Новотный Л., Хехт Б. Основы нанооптики
Подождите немного. Документ загружается.
4 5
Точность
позиционирования
113
ИСПО.1ьзовать
для
точного
вычисления
(х
-
у)-координат
излучателя
[14-17].
Точ
ность
определения
положения
единичного
излучателя
много
лучше,
чем
простран
ственная
ширина
функции
рассеяния
точки
и
поэтому,
как
будет
показано
ниже,
ограничена
только
«качеством»
информации,
т.
е.
процентом
шума
в
полученном
сигнале
РIIС
4
11
Численное
моделирование
процесса
построения
изображения
объекта,
представля
ющего
собой
два
близко
расположенных
излучателя,
на
фоне
постоянного
пуассонова
шума
ИЗ,l~
чатели
моделируются
гауссовым
профилем
с
пуассоновым
шумом,
нескоррелированным
с
фоновым
шумом
а
-
два
излучателя
без
учета
уровня
дискриминации
фотонов,
6,
в
-
от
.1e,lbHble
распределения,
полученные
при
введении
порога
дискриминации
по
энергии
фотонов.
Распределения
смещаются
на
конечную
величину
~x
Например.
при
отслеживании
движущихся
объектов
точность
может
достигать
нескольких
нанометров.
Кроме
того,
если
фотоны,
попадающие
на
детектор,
могут
быть
дискриминированы
по
уровню
любой
их
измеряемой
характеристики,
например
энергии.
поляризации,
времени
попадания
на
детектор,
то,
как
обсуждалось
ранее,
они
:о.югут
быть
при
вязаны
к
определенному
объекту,
даже
если
находятся
очень
близко
и
их
изображения
перекрываются.
Эта
идея
проиллюстрирована
на
рис.
4.11.
На
рисун
ке
(а)
общая
картинка
состоит
из
двух
отдельных
пятен.
Если
фотоны,
формирующие
эти
пятна,
могут
быть
дискриминированы,
например,
как
красные
и
зеленые
фотоны
(рис.
4
11,
б
и
в),
то
положение
излучателей
и,
следовательно,
расстояние
между
ними,
\югут
быть
измерены
с
субволновой
точностью.
Такой
способ
получения
субволновой
точности
позиционирования
является
важным
методом,
применяемым
в
астрономии
[14].
биофизике
[17],
а
также
в
аналитической
[19]
и
физической
химии
[20].
4.5.1.
Теоретические
основания
метода.
В
целом
существует
множество
спо
собов
нахождения
координаты
изолированного
излучателя.
Например,
можно
вычис
~ить
«центр
масс»
данного
распределения
исходя
из
интенсивностей
каждой
точки
И.1И
использовуя
корреляционный
метод.
Для
того
чтобы
оценить
точность,
с
которой
находится
координата
объекта,
необходимо
оценить
неопределенность
в
измерении
его
положения.
Таким
образом,
разумно
было
бы
аппроксимировать
функцию
рас
сеяния
точки
удобной
модельной кривой
и
затем
подогнать
эту
модельную
кривую
к
по.пученным
данным,
минимизируя
х
2
,
сумму
квадратов
отклонений
полученных
.laHHblX
в
каждой
точке,
от
модельной
кривой.
Так
как
параметр
х
2
отражает
веро
ятность
того,
что
определенный
набор
данных
является
достоверным,
то
его
можно
использовать
для
введения
пределов
достоверности
по
каждому
из
подгоночных
па
раl\lетров.
Таким
образом,
используя
х2-статистику, не
только
можно
получить
набор
оптимальных
подгоночных
параметров
для
заданной
модели,
но
и
соответствующий
набор
стандартных
отклонений
для
полученных
в
процессе
измерения
данных.
Приводимый
здесь
анализ
основан
на
работе
Боброва
(ВоЬгоП)
[14],
в
которой
используется
критерий
максимального
правдоподобия
информации
с
гауссовым
рас
пределением
ошибок.
Более
общие
подходы
также
обсуждаются
в
литературе
[16].
