Новотный Л., Хехт Б. Основы нанооптики
Подождите немного. Документ загружается.
4.2
Предел
разрешения
103
чения
некоторой
величины,
характеризующей
излучатель,
измеренного
в
плоскости
изображения.
Чтобы
продемонстрировать
основную
идею
осевого
разрешения
в
конфокальной
~!икроскопии,
рассмотрим
две
конкретные
ситуации.
Сначала
предположим,
что
свойства
диполя,
расположенного
на
оптической
оси,
описываются
интегральной
интенсивностью
в
плоскости
изображения.
Используя
итерационные
соотношения
.1.1Я
функции
Бесселя
(см.
задачу
З.4),
получим
~7Г
-х..
"(:)
==
J J
Е(р,ср,z)E*(p,cp,z)pdpdi.p
=
о
о
<1
7г
11.
[2
2 2 3
) 1
(р.,
+
/1у)(28
- 12cosB
max
- 12cos
В
тах
- 4cos
В
тах
)
+
24Е~Л
/1'
+ /1;(8 - 9
cos
Вшах
+
сов
ЗВ
тах
)].
(4.27)
Полученный
сигнал
имеет
размерность
v
2
и
зависит
от
числовой
апертуры
систе~1Ы
и
угла
H
lllax
.
Важнейшим
свойством
полученного
выражения
является
то,
что
оно
не
зависит
от
осевой
координаты
z!
Таким
образом,
если
диполь
смещен
с
Поl0СКОСТИ
объекта
в
направлении
оптической
оси,
получаемый
от
него
сигнал
будет
таким
же
сигналом
8,.
Такому
способу
детектирования
не
может
быть
поставлено
в
соответствие
осевое
разрешение.
Чтобы
получить
желаемое
осевое
разрешение,
необходимо осуществлять
про
странственную
фильтрацию
полей
в
области
изображения
до
того,
как
они
попадают
на
детектор.
Обычно
это
достигается
путем
помещения
точечного
отверстия,
радиус
которого
по
порядку
величины
равен
радиусу
диска
Эйри
(4.15),
на
плоскость
изображения
В
этом
случае только
центральная
часть
функции
рассеяния
точки
по
падает
на
детектор
Сушествуют
различные
методики
выбора
размера
отверстия
[7],
но
доlЯ
того
чтобы
проиллюстрировать
эффект,
достаточно
предположить,
что
только
ПО.lе
на
оптической
оси
попадает
на
детектор
через
точечное
отверстие.
Результирую
щий
сигнал
может
быть
вычислен
из
(4.16)
и
выглядит
следующим
образом:
82(:)
==
Е(р
=
О,
z)E*(p =
О,
z)(lA =
=~Jl;.+JL;NA4[Sill(nZ)]2dA
-
NA
2
z (4.28)
ё6Т1П'
л
б
м
2
nZ
,Z
=
2п'
м
2
л'
Здесь
(/А
представляет
собой
бесконечно
малую
площадь
точечного
отверстия.
Видно,
что
ДИПОJIЬ,
расположенный
на
оптической
оси,
имеющий
параллельный
ей
дипольный
момент,
не
может
быть
зарегистрирован
такой
системой,
т.
к.
его
поле
на
оптической
оси
равно нулю.
Для
того
чтобы
все-таки
зарегистрировать
такой
диполь,
надо
либо
увеличить
размер
точечного
отверстия,
либо
сдвинуть
диполь
с
оптической
оси.
Но
важно
другое:
(4.28)
содержит
в
себе
зависимость
сигнала
82
от
осевой
координаты
::.,
дающую
нам
осевое
разрешение!
Для
того
чтобы
вывести
это
разрешение,
рассмотрим
два
ДИПОJIЯ
на
оптической
оси
вблизи
плоскости
объекта.
Зафиксируем
один
из
диполей
в
плоскости
изображения,
а
второй
вынесем
с
плос
кости
изображения
на
расстояние
D.T.1.,
как
показано
на
рис.
4.5.
Линза
отображает
продольное
расстояние
в
пространстве
объекта
D.I'.1.
в
продольное
расстояние
в
про
странстве
изображения
!lILD.T .1.,
где
!lI
L
-
продольный
коэффициент
увеличения,
который
опредеJIяется
следующим
образом:
!I!L
=
ТI;!I!2.
n
( 4.29)
104
Гл
4
Просmрансmвенное
разрешение
и
Ka'lecmeo
позиционирования
I
11
(1I/1I/)Л1~
~,.
