Паун Г., Розенберг Г., Саломаа А. ДНК-компьютер. Новая парадигма вычислений

Подождите немного. Документ загружается.

1.2. Операции над ДНК 31

N N N N

NNNN

N N N N

NNN

N N N N

NNNNNN

N N

N N N N

NNNNNNN

N N N

Экзонуклеаза III

N N N N

NNNNNNNN

N N N N

Рис. 1.13. Действие экзонуклеазы III.

лекулы, некоторые — только на двухцепочечные, а некоторые

могут укорачивать молекулы обоих типов.

Например, экзонуклеаза III — это 3

-нуклеаза, она укорачи-

вает цепочку в 3

− 5

направлении, см. рис. 1.13. В результате

образуется молекула с выступающим 5

-концом.

Другая экзонуклеаза, Bal31, удаляет нуклеотиды из обеих

цепочек двухцепочечной молекулы, см. рис. 1.14.

32 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

N N

N N N N

Bal31

NNN

N N N N N N

NNN

Рис. 1.14. Действие экзонуклеазы Bal31.

Отметим, что экзонуклеазной активностью обладают и

многие полимеразы. Такая активность имеет большое значе-

ние для осуществляемого полимеразами процесса репликации

ДНК как механизм исправления ошибок. В то время как,

наращивая молекулу, полимераза всегда действует в 5

− 3

направлении, в качестве экзонуклеазы она может действовать

как в 5

− 3

, так и в 3

− 5

направлении.

Разрезание ДНК. Эндонуклеаз ы разрушают внутренние

фосфодиэфирные связи в молекуле ДНК. Они могут быть

достаточно специализированы в отношении того, что они

разрезают, где они разрезают и как они ра зрезают.

1.2. Операции над ДНК 33

NNNN N N

N N NNNN

Рис. 1.15. Действие эндонуклеазы S 1 (1).

NNNNN

N N N

N N N NNNNN

N N N N N

Рис. 1.16. Действие эндонуклеазы S 1 (2).

Так, например, эндонуклеаза S 1 разрезает только одиноч-

ные цепочки (рис. 1.15) или одноцепочечные фрагменты сме-

шанных молекул ДНК, содержащих как одноцепочечные, так

и двухцепочечные участки (рис. 1.16). При этом разрез может

произойти по любой фосфодиэфирной связи; говорят, что эн-

донуклеаза S1 не является сайт-специфичной.

С другой стороны, эндонуклеаза ДНК I разрезает как од-

ноцепочечные, так и двухцепочечные молекулы; она также не

является сайт-специфичной.

Рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы) гораздо бо-

лее специфичны: они разрезают только двухцепочечные моле-

34 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

AATTЦ

A A T T Ц

EcoRI

TTЦ A A Г

ЦTTAAГ

Рис. 1.17. Действие EcoRI.

кулы и только в определенных (для данной рестриктазы) ме-

стах. Рестрикционный фермент связывается с ДНК в особом

сайте узнавания и затем рассекает связи обычно внутри, но

иногда и вне сайта. Рестриктаза разрезает фосфодиэфирную

связь между соседними нуклеотидами таким образом, что на

-конце одного нуклеотида образуется гидроксильная группа,

а на 5

-конце другого нуклеотида — фосфатная группа.

Образующийся разрез может проходить прямо через обе це-

почки или быть зигзагообразным. Вот несколько примеров.

Рестриктаза EcoRI (см. рис. 1.17). Сайтом узнавания для

этого фермента служит последовательность 5

-ГААТТЦ. На-

правление играет здесь важную роль: EcoRI не связывается c

-ГААТТЦ. Фермент разрезает молекулу зигзагообразно, что

приводит к образованию двух выступающих 5

-концов.

Заметим, что сайт узнавания является палиндромом в том

смысле, что чтение одной из цепочек молекулы в 5

−3

направ-

лении дает такой же результат (ГААТТЦ), как чтение соответ-

ствующего участка другой цепочки в 3

− 5

направлении. Это

свойство часто встречается у рестриктаз.