8
Л
НовотныИ.
Б
Хехт
114
Гл.
4
Пространственное
разрешение
и
качество
позиционирования
Рис
4.12
Отклонение
функции
Эйри
от
функции
Гаусса.
для
зашумленнои
информаuии
отклонения
пренебрежимо
малы
Мы
ограничимся
рассмотрением
частного
случая
аппроксимации
двумерного
raycco-
ва
распределения
методом
наименьших
квадратов.
Двумерное
raYCCOBO
распреде.1е
ние
очень
хорошо
описывает
распределения
интенсивности
получаемых
в
оптической
микроскопии изображений
субволновых
излучающих
объектов.
И
хотя
функция
Эйри
является
еще
более
приближенной
к
реальности
моделью,
все-таки
по
причине
не
очень
хорошего
качества
сигнала
значительных
систематических
отклонений
одного
метода
от
другого
не
возникнет.
Однако
в
отдельных
случаях,
в
зависимости
от
характера
задачи,
приходится
все-таки
использовать
более
сложные
моде.1И
Например,
сложные
распределения,
возникающие
в
конфокальной
микроскопии
при
облучении
образца
пучком
с
кольцевым
профилем
интенсивности
или
еще
бо.lее
высокими
модами.
Разумеется,
для
аппроксимации
надо
использовать
более
слож
ные
модели
[21].
Предлагаемый
анализ
может
быть
модифицирован
применительно
к
этим
случаям.
Для
двумерного
raYCCOBa
распределения
интенсивности
(454)
необходимо
определить
пять
параметров,
таких
как
пространственные
координаты
максимумов
ХО и
УО
(т.
е.
положение
пятен),
амплитуду
А,
ширину
')
и
уровень
фонового
излучения
В.
В
некоторых
случаях
ширину
функции
рассеяния
точки
-
можно
считать
известной
из
независимых
измерений.
Это
сокращает
число
подгоноч
ных
параметров
и
увеличивает
точность
оставшихся
параметров
примерно
на
1
ОУ!
•
как
будет
показано
ниже.
Как
правило,
экспериментальные
данные
представляют
собой
конечный
набор
точек
(X
1
,
Yi),
например
соответствующие
пикселам
се
D-чипа
или
координатам
отсканированного
изображения.
Каждой
точке
(;l~"
1/1)
ставится
в
соответствие
уровень
сигнала
D(i,
j)
и
значение
ошибки,
например
в
рамках
пуассоновой
статистики
фотоотсчетов.
Сумма
квадратов
отклонений
полученных
данных
от
модели,
,,:2,
по
всем
точ
кам
(z,
j)
имеет
вид
(455)
где
N -
число
точек
в
направлении
осей
Х
и
у.
Здесь
С;.З
-
значения,
получаемые
из
модели
в
точке
(Xi,
Yi),
lja;'J -
весовой
фактор,
указывающий
на
то,
что
точки.
обладающие
большей
точностью,
являются
для
нас
более
важными.
Набор
пара
метров,
минимизирующий
х
2
,
обозначим
[XO.min,
УО,щiп,
I'miп,
A
lllill
,
B
lllill
].
Очевидно;
что
неопределенность
по
каждому
пара
метру
зависит
от
характера
поведения
\-
4 5
Точность
позиционирования
115
в
окрестности
точки
минимума
Хщiп.
Хорошей
аппроксимацией
при
небольших
от
К.lОнениях
пара
метра
от
минимума х
2
является
парабола.
В
зависимости
от
того,
мал
И.1И
велик
фактор
расхождений
ветвей
параболы,
статистическая
ошибка,
связанная
с
соответствующим
пара
метром
,
является
малой
или
большой.
Для
того
чтобы
найти
этот
фактор
и,
таким
образом,
оценить
ошибки,
разложим
х
2
в
ряд
Тейлора
вблизи
.)
минимума
\~llill:
\'
N
\2
~
L L + [(C,.J.111ill -
D,.з)
+
(д;'-1)
.
