Паун Г., Розенберг Г., Саломаа А. ДНК-компьютер. Новая парадигма вычислений

Подождите немного. Документ загружается.

1.1. Строение ДНК 21

r





Рис. 1.6. Образование двойной цепочки.

молекуле ДНК две цепи закручены вокруг друг друга с обра-

зованием знаменитой двойной спирали — см. рис. 1.7.

Ситуация in vivo еще сложнее, поскольку очень большая

молекула ДНК должна уместиться в очень маленькой клетке

(в типичной бактерии молекула ДНК в 10 000 раз длиннее са-

мой клетки!). ДНК упакована в клетке весьма изощренным об-

разом; в высокоорганизованных (эукариотических) клетках та-

кая упаковка осуществляется «иерархически», в несколько ста-

дий. Учет реальной формы ДНК имеет существенное значение

при рассмотрении процессов, происходящих в живых клетках.

Однако в рамках данной книги можно считать, что молекула

ДНК устроена как двойная линейная цепочка.

Отметим еще, что, например, бактериальная ДНК часто яв-

ляется кольцевой. Для возникновения кольцевой молекулы до-

статочно установить фосфодиэфирную связь между «первым»

и «последним» нуклеотидами.

22 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

Рис. 1.7. Двойная спираль.

Манипуляции с ДНК играют центральную роль в генетиче-

ской инженерии и, в частности, в молекулярных вычислениях.

Мы переходим теперь к описанию набора основных методов,

используемых в различных манипуляциях такого рода. Нач-

нем с обсуждения того, как измеряют ДНК.

Измерение длины молекул ДНК. Длина одноцепочечной

молекулы — это число составляющих ее нуклеотидов. Так,

если молекула состоит из 12 нуклеотидов, мы говорим, что

это — 12-мер (т.е. пол имер, состоящий из 12 мономеров). Длин а

двухцепочечной молекулы (где основание каждого нуклеотида

спарено с его «партнером») определяется числом пар основа-

ний. Таким образом, если образовать двухцепочечную ДНК из

одноцепочечного 12-мера, то длина двухцепочечной молекулы

составляет 12 пар нуклеотидов, сокращенно 12 п.н. Если дли-

на составляет, например, 12 000 пар нуклеотидов, то пишут, что

длина равна 12 т.п.н. (где «т» означает «тысяч»).

Чтобы измерять длину молекулы ДНК, и споль зуют гель-

электрофорез. Техника электрофореза основана на том факте,

что молекулы ДНК несут отрицательный заряд. Поэтому если

поместить их в электрическое поле, то они станут двигаться к

1.1. Строение ДНК 23

–

отрицательный

электрод электрод

положительный

Рис. 1.8. Гель, приготовленный для электрофореза.

положительному электроду. Отрицательный заряд молекулы

ДНК пропорционален ее длине, но и сила, необходимая для

движения молекулы, также пропорциональна ее длине. Таким

образом, эти два фактора взаимно компенсируют друг друга,

и в идеальном растворе все молекулы движутся с одинаковой

скоростью. Вот почему для того, чтобы заставить молекулы

разной длины двигаться с различной скоростью, нужен гель.

Гель-электрофорез производится следующим образом. В

раствор добавляют порошок гелеобразующего вещества и по-

догревают его. Образующийся гель заливают в прямоугольный

пластиковый или стеклянный контейнер и дают ему остыть.

Получается пластинка геля; в процессе остывания вдоль одной

стороны контейнера помещают гребень, так что когда гель

застынет и гребен ь будет убран, на одной стороне пластинки

остается ряд мелких лунок (рис. 1.8).

Теперь микроскопически малое количество раствора с мо-

лекулами ДНК, подлежащими измерению, помещают в лун-

ки, и включают электрическое поле. Молекул ы ДНК начина-

ют продвигаться через гель к положительному электроду. По-

скольку поры геля действуют как молекулярное сито, малень-

кие молекулы движутся через гель быстрее, чем большие, и

очевидно, что группы молекул одинаковой длины движутся с

одинаковой скоростью. Когда первые молекулы достигают (по-

ложительного) конца пласта, электрическое поле отключа ют.