Ясно, ч то если участок ДНК содержит несколько сайтов

узнавания, то в принципе все они будут разрезаны, см. рис. 1.18.

1.2. Операции над ДНК 35

ЦTTAA Г

ЦTTAA

AAT TЦ

ГAATTЦ

EcoRI

ЦTTAA Г ЦTTAA Г

ЦTTAAГЦTTAAГ

Рис. 1.18. Множественные разрезы, осуществляемые EcoRI.

ЦЦГГГ

Ц ЦЦ Г Г Г

XmaI

ГГГ ЦЦЦ

ГГГЦЦЦ

Рис. 1.19. Действие XmaI.

Для читателя, удивленного загадочными названиями ре-

стриктаз (такими, как EcoRI), поясним правила принятой в мо-

лекулярной биологи и номенклатуры. Название фермента все-

гда производится от названия организма, из которого этот фер-

мент был впервые выделен. Берутся первая буква родового на-

звания и две первые буквы видового названия организма, а

в случае необходимости добавляется буква, указывающая на

штамм. Последний знак — это порядковый номер данного фер-

мента среди ферментов, открытых у данного организма. Таким

образом, EcoRI обозначает первую (I) рестриктазу, выделен-

ную из бактерии Escherichia coli, серотип штамма R.

36 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

ГГГ

Ц Ц Ц Г Г Г

ЦЦЦ

SmaI

ГГГ Ц Ц Ц

ГГГЦЦЦ

Рис. 1.20. Действие SmaI.

AЦ Г TЦ

ГAЦГTЦ

PstI

ЦAГ Г TЦ

ГAЦГTЦ

Рис. 1.21. Действие PstI.

Рестриктаза XmaI, см. рис. 1.19. Сайтом узнавания являет-

ся последовательность 5

-ЦЦЦГГГ. Пр и зигзагообразном раз-

резе образуется два выступающих 5

-конца.

Рестриктаза SmaI, см. рис. 1.20. Сайт узнавания для этого

фермента такой же, как и для XmaI, но разрез прямой.

Существуют и такие рестриктазы (например, HpaII и MspI),

у которых одинаковы и сайт узнавания, и тип разреза.

Рестриктаза PstI, см. рис. 1.21. Сайт узнавания — 5

ЦТГЦАГ. Разрез — зигзагообразный, оставляющий два высту-

пающих 3

-конца.

1.2. Операции над ДНК 37

NNNNN

NNNNNЦГЦAГ

NNNNГЦГTЦ

N N NN N N

Ц T Г Ц Г N N N N N NN N N N N

NNNNNNNNNNNЦГЦAГ

HgaI

Рис. 1.22. Действие HgaI.

Рестриктаза HgaI, см. рис. 1.22. Сайт узнавания — 5

ГАЦГЦ. Разрез — зигзагообразный, оставляющий два высту-

пающих 5

-конца. Отметим, что разрез проходит вне сайта

узнавания, а потому Hg aI относят к эндонуклеазам т ипа I,

тогда как все другие упомянутые выше рестриктазы принад-

лежат к типу II (эндонуклеазы, разрезающие молекулу внутри

сайта узнавания). Обсуждение различий между эндонуклеаза-

ми типов I и I I (а также III) выходит за рамки данной главы, но

стоит отметить, что в генетической инженерии эндонуклеазы

типа I используются редко, поскольку они могут рассекать

молекулы в совершенно непредсказуемых местах.

Сшивка ДНК. Соединение молекул ДНК, именуемое сшив-

кой, происходит при посредстве ферментов, называемых лига-

зами. Есть несколько в идо в сшивки.

Рассмотрим, например, ситуацию, показанную на рис. 1.19.