(Хо
- XO.min) +
,=1
1=1
(1/,
О
ХО
mш
(
иа
..
з
)
( )
(OGt.
j
)
( )
+
--а-
УО
- YO.min +
-д-
'У
- 'Ymill +
УО
Уо
l1Iill
'у
I'miJl
(
да,.з)
(А
А
)
(OGi'
l
)
(В
В
)] 2
+
дА
. -
min
+
дв
. -
tnin
А
ШItI
B
n1ln
(4.56)
Вариация
второго
порядка
Д
от
х
2
вблизи
минимума
может
быть
записана
в
виде
2 2
~~
1
[(OGt'I)2
2
~
= \ -
\111111
~
~ ~
---:! 7JX .
(ХО
- XO.min) +
,=1
1=1 (1; J
О
т,о.Щlll
(
iJG,
J
)2
2 (OGi.1)2 2
-')-
(УО
-
Уо.щill)
+
~
('У
- 'Ytnin) +
(
уо
/}о.Шlll
v r
'УШ;rI
(
UG
•.
J
)2
2
(дац)2
2
+
иА
.
(А
- A
mill
)
+
дв
.
(В
-
Дllill)
+
А
Н1I11
В.
ШIl
+
перекрестные
слагаемые].
(4.57)
Можно
показать,
что
пере
крестные
слагаемые
исчезают
[14].
Некоторые
част
ные
производные
исчезают
по
причине
того,
что
х
2
имеет
минимум
в
точке
~.I·O
111111'
!JO.lllill' 'Ylllill'
А
шiн
,
B
1I1iH
].
Другими
перекрестными
слагаемыми
можно
прене
бречь.
потому
что
они
являются
произведениями
симметричных
или
асимметричных
функций
Это
позволяет
записать
конечный
результат
для
Д
вблизи
минимума
в
виде
.\'
S [
.)
\ _
'" '"
1
(оп/.,)-
(
)2
....l -
~
~
-т;г,:-
.
ХО
-
ХО.щill
+
1=1
,~I
(1;.,
.
о
'о.НШI
(
щ;,.,)2
2
(да
..
1
)2
2
~
.
(УО
- YO.tnill) +
-а-
(...,
-
'УШill)
+
уо
1/0.111111
'у 'УШ;rI
(
iJG/
J
)2
(А
А
)2
(да
..
1
)2
(В
В
)2]
+
')А
. - mill +
дВ
. - mill •
(
А
lllщ
В
шш
(4.58)
Это
выражение
показывает,
как
растет
х
2
при
вариации
пара
метров
вокруг
оптимального
значения
Поверхности
постоянной
Д
в
пространстве
параметров
представляют
собой
.эллипсы
•.
В
соответствии
с
(4.58)
наибольший
вклад
в
х
2
вносят
отрезки
кривой
С,
имеющие
наибольший
наклон.
В
случае,
характеризую
щем
положение
(;1:0,110),
в
этом
можно
легко
удостовериться,
смещая
гауссову
кривую
относительно
точки
наилучшего
значения
(XO.
m
ill'
УО.Пlill),
как
показано
на
рис.
4.13.
116
Гл
4.
Пространственное
разрешение
и
качество позиционирования
Рис
4
13
Две
гауссовы
кривые,
сдвинутые
на
небольшую
величину
Очевидно.
что
основнои
вклад
в
разницу
между
кривыми
(эта
величина
закрашена
серым
цветом)
вносит
отрезок.
имеющий
самый
большой
наклон.
Это
отражено
в
(458)
4.5.2.
Оценка
ошибки
подгоночных
параметров.
По
мере
роста
.1.
статисти
ческая
достоверность
набора
параметров
снижается.
Можно
установить
соответствие
между
величиной
.1.
и
статистической
достоверностью,
связанной
с
подгоночными
параметрами
[22,
23].
Если
установлена
величина
.1.
для
заданного
в
процессе
под
гонки
доверительного
уровня,
можно,
используя
(4.58),
найти
ошибки
подгоночных
параметров.
