н а применении та-

ких нуклеотидов, называется дидезоксиферментным методом

или методом Сэнгера (по имени изобретателя).

Суть этого метода такова. Допустим, нужно секвениро-

вать одноцепочеч ную молекулу α. Удлиним ее на 3

-кон-

це короткой последовательностью γ (скажем, длиной 20),

получив, таким образом, молекулу 3

-γα. Например, если

α = 3

-AГTAЦГTГAЦГЦ, то получится молекула β = 3

48 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

ЦГЦAГГГЦATГA

Рис. 1.34. Молекула β

ЦГЦAГTГЦATГA

ГЦГTЦAЦГTAЦT

Рис. 1.35. Полная двойная цепочка.

γAГTAЦГTГAЦГЦ. Благодаря присоединению γ «в перед и» α,

к β можно добавить комплементарный праймер γ, после чего

полимераза может начать удлинение такой молекулы, допол-

няя матрицу α, см. рис. 1.34. Пусть β

— это праймированная

молекула β. Обычно праймер γ помечают (радиоактивно или

флуоресцентно), чтобы в дальнейшем было легко идентифи-

цировать одиночные цепочки, начинающиеся с γ.

Теперь приготовим четыре пробирки (назовем их пр обир -

ками А, Т, Ц и Г), каждая из которых содержит молекулы β,

праймеры (благодаря которым будут возникать молекулы β

полимеразу и нуклеотиды А, Т, Г и Ц. Кроме того, в пробир-

ке А содержится небо льшое количество ддА, в пробирке Т —

небольшое количество ддТ, в пробирке Ц — небольшое количе-

ство ддЦ, а в пробирке Г — небольшое количество ддГ.

Проанализируем реакцию, происходящую в проби рке А.

Полимераза будет наращивать праймер γ молекулы β

, исполь-

зуя нуклеотиды, находящиеся в пробирке А. Если всякий раз

используются только нуклео тиды А, Т, Ц, Г, то молекула β

удлиняется до полной двойной цепочки (рис. 1.35).

Однако время от времени полимераза будет использовать

вместо нуклеотида А его аналог ддА. Как только это сл учит-

ся, дополнение матрицы прекратится, поскольку как у ддА нет

-ОН конца, необходимого для фосфодиэфирной связи. Следо-

вательно, кроме полных двухцепочечных молекул, мы получим

и молекулы, показанные на рис. 1.36.

1.3. Секвенирование 49

A Г T A Ц Г T Г A Ц Г Ц

T Ц A T Г ЦA

A Г T A Ц Г T Г A Ц Г Ц

T Ц A

Рис. 1.36. Неполные молекулы в пробирке А.

Таким образом, в пробирке А по лимера за синтезирует (в

соответствии с матрицей β) следующие 5

− 3

фрагменты:

− γТЦАТГЦАЦТГЦГ,

− γТЦА,

− γТЦАТГЦА.

Их легко отделить путем денатурац ии двойных цепочек и отбо-

ра только тех одинарных цепочек, которые начинаются с прай-

мера γ (напомним,что для этой цели мы пометили γ).

Такое же рассуждение показывает, что в пробирке Т поли-

мераза синтезирует следующие 5

− 3

фрагменты:

− γТЦАТГЦАЦТГЦГ,

− γТ,

− γТЦАТ,

− γТЦАТГЦАЦТ.

В пробирке Ц получаем:

− γТЦАТГЦАЦТГЦГ,

− γТЦ,

− γТЦАТГЦ,

− γТЦАТГЦАЦ,

− γТЦАТГЦАЦТГЦ.

В пробирке Г получаем:

− γTЦATГЦAЦTГЦГ,

50 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

AЦTГЦГ Ц Г T A Ц T

–

Рис. 1.37. Лестница фрагментов.

− γTЦATГ,

− γTЦATГЦAЦTГ.

Теперь проведем электрофорез в полиакриламидном геле,

используя четыре лунки (по одной на каждую пробирку), и по-

лучим распределение фрагментов по размерам, показанное на

рис. 1.37 (мы игнорируем приставку γ , так как она одинакова

для всех фрагментов). Заметим, что фрагменты распределяют-

ся как перекладины лестницы, в которой перекладина r непо-

средственно предшествует перекладине r

, если r

длиннее r на

один нуклеотид.

Ясно, что читать полосы (перекладины лестницы) следу-

ет справа налево, поднимаясь по лестнице, поскольку длины

молекул в полосах увеличиваются справа налево. На рис. 1.37

под каждой полосой мы указали нуклеотид, находящийся на 3

конце молекул этой полосу. Сами молекулы, находящиеся в по-

лосах и расположенные в порядке возрастания их длин справа

налево (рис. 1.37), суть:

TЦ,

TЦA,

TЦAT,

TЦATГ,