Ясно, что за определ енный промежуток времени маленькие мо-

лекулы пройдут большее расстояние, чем длинные.

24 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

–

6 6

маленькие

фрагментыфрагменты

большие

Рис. 1.9. Гель-электрофорез.

Поскольку молекулы ДНК бесцветны и, стало быть, неви-

димы в геле, их следует каким-либо образом пометить перед

тем, как внести в гель. Имеются два основных метода для по-

мечивания молекул ДНК:

(1) Окрашиван ие бромистым этидием, флуоресцирующим

в ультрафиолетовом свете при связывании с ДНК. Когда гель

рассматривают в ультрафиолетовом свете, становятся видны

яркие флуоресцирующие полосы групп фрагментов ДНК оди-

наковой длины (рис. 1.9). Этот метод лучше работает для двух-

цепочечной ДНК, так как взаимодействие бромистого этидия

с молекулой ДНК обусловлено структурой двойной цепочки.

(2) Прикрепление к ДНК радиоактивных маркеров. Когда

на гель накладывается фотопленка, на ней проявляются поло-

сы, соответствующие разным группам молекул ДНК.

Теперь, зная расстояние, пройденное молекулой, можно

рассчитать ее длину. Чаще, однако, вместо вычислений в одну

из лунок помещают фрагменты, длина которых известна.

Затем полосы, видимые на дорожке, и дущей из этой лунки,

могут быть использова ны как калибровочные: разные полосы

этой дорожки отвечают различным (известным) значениям

длины. Расположение полос на других дорожках можно срав-

нить с калибровочной дорожкой, и, таким образо м, определить

длину молекул в этих полосках. На рис. 1.8 и 1.9 изображены

несколько лунок (с соответствующими спектрами длин мо-

1.1. Строение ДНК 25

лекул), поскольку часто для сравнения нескольких образцов

растворов их разгоняют вместе (при этом обычно один из

растворов — калибровочный).

Есть два вида геля, чаще всего применяемых при электро-

форезе: агарозный и полиакриламидный. Гель-электрофорез в

агарозе служит стандартным приемом при разделении круп-

ных фрагментов (длиной более 500 оснований). Разделяющая

способность геля напрямую зависит от его пористости, и в этом

отношении полиакриламидный гель намного лучше: он поз-

воляет разд елять фрагменты ДНК, различающиеся по длине

только на одно основание! Этот гель чаще используется при

определении длины малых фрагментов ДНК.

Молекулы ДНК, остающиеся в геле после электрофореза,

при необходимости могут быть извлечены из него. Для этого,

например, можно вырезать из геля слой с подлежащей извле-

чению ДНК и заморозить его (в жидком азоте). Заморажи-

вание разрушает структуру геля, так что если раствор (после

оттаивания) процентрифугировать через специальный фильтр,

сквозь него пройдет только ДНК.

«Выуживание» известных молекул. Чтобы выудить из

раствора определенные молекулы, строение которых извест-

но (так называемые мишени), можно использовать взаимное

сродство комплементарных одинарных цепочек. Если мишени

представляют собой дво йные, а не одинарные цепочки, то на-

чинают с денатурации двухцепочечных молекул.

Допустим, что мы хотим извлечь одноцепочечные молеку-

лы α из раствора S, содержащего их наряду со многими други-

ми одноцепочечными молекулами. Для этого к специальному

фильтру присоединяют зонды, т. е. молекулы α, комплементар-

ные молекуле α, и пропускают раствор S через фильтр. При

этом молекулы α связываются с молекулами α, тогда как дру-

гие молекулы просто проходят через фильтр. Таким образом,

мы получаем остающийся на фильтре набор двухцепочечных

молекул, образованных за счет соединения α и α, и раствор S

полученный из S удален ием молекул α.

26 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

Затем фильтр переносят в контейнер, где прои сходит дена-

турация двухцепочечной ДНК. Когда фильтр удаляют, оста-

ются только молекулы-мишени.

Только что описанный метод фильтрации концептуально

очень прост, но сейчас применяется не так часто (поскольку

существуют лучшие методы).