L
Плоскость
объекта
Плоскос
гь
IпобраЖСНIIЯ
Рис
4 5
Осевое разрешение
в
конфокальной
микроскопии
Точечное
отверстие
на
оптическоii
оси
в
пространстве
изображения
осуществляет
пространственную
фильтраllИЮ
изображения
перед
тем,
как оно
направляется
на
детектор.
Точечное
отверстие
ПРОПУСI<ает
только
те
ПО.1Я.
которые
находятся
вблизи
оптической
оси,
формируя,
таким
образом,
осевое
разрешение
Он
зависит
от
поперечного
коэффициента
увеличения,
задаваемого
(4 12).
и
коэффициентов
преломления
n
и
n'
для
пространств
объекта
и
изображения
соот
ветственно.
Поместим
детектор
в
плоскости
изображения
(.:
=
О)
В
соответствии
с
(4.28)
сигнал
диполя,
лежащего
в
плоскости,
является
максимальным,
а
сигна.l
диполя,
находящегося
вне
плоскости,
задается
следующим
образом
')
., 2
(
_)
'"
sin"[71'NA
дТ1./2n>']
82
'" 2 2
[71'N
А
дт
1./211>']
(4.30)
Чтобы
убедиться,
что
весь
сигнал определяется
диполем,
наХОДЯЩИI\1СЯ
в
П,10С
кости,
необходимо
потребовать,
чтобы
вклад
диполя,
находящегося
вне
плоскости.
был
равен
нулю.
Это
возможно,
если
наложить
условие
на
расстояние
~"-,-
~,еЖJУ
диполями:
lllin
[ДТ
.L]
= 2
n>..).
NA-
(431
)
Это
расстояние
определяет
осевое
разрешение
системы.
Только
диполи,
нахо
дящиеся
в
пределах
расстояния
l11ill
[Дr.L]
от
плоскости
изображения,
вносят
су
щественный
вклад
в
сигнал
детектора.
Поэтому
величина
lllill
[Д".L]
называется
глубиной
фокусировки.
Кроме
того,
с
формированием
поперечного
разрешения.
равного
по
порядку
величины
l1lill
[Д/'II]'
в
конфокальной
микроскопии
OДHOBpe~,eHHO
возникает
осевое
разрешение,
равное
по
порядку
величины
шill
[Д".L]
Это
позволяет
получить
трехмерное
изображение
объекта.
И
если
поперечное
разрешение
уве.1И
чивается
линейно
с
ростом
числовой
апертуры,
осевое
разрешение
растет
с
ростоы
числовой
апертуры
квадратично.
Например,
на
рис.
4.6
представлено
изображение
колючей
пыльцы,
полученное
с
помощью
конфокальной
микроскопии
[8]
Трехмерное
изображение
восстановлено
из
наложения
множества
изображений
в
разрезе,
сдви
нутых
друг
относительно
друга
вдоль
оси
z
примерно
на
211)../Л"
Л~.
Более
дета.1ЬНО
экспериментальные
аспекты
формирования
осевого
разрешения
мы
будем
оБСУЖJ.ать
в
гл.
5.
1)
Мы
предполагаем,
что
диполи
излучают
некогерентно,
т
е
IEI
2
=
IE
1
1
2
+
IE~12
O.:rHahO
для
когерентно
излучающих
диполей.
т
е
когда
IEI
2
=
IE
1
+
E21~,
ситуаllИЯ.
по
сушеств~
аналогична
-
Примеч
авm
4 2
Предел
разрешения
105
Рис
4 6
Изображение
колючей
пыльцы
размером
25
мкм,
полученное
при
помощи
конфокаль
ноП
~IИI(РОСI<ОIIИИ
Трехмерное
восстановление
основано
на
наложении
множества
изображений
в
разрезе
(слева)
и
единственного
изображения
в
разрезе
(справа)
Из
[8]
4.2.3.
Увеличение
разрешения
посредством
насыщения.
Мы
затронули
выше
вопрос
о
том.
ка"
фУНI\ЦИЯ
рассеяния
точки
может
быть
сжата
по
ширине
за
счет
не.lИнеЙных
взаимодействий,
т.
е.
в
случае,
когда
ширина
функции
E2n
rll
меньше
че~1
Е~ГII
Сходное
рассуждение
может
быть
проведено
с
при
влечением
эффекта
насышения.
"ак
было
показано
в
пионерских
работах
Хилла
(HelI)
с
соавторами
[9].