т
а
б
л
и
ц
а
4.1
Значение
величин
.1.
а
,
полученных
из
(460).
для
набора.
состоящего
из
семи
параметров
v
1 2 3 4 5 6 7
.1.
а
1 2,3 3,5
4,7
5.9
7,05
8,2
Нормированное
распределение
функции
плотности
вероятности
для
.1.
в
случае
набора
из
v
подгоночных
параметров
задается
в
виде
(см.,
например,
[22].
Приложе
ние
В-4)
(4.59)
Если
мы
проинтегрируем
Р(.1.
2
,
У)
от
.1.
а
до
бесконечности,
то
получим
значение
интеграла,
равное
0,317:
х
I
Р(.1.,
v)d.1.
= 0,317,
(460)
.:l.
и
тогда
вероятность
1 - 0,317 = 0,683
является
вероятностью
того.
что
параметры
лежат
внутри
области
параметров,
для
которой
величина
.1.
не
превосходит
~"
и
которая
соответствует
доверительному
уровню
10-.
Величина
.1."
растет
с
ЧИСЛО~I
свободных
пара
метров
У,
однако
обычно
существует
корреляция
между
различными
параметрами.
В
табл.
4.1
показаны
относительные
величины
.1."
для
различных
набо
ров
параметров,
число
которых
изменяется
вплоть
до
семи,
а
доверительный
уровень
соответствует
68,3
%.
Другие
значения
могут
быть
подсчитаны
с
помощью
(459)
и
(4.60).
Например,
для
того
чтобы
оценить
ошибку
координаты
3:0,
предположим,
что
все
параметры,
кроме
этого.
имеют
оптимальные
значения
В
таком
случае
в
(458)
все
4 5
Точность
позиционирования
117
c,laгae~lЫe,
кроме
одного,
содержащего
хо,
исчезают.
И
тогда
мы
получаем
[
(
N N
2)]-~
= .'
_..
. _
1/2
_1_
дС,.з
а,
-
('/'0
.I·0.
11111l
)
-
~a
LL
2
(дх)
.
i=1
j=1
a
•.
j
о
J:о.Шlll
(4.61)
Сумма
по
I
и
.i
может
быть либо
подсчитана
численно
с
помощью
результатов
подгонки,
либо
аппроксимирована
интегралом,
и
тогда
можно
получить
аналитиче
ское
выражение
для
а,.
Последний
подход
имеет
то
преимущество,
что
позволяет
обсуждать
зависимости
ошибок
координат
от
различных
экспериментальных
пара
~leTpOB
Для
получения
аналитического
выражения
воспользуемся
соотношением
(
"
..
)
(Ц2
)
• V
JV
о)
2
I I
iЮ,
} -
'"
1
б
б
1 aC
i
.
j
--:>
-,
-.--
'"
2
х
У
2
--
,
.\
-
~,~,
a~
} (
и:l'о
)
J·о.шill
L J J
а(х,
у)
(дхо)
xo.mill
,-
J-
L/2
(4.62)
Г.1е
L =
.У6.1·
=
N6.IJ
представляет
собой
длину
квадратной
области,
в
которой
проис
ходит
процесс
подгонки,
6;1:
и
8у
-
длины
отдельных
ячеек,
на
которые
она
разби
та
'),
а
.у
-
число
ячеек.
Для
вычисления
интеграла
в
правой
части
(4.62)
необходи
~Ю
сделать
ряд
предположений
относительно
статистических
свойств
нашей
инфор
~Iации,
т.
е.
относительно
а
2
(:г,
у).
Пусть
шумы
фона
и
сигнала
представляют
собой
некоррелированные
пуассоновы
(или
гауссовы)
шумы.
Тогда
а
2
(х,
у)
=
a~
+
a~,
где,
в
соответствии
с
(4.54),
at
=
В,
а
a~
=
Аехр[(
-(х
-
хо)2
+
(у
-
уо)2)/2')'2].