Можно также присоединить зонды к крохотным стеклян-

ным бусинкам и затем плотно набить этими бусинками стек-

лянную колонку C. Когда раствор S, содержащий молекулы-

мишени, пропускается через C, молекулы-мишени связывают-

ся с зондами и остаются в C.

Еще один способ выловить мишени — это присоедини ть зон-

ды к мелким магнитным бусинкам и поместить эти бусинки в

раствор S. Если такую смесь хорошенько встряхнуть, то мише-

ни присоединяются к зондам и, следовательно, к магнитным

бусинкам. Поднеся магнит к стенке стеклянного контейнера,

в котором вс¨е это происходит, можно собрать все молекулы-

мишени в одном месте, откуда их легко извлечь.

1.2 Операции над ДНК

При описании методов работы с молекулами возможны две

крайности: л ибо похожий на словарь перечень приемов с их

краткой характеристикой, либо очень детальное описание каж-

дого приема. Мы выбрали нечто среднее между этими подхо-

дами — упрощенное описание, которое позволит ясно понять

суть используемого приема. Такой стиль представляется нам

наиболее подходящим для читателей данной книги.

Разделение и соединение цепочек. Мы уже отмечали, что

в молекуле ДНК водород ные связи между комплементарны-

ми основаниями разных цепочек значительно слабее, чем фос-

фодиэфирные связи между последовательн о расположенными

друг за другом нуклеотидами одной цепочки. Это позволяет

разделить две цепочки молекулы ДНК, не р азрушая каждую

отдельную цепочку. Один из способов разделения цепочек —

это нагревание раствора ДНК до тех пор, пока ДНК не распла-

1.2. Операции над ДНК 27

вится, что означает, что цепочки ДНК отделяются одна от дру-

гой. Этот процесс называется денатурацией. Плавление ДНК

происходит в диапазоне температур от 85

◦

C до 95

◦

C (чуть

ниже точки кипения); точкой плавления ДНК называют тем-

пературу, при которой разделяется половина молекул.

Если нагретый раствор охладить, разделенные цепочки

снова соединятся за счет водородных связей. При этом охла-

ждение должно происходить медленно, чтобы соответствую-

щие комплемента рные основания успели найти друг друга.

Соединение двух одинарных цепочек ДНК за счет спаривания

комплементарных оснований называют ренатурацией или

отжигом. Другой применяемый здесь термин — это гибриди-

зация, хотя первоначально такой термин использовался для

описания спаривания комплементарных оснований одинарных

цепочек различного происхождения (например, ДНК с РНК,

или ДНК с радиоактивно меченой ДНК, или цепочек ДНК,

выделенных из разных организмов). Такие терминологические

вольности для биологии более обычны, чем для математики.

Наконец, заметим, что некоторые химикаты ускоряют дена-

турацию двойных цепочек ДНК. Обыч но для этой цели исполь-

зуют ф ормамид — в его пр исутстви и температура плавления

значительно снижается.

Теперь перейдем к рассмотрению манипуляций с ДНК при

помощи ферментов.

Ферменты — это белки, катализирующие химические ре-

акции в живых клетках. Они высокоспецифичны — чаще всего

фермент ускоряет ровно одну химическую реакцию — и ис-

ключительно эффективны (реакции ускоряются в миллиарды

раз). Без ферментов химические процессы в клетке протекали

бы так медленно, что не могли бы поддерживать жизнь.

Поскольку ферменты столь важны для существования кле-

ток, природа создала множество ферментов для разноо браз-

ных изменений молекул ДНК. Их активно используют в гене-

тической инженерии.

Удлинение ДНК. Ферменты, способные добавлять нуклеоти-

ды к существующей мол екуле ДНК, называют полимеразами.

28 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

N N N

. . .

N N N N N N N N

NNNNN



Рис. 1.10. Молекула ДНК с неполной верхней цепочкой.

Для их работы необходимы: (1) одноцепочечная матри-

ца, которая определяет (в соответствии с комплементарно-

стью Уотсона–Крика) цепочку добавляемых нуклеотидов, и

(2) праймер, т.е. последов ательн ость со свободным 3

-концом

-гидроксилом), присоединенная к части матрицы. Отметим,

что полимераза способна наращивать цепочку только в 5

− 3

направлении (рис. 1.10).