Две молекулы, возникшие под действием рестриктазы XmaI,

имеют выступающие концы. Если такие молекулы находятся

достаточно близко, то эти концы могут воссоединиться за счет

водородных связей между комплементарными основаниями —

именно поэтому выступающие концы называют липкими. В си-

туации, изображенной на рис. 1.19, комплементарными липки-

ми концами будут 5

-ЦЦГГ и 3

-ГГЦЦ.

Водородные связи удерживают комплементарные липкие

концы в месте, однако в каждой цепочке имеется щель, назы-

38 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

Г Г Г Ц Ц Ц

ГГГЦЦ Ц



OH P

P OH

водородные связи

ЦЦГГГ

Ц Ц Ц Г Г Г



Рис. 1.23. Комплементарное спаривание оснований.

ваемая насечкой. Насечка — это отсутствие фосфодиэфирной

связи между последовательно расположенными нуклеотида-

ми. Такая связь может быть восстановлена лигазой при усло-

вии, что 3

-конец на одном краю насечки имеет гидроксиль-

ную группу (3

-гидроксил), а 5

-конец н а другом краю — фос-

фатную группу (5

-фосфат), см. рис. 1.23. К счастью, когда ре-

стриктаза разрезает фосфодиэфирную связь между соседними

нуклеотидами, она как раз образует гидроксильную группу на

-конце и фосфат на 5

-конце, как показано на рис. 1.23.

На рисунке 1.24 показан результат действи я лигазы на мо-

лекулу ДНК, получающуюся при спаривании, изображенном

на рис. 1.23. Заметим, ч то в данном случае задача лигазы об-

легчается тем, что водородные связи удерживают подлежащие

сшивке нуклеотиды вблизи друг от друга.

В ситуации, проил люстрир ован ной рисунками 1.19, 1.23 и

1.24, молекула, рассеченная рестриктазой, восстановилась за

счет возникших при разрезе липких концов. Однако и фраг-

менты двух разных молекул, разрезанных одним и тем же

ферментом (или разными ферментами, образующими одина-

1.2. Операции над ДНК 39

ГГГ Ц Ц Ц

ГГГЦЦЦ

ДНК лигаза

ГГГ Ц Ц Ц

ГГГЦЦЦ



OHP

POH

Рис. 1.24. Сшивка.

ковые липкие концы), могут рекомбинировать с образованием

гибридных молекул. Это показано на рисунке 1.25.

Заметим еще, что при множественных разрезах, проиллю-

стрированных на рис. 1.18, одна из возникающих молекул име-

ет два липких конца, которые могут соединиться между со-

бой, а затем сшиться, что приведет к формированию кольцевой

двухцепочечной молекулы.

При сшивке прямых разрезов лигаза соединяет 3

- и 5

концы одной молекулы с соответственно 5

- и 3

-концами дру-

гой. Например, фрагменты, возникающие под действием SmaI

(рис. 1.20), могут быть сшиты вместе, как показано на рис. 1.26.

Сшивка прямых концов намного менее эффективна, чем

сшивка липких концов. Это объясняется тем, что лигаза не

может сближать подлежащие сшивке концы, в то время как

при сшивке липких концов последние удерживаются вблизи

друг от друга водородными связями. Преимущество сшивки

прямых концов состоит в том, что при этом молекулы ДНК

соединяются независимо от специфики нуклеотидных после-

довательностей на их концах.

Имеется и другой способ сшивки прямых концов. Рас-

смотрим терминальную трансферазу, наращивающую 3

-конец

40 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

Г Г ЦЦ

ГГЦЦ ЦЦ Г Г

ЦЦГГ

водородные связи

ДНК лигаза

ЦГГ

Ц ЦГ Г

Ц Г Г Ц

Ц ЦГ Г

HpaII

ГГ

ЦЦ Г Г

ЦЦ ГГ

ЦЦ Г Г

ЦЦ

Рис. 1.25. Гибридизация.

ГГГ Ц Ц Ц

ГГГЦЦЦ

ДНК лигаза

ГГГ

Ц Ц Ц Г Г Г

ЦЦЦ



POH

P OH

Рис. 1.26. Сшивка прямых концов.