Под
стаВJ1ЯЯ
эти
выражения
в
(4.62),
получить
аналитический
результат
представляется
затруднительным.
Таким
образом,
необходимо
прибегнуть
к
дальнейшим
приближени
Я~I
(1)
предположим,
что
в
области
пика
гауссовой
кривой
сигнал
превышает
уровень
фона
на
величину
Х"у.
ЭТО
означает,
что
только
пуассонов
шум
сигнала
аА,
как
мы
предполагаем,
вносит
вклад
на
этом
отрезке.
(2)
Мы
предполагаем,
что
в
области
вне
отрезка
Х')
доминирует
фон
и,
таким
образом,
только
пуассонов
шум
ав
вносит
ВК.lад
Пара
метр
Х
позволяет
подстраивать
точку
перехода
в
зависимости
от
относи
те.1ЬНЫХ
величин
сигнала
и
фона,
имеющих
место
в
конкретном
эксперименте.
Теперь
СУШlа
в
(4.62)
может
быть
аппроксимирована
интегралом
следующим
образом:
+
N-
б б
1
дС,.
з
+
.,-JX'Y
J
2
L
2
Х
У
ав(х,
у)2
(
дхо
)
~o.min
-1./2
L/2
2 J J 2
+
!!..-
б б
1
дС
'.]
L
2
Х
У
ав(х,
у)2
(
дхо
) J:o.min '
(4.63)
Х'У
где
последние
два
слагаемых
дают
одинаковые
результаты
благодаря
симметрии
задачи
При
помощи
такого
приближенного
описания
с
использованием
(4.61)
можно
')
Это предположение
не
является
обязательным,
но
упрощает
рассмотрение.
-
Прu.ие'l
авт
118
Гл.
4
Просmрансmвенное
разрешение
и
качество
позиционирования
записать
отнормированную
ошибку
координаты
х:
8:г
(464)
[С(Х)А
+
~
F(t,
х)]
--
[
А"
]
"У
\
с(х)А
+
В'F(t.
х)
Здесь
мы
ввели
безразмерный
пара
метр
t = L/(2"Y),
описывающий
ширину
об
ласти,
в
которой
происходит
подгонка
в
единицах
ширины
пика.
Функция
F(t,
.%'),
а
также
константа
с(х)
задаются
выражениями
F(t,x)
=
V;
[Erf(x)
-
Erf(t)]
[.;;
[Erf(x)
- Erf(t)] +
t(,-t
2
-
У.('-х1
с(><)
=
2Erf
(;.)
[~Erf
(;.)
-
><J2~C-"']'
(465)
где
z
Erf(z)
=
~
J
e-
u2
du
(466)
о
-
так
называемая
функция
ошибок.
Из
наших
определений
следует,
что
О
~
.%'
~
t
Теперь
у
нас
есть
все
необходимое,
для
того
чтобы
получить
определенные
значение
ошибки
в
точке
максимума
ах/"У
для
данной
экспериментальной
ситуации
(см
зада
чу
4.6).
Очевидно,
что
сходный
подход
может
быть
применен
для
вычисления
ошибок
по
другим
параметрам,
таким
как
ширина
пятна
(см.
задачу
4.7).
Для
иллюстрации
зависимости
нормированной
ошибки
от
величины
ar./"Y
для
различных
пара
метров
мы
построили
графики
зависимости
аг.
от
количества
ячеек,
амплитуды
сигнала,
уровня
фона
для
пятна
размером
250
нм
(ширина
на
полувысоте),
получаемого
с
помощью
масляного
иммерсионного
объектива
с
высокой
числовой
апертурой
На
рис.
4.14,
а-в
мы
видим,
что
может
быть
достигнута
точность
позиционирования
вплоть до
нескольких нанометров
за
счет
увеличения
числа
ячеек,
увеличения
сиг
нала
и
понижения
фоновых
шумов.