Д.1Я
этого
необходимо,
во-первых,
чтобы
нулевое значение
интенсивности
попадало
в
интересующую
нас
область,
и,
во-вторых,
чтобы
в
материале
мишени
можно
было
найти
обратимый
насыщающийся
линейный
переход.
Чтобы
продемонстрировать,
как
насыщение
может
быть
использовано
для
увели
чения
разрешения
во
флуоресцентной
микроскопии,
рассмотрим
плотный
образец,
состоящий
из
случайным
образом
ориентированных
молекул,
которые
могут
быть
промоделированы
двухуровневыми
системами,
как
показано
на
рис.
4.7,
а.
Каждая
двухуровневая
система
взаимодействует
с
двумя
лазерными
полями:
во-первых,
с
возбуждающим
полем
Е,.,
которое
заселяет
возбужденный
уровень
11),
и,
во-вторых,
с
полем
Е,[,
которое
вызывает
вынужденный
распад
возбужденного
уров
ня
Если
интенсивность
поля
испускания
достаточно
велика,
уровень
10)
насыщается.
На
рис.
4
7,
б
показан
характерный
профиль
интенсивности
полей
поглощения
и
испускания.
Вдали
от
насыщения
уровня
11)
скорость
поглощения
системы
име
ет
вид
(4.32)
где
rт
-
сечение
однофотонного
поглощения,
а
I
f
:
-
интенсивность
возбужда-
ющего
поля
Е,.
Если
система
находится
в
возбужденном
состоянии,
вероят
ность
спонтанного
испускания
фотона
(испускания
сигнала
флуоресценции)
рав-
на
~
"("+"(d
(4.33)
Здесь
~/1
-
скорость
спонтанного
распада,
"/d
-
скорость
вынужденного
испускания.
Последняя
может
быть
записана
в
виде
(4.34)
106
Гл
4.
Пространственное
разрешение
и
качество
позиционирования
1
б
а
~
в
11),.
I
1"
1"
u 0,8
о
~
0,6
:s:
u
i3
0,4
f-
10)
4 6
3
т"
""
Рис
4.7.
Иллюстрация
идеи
увеличения
разрешения
посредством
насыщения:
а
-
схема
энер
гетических
уровней
двухуровневой
молекулы,
скорость
поглощения
'У,
•
скорость
спонтанного
распада
'Ут,
скорость
вынужденного
испускания
'Yd;
б
-
поперечные
профили
интенсивности
для
поглощения
и
вынужденного
испускания.
Нулевое
значение
вынужденного
испускания
находится
в
точке
максимума
поля
испускания;
в
-
поперечный
профиль
флоуреСllеНllИИ
(А:,
).
для
двух
различных
значений
пара
метра
истощения
уровня
d
p
=
О
и
(l"
=
100
Чем
больше
этот
пара
метр,
тем
уже
пик
флуоресценции
где
I
d
-
интенсивность
поля,
индуцирующего
испускание.
Учитывая
одновременно
(4.32)
и
(4.33),
запишем
скорость
флуоресценции
всей
системы
в
виде
(
)
()
'Ут
(1
I,.(r) (435)
'ijl
r =
'Уе
r
"'т
+ "'d(r) - - ,
I I
nr.cJo
1 + d,,(r)
где
мы
ввели
nарам.етр
истощен.ия
уровн.я
dp(r)
==
~.
~
Id(r),
1ШJо'Уr
(436)
соответствующий
отношению
скоростей
вынужденного
и
спонтанного
испускания
Для
слабого
поля,
индуцирующего
испускание,
мало
и
вынужденное
испускание
(d
p
---+
О),
в
таком
случае
скорость
флуоресценции
сводится
к
известному
уже
выра
жению
(4.32).
Теперь
перейдем
к
обсуждению
связи
между
этими
простейшими
предстаВ.lе
ниями
и
вопросом
О
разрешении
в
оптической
микроскопии.
Очевидно,
что
если
d
p
=
О,
то
разрешение
изображения,
возникающего
в
процессе
флуоресценции,
будет
определяться
шириной
возбуждающего
поля,
показанного
на
рис.
4.7,
б.
Однако
если
для
стимулирования
вынужденного
испускания
мы
будем
использовать
ПО.lе.
обладающее
нулевым
значением
в
максимуме
возбуждающего
поля,
эта
ширина
может
быть
существенно
сокращена
в
зависимости
от
величины
€lp.
Данное
явле
ние
проиллюстрировано
на
рис.
4.7,
в
для
d
p
= 100.