Здесь и в последующих рисунках мы изображаем ДНК

разными способами, отличающимися от применявшихся выше

«стерженьковых» схем. Смысл этих рисунков будет само-

очевиден. Нет нужд ы фиксировать какое-то «каноническое»

изображение ДНК, и мы всякий раз используем то представ-

ление, которое лучше всего подходит к обсуждаемой ситуации.

Буква N на рис. 1.10 означает, что любой из 4 возможных

нуклеотидов может находиться в позиции, обозначенной N

(разумеется, при соблюдении принципа комплементарности).

Полимераза последовательно наращивает 3

-конец «корот-

кой цепочки», комплементарно дополняя последовательность

нуклеотидов на матри це, при условии, что в растворе, где про-

исходит реакция, имеется достаточное количество необходи-

мых нуклеотидов — см. рис. 1.11.

Как обычно для биологии, из этих правил есть исключения.

Хотя всем полимеразам для удлинения праймера необходим

свободный 3

-конец, существует несколько полимераз, которые

удлиняют молекулу ДНК без матрицы. Таковой является тер-

минальная трансфераза. Ее полезно использовать в т ех случа-

ях, когда следует добавить одноцепочечный «хвост» к обоим

концам двухцепочечной молекулы — рис. 1.12.

1.2. Операции над ДНК 29

T A Ц Ц TTTЦЦГ

Ц Г Г A A A T Г Г A

Г Ц Ц T T T A Ц Ц T

Ц Г Г A A A

TЦЦATTTЦЦГ

Ц Г Г A A

TЦЦATTTЦЦГ

Ц Г Г A

Рис. 1.11. Действие полимеразы.

Если нам нужно создать некоторую двухцепочечную моле-

кулу, одна цепочка (матрица) которой уже имеется, то это мож-

но сделать, присоединив к данной цепочке праймер, а затем

применив полимеразу для удлинения праймера в соответствии

с матрицей. Этот синтез идет в направлении 5

− 3

— природа

предпочитает это направление, поскольку и in vivo фермента-

тивный синтез ДНК идет таким образом.

Одноцепочечную молекулу с предписанной последователь-

ностью нуклеотидов можно синтезировать химическим путем.

По ряду технических причин химический синтез, присоединя-

ющий один нуклеотид за другим к уже построенной цепочке,

происходит в 3

− 5

направлении: 3

-конец первого нукл еотид а

30 1. Как устроена ДНК и как с ней работают

Г Г Г Г Г Г

терминальная трансфераза

Г нуклеотиды

Рис. 1.12. Действие трансферазы.

закрепляется на твердом основан ии, так что на каждом после-

дующем шаге только 5

-конец уже синтезированной цепочки

свободен для фосфодиэфирной связи с 3

-концом добавляемого

нового нукл еотид а. Благодаря своевременному блокированию

и разблоки рова нию свободного 5

-конца уже синтезированной

цепочки и 3

- и 5

-концов добавляемых нуклеотидов, можно

гарантировать, что на каждом шаге синтеза пр исоеди няется

только тот или иной специфический нуклеотид. Соответству-

ющие процедуры могут быть автоматизированы, и сейчас име-

ется много «синтезирующих роботов».

Короткие одноцепочечные молекулы, синтезированные хи-

мическим путем, называют олигонуклеотидами. Олигонуклео-

тиды широко используются в генетической инженерии, напри-

мер, в качестве праймеров.

Укорочение ДНК. Ферменты, обрезающие или разрезающие

ДНК, называют ДНК нуклеа зам и. Их делят на экзон уклеазы

и эндонуклеазы.

Экзонуклеазы укорачивают ДНК за счет последовательно-

го отсечения нуклеотидо в по одному с концов молекулы. Они

более гибки, чем полимеразы: одни экзонуклеазы удаляют нук-

леотиды с 3

-конца, в то время как другие — с 5

-конца. Неко-

торые экзонукл еазы действуют только на одноцепочечные мо-