С
другой
стороны,
увеличение
размера
области,
в
которой
происходит
аппроксимация,
для
t
~
2,5
уменьшает
точность линейно,
что
соответствует
моменту,
когда
кривая
F(t, 1,6)
насыщается
(см.
рис.
4.14,
г),
если
при
этом
число
ячеек
N
не
увеличивается.
На
ошибку
также
влияет
число
независи~IЫХ
параметров.
Оценочно
можно
сказать,
что
увеличение
числа
параметров
на
единиц)
понижает
точность
всех
пара
метров
примерно
на
10%.
И,
наконец,
сравним
полученные
нами
прогнозы
с
результатами,
имеющимися
в
литературе
и
связанными
сотслеживанием
перемещения
отдельных
флуоресцент
ных
молекул.
Первый
эксперимент
связан
с
отслеживанием
молекул
липидов,
флу
оресцентно
маркированных
и
находящихся
в
липидной
двухслойной
мембране
[181
Смысл
этого
эксперимента
в
том,
чтобы
отследить
быструю
диффузию
молеку.,
липидов.
В
эксперименте
используется
микроскоп
с
числовой
апертурой
1,3
в
со
четании
с
чувствительной
ССD-камерой,
способной
записывать
последовательности
изображения
со
скоростью
140
изображений/с.
Краткость
результирующего
време
ни
усреднения
и
определяет
ошибку
позиционирования
молекул.
На
рис
4
15,
Q
показана
серия
фотоизображений,
со
временем
экспозиции
5
мкс,
С
интерваЛО~1
в
35
мкс
на
площадке
липидного
бислоя
размером
5,4
х
5,4
мкм,
на
которой
нахо
дятся
маркированные
молекулы
липидов.
На
фотографии
им
отвечают
отчетливые
пики.
Используя
пара
метры
эксперимента,
приведенные
в
[181,
А
=
60,
n =
6,
t =
5,
6 = 5,9,
х
= 1,6,
и
"У
= 240
нм,
получим:
а,
=
ау
=
43,
что
находится
в
согласии
./5
Точность
позиционирования
119
1I
б
i'\()
~
(Ю
~
:r:
~
--:ю
h
to
Ь
:Ю
()()
!j
10
15
20
00
200
400
600
800
1000
Число
точек
N
Амплитуда
А
[фотоотсчеты]
н
(()
г
4
'"
i'\
I
О
3
~
~
(j
ф
2
-
~
~1
2
r:r..
()
()
!j
1()
15
20
2
2.5
3
:3.5
4
Фон
В
[фотоотсчеты]
Рис
4
14
Зависимость
(т,
от
различных
значимых
пара
метров
для
f =
125
нм,
а
также
зависи~IОСТЬ
P(t.
%)
от
I
а
-
график
зависимости
(Т,Т
от
числа
ячеек
N
Остальные
параметры'
А.
=
500.
JJ
=
10,
I =
5,
д"
=
5,9,
и
=
1,6,
б
-
график
зависимости
G'x
от
амплитуды
сигна"lа
..1
Остальные
параметры
В
=
10,
t =
5,
д"
=
5,9,
N =
10,
и
=
1,6;
в
-
график
зависи~IОСТИ
(т,
от
уровня
фона
В
Остальные
параметры:
А
=
500,
t =
5,
да
= 5,9, N =
10,
% =
1,6,
г
-
график
зависимости
F(t,
К)
от
t
для
у.
=
1,6
со
значениями
стандартных
вложенных
отклонений.
Такая
точность
в
семь
раз
ниже
дифракционного
предела
экспериментальной
установки.
Броуновское
движение
отдельных
липидов
в
липидной
двуслойной
мембране
может
быть
исследовано
путем
анализа
более
чем
500
траекторий,
схожих
с
теми,
которые
показаны
на
рис.
4.15,
б.
На
врезке
представлена
результирующая
линейная
зависимость
средних
квадратов
С~lещений
от
промежутков
времени.