В
принципе,
ограничений
на
подобное
сужение
области
флуоресценции
нет,
и
поэтому,
теоретически,
может
быть
достигнуто
произвольное
разрешение.
Вводя
пара
метр
истощения
уровня
в
критерий
Аббе,
получим
приблизительное
соотношение
rniп[Дrll]
~
0,6098 ffl (4.37)
NA
l+dl'
Таким
образом,
если
d
p
>
О,
это
всегда
будет
при
водить
к
улучшению
разре
шения.
Необходимо
отметить,
что
увеличение
разрешения,
основанное
на
насыще
нии,
не
ограничивается
проблемой
формирования
изображений.
Аналогичная
идея
реализуется
в
литографии
и
задачах
хранения
информации
при
условии
наличия
материалов
с
необходимыми
поглощающими/насыщающими
свойствами.
И,
наконец.
необходимо
понимать,
что
увеличение
разрешения
посредством
насыщения
требует
наличия
у
вещества
довольно
специфических
свойств,
которые
имеет,
например.
флюорофор.
В
этом
смысле
электронная
структура
мишени
должна
быть
известна
4 3
Принциnы
конфокальной
микроскопии
107
заранее,
и,
следовательно,
никакой
дополнительной
спектроскопической
информации
~IЫ
не
получаем.
Тем
не
менее
информацию
о
биологических
образцах
мы
получаем,
как
правило,
при
помощи
химического
маркирования
флюорофора.
4.3.
Прииципы
коифокаJIЬИОЙ
микроскопии
в
настоящее
время
конфокальная
микроскопия
-
это
техника,
применяющаяся
в
различных
сферах
научного
исследования
от
физики
твердого тела
до
биологии.
Основной
ее
идеей
является
облучение
образца
сфокусированным
светом,
исходя
щим
из
точечного
источника
(или
одномодового
лазера)
и
направление полученного
отклика
на
точечное
отверстие,
как
обсуждалось
в
разд.4.2.2.
Эта
базовая
идея
была
разработана
Минским
(Minsky)
в
его
патентном
предложении
1955
года
[10].
С
тех
пор
были
развиты
самые
различные
варианты
реализации
схемы
конфокальной
мик
роскопии.
Их
различие
состоит,
как
правило,
в
характере
процесса
взаимодействия
света
и
вещества,
это
может
быть
рассеяние
света,
флуоресценция,
многофотонная
флуоресценция,
вынужденное
испускание,
генерация
третьей
гармоники
и
КАРС.
В
этом
разделе
мы
будем
рассматривать
лишь
основные
идеи,
лежащие
в
основе
конфокальной
микроскопии,
используя
тот
теоретический
материал,
который
мы
обсуждали
выше.
Экспериментальные
аспекты
будут
рассмотрены
далее,
в
гл.
5.
Более
детальные
подходы
можно
найти
в
книгах,
посвященных
конфокальной
мик
роскопии
[11-13]
для
того
чтобы
понять,
как
формируется
изображение
в
конфокальной
микро
скопии,
рассмотрим
схему,
показанную
на
рис.
4.8.
Эта
схема
представляет
собой
частный
случай
общей
схемы,
представленной
на
рис.
4.4.
В
данной
ситуации
возбуждение
и
детектирование
осуществляются
через
те
же
объективы,
но
по
об
ратному
световому
пути.
Светоделительная
пластина
позволяет
возбуждающему
и
.1етектируемому
пучкам
распространяться
по
двум
различным
оптическим
путям.
Во
флуоресцентной
микроскопии
светоделительная
пластина
обычно
дополняется
.1ихроичным
зеркалом,
которое
пропускает
и
отражает
свет
лишь
в
определенном
Возбуждающий
пучок
$
Дстскгор
П.lОСКОСТЬ
И'юбражсния
j'
j
Плоскость
объекта
Рис
4 8
Схема
обратной
конфокальной
микроскопии
В
данной
установке
неизменным
яв
.lяется
световой
путь,
а
образец
смещается
в
трехмерном
пространстве
для
сканирования.
Светоделительная
пластинка
разделяет
исходный
пучок
на
два
пучка,
распространяющиеся
по
двум
различным
оптическим
путям'
возбуждающий
и
детектируемый
Лазерный
пучок
фоку
сируется
на
поверхность
образца
при
помощи
линзы
с
высокой
числовой
апертурой, создавая
пространственно
локализованный
источник
возбуждения.