Если
время
наблюдения
больше
(~0,5)
с
за
счет
высокого
разрешения
преды
дущего
эксперимента
и
при
условии,
что
маркер
является
устойчивым
к
светово
~y
воздействию,
возможно
значительное
увеличение
точности
позиционирования
ВП.l0ТЬ
до
нескольких
нанометров.
Условия,
которые
должны
выполняться,
чтобы
осуществить
такой
режим
измерения,
можно
сформулировать
исходя
из
анализа
рис
4.16.
а,
б.
Число
ячеек
N,
необходимое
для
отображения
и
аппроксимации
гауссова
пика,
должно
быть
большим,
например
около
16
при
t
~
5.
Кроме
того,
довольно
большой
должна
быть
амплитуда
фотоотсчетов,
например
около
1000,
в
то
вре~IЯ
как
фон
должен
удерживаться
малым,
около
100.
Все
эти
условия
выполнены
в
работе
[17].
Образцы
полученных
изображений
приведены
на
рис.
4.16,
а.
Чет
кость
графика
говорит
о
высоком
качестве
полученной
за
время
измерения
(0,5
с)
информации.
Используя
введенные
выше
параметры,
(4.64)
и
х
= 1,6,
получим
точность
позиционирования
менее
3
нм.
В
работе
[17]
исследовалась
длина
шага
~IOJlекулярного
двигателя
мышечного
глобулина
V.
Для
этой
цели
белок
был
марки
рован
и
проводилось
наблюдение
за
каждой
маркирующей
молекулой
во
времени
при
каждом
шаге
молекулярного
двигателя.
Отдельные
шаги
вплоть до
~
25
нм
длиной
отчетливо
различимы,
как
показано
на
рис.
4.16,
б,
[17].
Характер
отслеживания
120
Гл
4
Пространственное
разрешение
и
качество позиционирования
а
б
l.!i 2.0
2
-)
I
.-)
-)
11
•
,е:
'11
U
21ОМ
'
2()-'~Vl'()
-I~
*
::!
О
мс
с
1
2.5
и
~-
~
- )
•
1I
"
2~M'
:;:
1)
1110
1Ш
11111
:.:
~)
::о
.!.(
1
()
35
мс
10М'"
1"
О
280м,
1.5
I
-)
l.!i
2.0
2!)
I
-)
-)
()
мкм
Рис
4
15
Отслеживание
процесса
быстрой
диффузии
с
субволновой
точностью
а
--
Набор
снимков
со
временем
экспозиции
5
мс,
выполненных
с
интервалом
в
35
МС,
на
которых
Bf1.1Hbl
два
флуоресцентных
пика
индивидуально
маркированных
липидов,
находящихся
в
.~ИПИ.1НО~1
бислое
Размер
изображения
5,4
х
5,4
мкм
2
.
б
-
Траектории
обеих
молеКУJl
получены
11O.1rOH-
кой
пиков
на
рис
(а)
(Врезка)
Средний
квадрат
смещения
каждой
молекулы.
усре:щеННЫII
по
многим
траекториям.
Заимствовано
из
[18]
на
рис.
4.16,
б
прекрасно
демонстрирует
тот
факт,
что
точность
позиционирования
находится
именно
в
том
диапазоне,
оценка
которого
приведена
выше.
Кроме
приложений,
связанных
с
вопросом
отслеживания
движения
отдельных
молекул,
высокая
точность
позиционирования
может
быть
необходима
для
ответа
на
вопрос
такого
характера:
являются
ли
связанными
между
собой
две
молекулы,
кото
рые
различимы
в
определенных
наблюдаемых
переменных.
Этот
вопрос
чрезвычайно
а
б
!JUO
8ОО
! 700
"
!1j
оОО
~
§ 500
с
~.100
1~~
~
300
30
~
~I)
~
200
60
-<.