Отклик
от
образца
фокусируется
той
же
линзой
на
точечное
отверстие,
находящееся
перед
детектором
108
Гл
4.
Пространственное
разрешение
и
качество
позиционирования
спектральном
диапазоне,
благодаря
чему
повышается
эффективность
этого
процесса.
Для
того
чтобы
придерживаться
максимальной
простоты
изложения,
преДПОЛОЖИ~I,
что
образец
содержит
одну
частицу,
излучающую
как
диполь,
и
может
перемещаться
во
всех
трех
направлениях
относительно
неподвижной
оптической
системы.
Тогда
мы
можем
положить
г
в
=
О,
а
для
обозначения
координаты
частицы
будем
использовать
вектор
г
n
=
(х
n
,
Уn,
Zn).
Для
получения
изображения
мы
должны
присвоить
каждому
значению
вектора
г"
какую-либо
скалярную
величину,
измеренную
в
плоскости
изображения.
В
кон
фокальной
микроскопии
эта
величина
соответствует
введенному
выше
значению
сигнала
82.
В
то
же
время
в
неконфокальной
микроскопии
эта
величина
представляет
собой
сигнал
8\.
Процесс
формирования
изображения
включает
три
стадии.
1.
Нахождение
возбуждающего
поля
в
плоскости
объекта
(разд.
3.5
и
3.6). -
функция
рассеяния
точки
ДJIЯ
процесса
возбуждения.
2.
Расчет
взаимодействия.
3.
Расчет
поля
отклика
в
плоскости
изображения
(разд.
4.1).
-+
функция
рассея
ния
точки
ДJIЯ
процесса
испускания.
На
первом
шаге
мы
получаем
поле
возбуждения
Е
ехс
•
Оно
зависит
не
только
от
пара
метров
конфокальной
системы,
но
и
от
падающего
лазерного
поля.
Процесс
взаимодействия
возбуждающего
поля
Е
ехс
с
диполем
будем
считать
линейным,
сле-
довательно:
(4.38)
Таким
образом,
отклик
диполя
в
плоскости
изображения
определяется
выраже
нием
(см.
(4.6»
(439)
Рассматривая
эти
два
выражения
совместно
и
исключая
11",
получим
поле
в
плос
кости
изображения
как
функцию
возбуждающего
поля,
поляризуемости
частицы
и
пара
метров
системы.
Для
решения
этих
уравнений
необходимо
понять,
как
происходит
отображение
из
пространства
объекта
в
пространство
изображения.
Точка
поля
в
пространстве
изображения
задается
вектором
г.
Ранее
мы
нашли,
что
диполь
11",
находящийся
в
начале
координат
(г"
=
О),
в
пространстве
изображения
формирует
поле
Е(./·,.II.
:)
в
соответствии
с
соотношениями
(4.6)-(4.10).
Если
мы
сдвинем
диполь
из
начала
координат
в
произвольную
точку
В
пространстве
объекта,
поле
в
пространстве
изображения
преобразуется
следующим
образом:
Е(х,
У,
z)
-+
Е(х
-
хnм,
у
-
УnМ'
z - z"AI
2
1/'
/'1/.).
(4.40)
где
А!
-
коэффициент
поперечного
увеличения,
определяемый
(4.12).
Точечное
от
верстие
пропускает
это
поле
частично,
а
находящийся
за
ним
детектор
осуществляет
усреднение
по
координатам
х,
у.
Предположим
для
простоты,
что
точечное
отверстие
настолько
мало,
что
это
позволяет
нам
ограничить
детектируемый
сигнал
поле~I
в
точке
r =
О,
умноженным
на
бесконечно
малую
площадку
(IA
(см.
(4.28».
Тогда
сигнал
детектора
будет
зависеть
только
от
координат
диполя'
(441 )
Поле
Е(хnМ,
УnМ,
;;nМ2n'
/n)
может
быть
получено
из
(4.6)-(4.10)
с
помощью
подстановки
р
-+
р"А!,
z
-+
znJv12n'
/n.
'Р
-+
'Рn.
Тогда
сигнал
детектора
окончательно
4 3
Прин,циnы
кон,фокальн,ой
.микроскопии
109
принимает
вид
(4.42)
где
(4.43)
а
интегралы
100
-
102
В
пнис
1
00
(р",
:.,,) =
(.,~
Z"
(f'
IЛ2
f
(сов
О)
1/2
sin
О(
1 + cos
O)JO(kpn
sin
O)e-~kzn
sin
2
е
dO,
О
8
IIшх
Т
О1
(р".
:,,)
=("~
z"
(('
/
л
2
f
(сов
О)
1/2
s
in
2
OJI
(kpn sin
O)e-~kz"
sin
2
е
dO,
О
Вшах
(4.44)
101
(р",
::;,,)
=
("~~"
(f'
IЛ2
f
(сов
0)1/2
sin
О(
l-cos
0)J2(kp71
sin
O)e-~kzn
bin
2
е
dO.
О
Поле
зависит
от
величины
и
ориентации
диполя
J.I.n,
которые,
в
свою
очередь,
зависят
от
природы
взаимодействия
между
возбуждающим
полем
Е
ехе
и
частицей,
из.1учающеЙ
как
диполь.
Как было
показано
в
разд.
3.6,
возбуждающее
поле
может
быть
произвольно
сфокусированной
модой
лазера.
Будем
полагать,
что
имеем
дело
с
основной,
гауссовой,
модой,
т.
к.
именно
она
используется
в
большинстве
кон
фокальных
устройств.
Предположим
также,
что
пучок
сфокусирован
на
плоскость
объекта
и
что
направление
его
распространения
совпадает
с
оптической
осью.
В
со
ответствии
с
(3.66)
и
(4.38)
дипольный
момент
может
быть
записан
в
виде
(
)
=
'kfE
-Ikj
~
О:уу
(/02
sin
2t.p7l)
[
О:хх
(100
+
102
cos
2t.p71)
]
11"
VJ
t
ое
2
R"
'
O:zz(
-/02
сов
2t.pn) V
~
(4.45)
Г.1е
(\"
-
диагональные
элементы
поляризуемости,
а
Е
о
-
амплитуда
падающего
параксиального
гауссова
пучка.
Интегралы
100
- 102
задаются
соотношениями
(3.58)-
(3.60)
и
имеют
вид
fJ
lIшх
lоо(р",
:,,) = f fll.(O)(cosO)I/2 sinO(l +
cosO)JO(kp71
sinO)e
ikzn
cosedO,
о
811111'1:
10I(P",:',,) = f
fll.(0)(COHO)I/2sin20JI(kpnsinO)eikz"CObedO,
О
102«(J",
:,,)
=
Н'Г
flll(O)(COHO)I/2
sinO(l -
cosO)J2(kp71
sinO)e
tkzn
cosedO,
О
(4.46)
110
Гл
4.
Пространственное
разрешение
и
качество позиционирования
где
функция
!w
оп.ееделяет
расширение
пучка
относительно
выходной
апертуры
линзы.
Интегралы
l
nт
отличаются
от
интегралов
l
nт
только
множителем
!II'«())
и
экспоненциальными
множителями,
которые
при
малых
углах становятся
близки
к
единице
(cos
О
~
1 -
402,
sin
2
О
~
(2).
Используя
(4.42),
мы
можем
теперь
вычислить
конфокальный
сигнал
в
плоскости
изображения.
Однако
для
того
чтобы
понять
самую
суть
конфокальной
микроскопии,
разумно
будет
еще
несколько
упростить
получающиеся
выражения.
Предположим,
что
падающий
пучок
достаточно
широк.
т.
е.
!w(O)
=
1,
а
экспоненциальные
множители
не
вносят
существенного
вклада.
так
что оба
набора
интегралов
совпадают.
Кроме
того,
пренебрежем
вкладом
102
по
сравнению
со
100
и
будем
считать,
что
диполь
жестко
фиксирован
вдоль
направле
ния
поляризации,
т.
е.
О:уу
= O:zz =
О.
Результирующий
сигнал
детектора
полностью
совпадает
с
тем,
который
следует
из
вычислений
в
рамках
чисто
скалярных
прибли
жений,
и
имеет
вид:
конфокальный
сигнал
(
1
'>
12
82
х
n
,
Уn,
z,,;w)
rv
0:"./00 (IA.
(447)
Важным
свойством
полученного
выражения
является
то,
что
интеграл
входит
в
него
квадратично.
Это
означает,
что
функция
рассеяния
точки
в
конфокальной
микроскопии
по
существу
квадратична
относительно
этой
функции
в
обычной
мик
роскопии!
Таким
образом,
конфокальная
микроскопия
не
только
обладает
oceBЫ~I
разрешением,
но
и
повышает
поперечное
разрешение.
Это
обстоятельство
возникает
в
результате
всего
лишь
установки
перед
детектором
точечного
отверстия.
Если
отверстие
убрать
и
все
излучение
с
плоскости
изображения
направить
на
детектор.
сигнал
будет
иметь
такой
вид:
неконфокальный
сигнал
( 4.48)
Это
выглядит
несколько
странным:
ведь
в
предыдущем
разделе
мы
заключили.
что
в
обычной
микроскопии
в
дальнем
поле
нет
осевого
разрешения
Однако
там
~Ibl
предположили,
что
объект
освещается
равномерным
светом.
Наличие
осевого
разре
шения
в
данном
случае
обусловлено
пространственной
локализованностью
источника
возбуждающего
поля,
представляющего
собой
сфокусированный
лазерный
пучок.
а
также
наличием
только
одного
дипольного
излучателя
в
объеме
образца
Если
бы
мы
имели
плотную
среду
диполей
(см.
задачу
4.3),
никакого
осевого
разрешения
в
ней
в
рамках
неконфокальной
микроскопии
мы
не
получили
бы
Тем
не
менее
~Ibl
ясно
видим,
что
точечное
отверстие
в
конфокальной
микроскопии
увеличивает
как
поперечное,
так
и
продольное
разрешение.
Полная
функция
рассеяния
точки
оптической
системы
может
быть
представлена
как
произведение
функции
рассеяния
точки
для
процесса
возбуждения
и
функции
рассеяния
точки
для
процесса
детектирования:
1
ПОЛНАЯ
ФРТ
~
ФРТ
ВОЗБУЖДЕНИЯ
х
ФРТ
ДЕТЕКТИРОВАНИЯ
1.
(449)
где
первый
сомножитель
определяется
распределением
поля
сфокусированного
воз
буждающего
пучка,
а
второй
-
свойствами
точечного
отверстия,
находящегося
в
плоскости
изображения
как
фильтра
пространственных
частот.
Однако
мы
должны
помнить
о
том,
что
увеличение
поперечного
разрешения
в
конфокальной
микроско
пии
довольно
невелико,
часто
оно
составляет
небольшой
процент.
При
это
нули
функции
рассеяния
точки
не
сдвигаются,
только
максимумы
становятся
несколько
уже.
Преимущество
конфокальной
микроскопии
проявляется
значительно
ОЩУТИl\lее
в
возможности
осевого
различения
в
плотных
образцах
(см
задачу
4 3).
Подчеркне~I.
что
сведение
двух
наборов
интегралов
(4.44)
и
(4.46)
к
одному
является
довольно
грубым
приближением.
Это
может
быть
сделано,
только
когда
профиль
возбуж-
4 4
Осевое
разрешен,ие
в
мн,огофоmон,н,ой
микроскопии
111
дающего
поля
гауссов.
потому
что
только
в
этом
случае
симметрии
возбуждения
и
детектирования
совпадают.
Анализ
становится
более
сложным,
если
в
качестве
возбуждающего
пучка
мы
будем
использовать
пучок,
содержащий
более
высокие
моды
На
рис.
4.9
показана
экспериментально
измеренная
функция
рассеяния
точки.
Она
была
получена
путем
поточечного
сканирования
частицы
золота
в
фокальной
об
.1асти
сфокусированного
возбуждающего
пучка,
в
процессе
которого
осуществлялась
запись
интенсивности
рассеянного
света
в
каждой
точке.
Вследствие
сферической
симметрии
эта
частица
не
обладает
выделенной
дипольной
осью
и,
следовательно,
(\
1 1 =
(\
//1/
=
O:Z·
Экспериментальные
аспекты
конфокальной
микроскопии
будут
обсуждаться
более
подробно
в
разд.
5.1.1.
Рис
4 9
Полная
функция
рассеяния
точки
(ФРТ),
измеренная
путем
перемещения
частицы
30~OTa
в
фокусе
лазера
и
детектирования
интенсивности
рассеянного
излучения
в
каждой
точке.
Заимствовано
из
[9]
Дальнейшим
развитием
представленного
подхода
может
стать
учет
нелинейности
взаимодействия
между
частицей
и
возбуждающим
пучком.
Например,
с
учетом
неко
торых
предположений
и
приближений,
подобных
сделанным
ранее,
для
нелинейного
процесса
второго
порядка
получим
конфокальный
сигнал.
неконфокальный
сигнал:
82(Х
n
,
Y,~,
Zn;
2"",)
f'V
l.вжж:r1оо(2"",)1&(""')12dА;
.91
(x
n
,
Уn,
zn;
2"",)
f'V
l.вж:rж1ооI2("",)dА.
(4.50)
(4.51)
В
этом случае
мы
должны
иметь
в
виду,
что
возбуждение
возникает
на
часто
те
w).
в
то
время
как
детектирование
осуществляется
на
частоте
2"",.
Часто
говорят
о том.
что
нелинейное
возбуждение
увеличивает
разрешение.
Однако
это
не
так.
Хотя
нелинейное
взаимодействие
приводит
к
сужению
функции
рассеяния
точки,
оно
требует
больших
длин
волн
возбуждающего
поля.
И
если
радиус
диска
Эйри
растет
пропорционально
увеличению
длины
волны.
то
влияние
указанного
эффекта
при
умножении
функции
на
саму
себя
не
столь
велико.
Таким
образом,
эффекты,
связанные
с
увеличением
длины
волны,
превалируют.
4.4.
Осевое
разрешение
в
многофотонной
микроскопии
Мы
установили,
что
преимущество
конфокальной
микроскопии
не всегда
связано
с
увеличением
поперечного
разрешения,
но
всегда
-
с
увеличением
продольного
разрешения.
Продольное
разрешение
позволяет
увеличивать
частоту
следования
кад
ров
в
процессе
подлинно
трехмерной
визуализации.
Такие
же
преимущества
имеет
и
многофотонная
микроскопия,
однако
при
этом
она
не
требует
тех
приспособлений,
112
Гл
4
Пространственное
разрешение
и
качество позиционирования
которые
используются
в
конфокальной
микроскопии.
В
многофотоннои
флуоресцент
ной
микроскопии
сигнал
в
точке
r
качественно
задается
следующим
соотношение~!
в(г)
'"
(171
[Е(г)
.
Е*(г)]",
(452)
где
(171 -
поперечное
сечение
n-фотонного
поглощения,
а
Е
-
возбуждающее
ПО.lе
В
плотном
образце
флюорофора
полный
сигнал,
генерируемый
в
сферическом
объеме
радиуса
R,
может
быть
подсчитан
следующим
образом:
271"
71"
R
Btota!
'"
(1n
f f f
IЕ(r,(},Ф)1211r2~;i11(Ыf"(J(МФ.
о о о
(453)
На
больших
расстояниях
от
фокуса
возбуждающее
лазерное
поле
спадает
по
закону
r-
I
и,
следовательно,
интеграл
при
n = 1
не
сходится.
Таким
образом,
невоз
можно
без
использования
конфокального
точечного
отверстия
локализовать
сигна.l
однофотонного
поглощения
на
оси.
Однако
при
n > 1
ситуация
качественно
иная
Сигнал
только
начинает
генерироваться
вблизи
фокуса,
как показано
на
рис
4
10.
полученном
с
помощью
(4.53)
для
случая
гауссова
пучка
с
радиусом
перетяжки
Рис
4.10
Локализация
объема,
в
котором
происходит
возбуждение
в
многофотонной
микро
скопии
На
рисунке
показан
сигнал,
генерируемый
в
плотном
образце,
расположенном
внутри
сферы
радиуса
R,
при
облучении
его
гауссовым
пучком,
осуществляющим
II-фотонное
ПОГ.l0-
щение
В
отличие
от
многофотонного
поглощения
(n
>
1),
в
случае
однофотонного
поглощения
(n
=
1)
мы
не
можем
ограничить
объем
без
использования
конфокального
точечного
отверстия
ШО
=
>"/3.
И
хотя
мы
использовали
параскиальное
приближение
и
пренебрегли
тем
фактом,
что
в
многофотонной
микроскопии
используются
большие
длины
волн.
общее
утверждение
о
том,
что
для
локализации
объема,
в
котором
происходит
возбуждение,
необходимы
процессы
сп>
1,
остается
неизменным.
Именно
это
об
стоятельство
делает
многофотонную
микроскопию
столь
привлекательным
MeTOДO~!
В
гл.
5
мы
обсудим
многофотонную
микроскопию
более
детально.
4.5.
Точность
позиционирования
Мы
видели,
что,
когда
мы
используем
оптический
микроскоп
для
визуализации
флуоресцентных
объектов,
имеющих
пространственную
протяженность
в
суБВО.l
новом
диапазоне,
построенное
двумерное
распределение
флуоресценции
(например.
в
плоскости
х
-
у)
соответствует
двумерной
проекции
соответствующей
трехмернои
функции
рассеяния
точки.
Полученные
таким
образом
отдельные
картинки
можно