;0
~
НО
:'1·'11111
1:! ·.11111
!j211ШII
2()
;11111
нн
~JШII
!)()
О
~--+--.....,...--.....,...---т----т-----j
О
10
20
:10
Время
(с)
111
;0
Ы)
Рис
4.1
б
Нанометровая
точность
позиционирования
при
маркировании
красителе~1
а
-
трехмерное
изображение
единичного
Су3-красителя,
записанное
за
время
0,5
с
ОПlеТИ~1
высокий
уровень
сигнала,
до
3000
фотоотсчетов,
и
низкий
уровень
фона
Различная
величина
амплитуд
пиков
обусловлена
неравномерной
засветкой,
б
-
Смещение
маркеров,
закреПJ,енных
на
молекулярном
двигателе
мышечного
глобулина
V,
от
времени
Хорошо
виден
ступенчатый
характер
движения
Заимствовано
из
[17]
4
б
Принциnы
микроскопии
ближнего
поля
121
ва",ен.
например
при
выделении
из
связанного
образца
отдельных
молекул
или
их
неБО.1ЬШОГО
количества
[191.
Мы
показали. что
возможно
получение
нанометровой
точности
в
основанных
на
"етодах
оптической
визуализации
измерениях,
связанных
с
позиционированием.
Точность
зависит
от
уровня
шума
и
может
достигать
нескольких
нанометров
даже
при
детектировании
отдельных
флуоресцентных
молекул.
Необходимо
вновь
под
черкнуть.
что
этот
способ
получения
точных
данных
следует
отличать
от
методов
ПО.lучения
высокого
разрешения,
хотя
он
и
может
быть
использован
для
простран
ственного
различения
двух
отдельных
излучателей.
Последний
основан
на
получении
некоторой
априорной
информации
об
исследуемой
молекуле,
т.
е.
если
излученные
фотоны
~IOГYT
быть
связаны
с
тем
или
иным
объектом
на
основании
разницы
в
значениях
какой-либо
наблюдаемой
величины,
характеризующей
их,
например
энергии
фотона.
Таким
образом,
этот этот
тип
«увеличения
разрешения.>
попадает
в
категорию
«литростей.>,
обсуждавшихся
в
разд.
4.2.
4.6.
Принципы
микроскопии
ближнего
поля
До
настоящего
времени
мы
предполагали,
что
пространственные
частоты
(k
r
,
k
y
),
связанные
с
эванесцентными
волнами.
теряются
в
процессе
распространения
от
источника
к
детектору.
Потеря
этих
пространственных
частот
ведет
к
возникновению
дифракционного
предела
и,
следовательно,
к
другому
критерию.
накладываемому
на
пространственное
разрешение,
т.
е.
к
способности
различить
два
разделенных
между
собой
точечных
объекта.
Центральной
идеей
оптической
микроскопии
ближнего
поля
ЯВ.lяется
сохранение
пространственных
частот,
связанных
с
эванесцентными
полями,
и
увеличение
за
счет
этого
ширины
пространственного
спектра.
В
принципе
произ
ВО.lыюе
разрешение
могло
быть
получено,
если
ширина
пространственного
спектра
бы.lа
бесконечной.
Однако
получена
она
может
быть
только
за
счет
сильной
связи
\lежду
источником
света
и
образцом,
что
недостижимо
в
стандартной
микроскопии,
где
свойства
источника
света
(например,
лазера)
оказывают
пренебрежимо
малое
В.lияние
в
смысле
взаимодействия
свет-вещество.
В
этом
разделе
мы
не
будем
заНИ~lаться
механизмами
установления
подобной
связи,
а
просто
распространим
идеи
конфокальной
микроскопии
на
оптическое
ближнее
поле.
Оптический
микроскоп
ближнего
поля
по
сути
является
обобщением
конфокаль
нои
установки,
показанной
на
рис.
4.8,
где
один
и
тот
же
объектив
использовался
и
Д.1Я
возбуждающего
поля,
и
для
фокусировки
отклика.
Если
мы
используем
две
lИНЗЫ.
то
получим
ситуацию,
показанную
на
рис.
4.17,
а.
В
целом
для
оптического
разрешения
нам
необходимо
пространственное
удержание
светового
потока,
идущего
через
плоскость
объекта
Это
удержание,
или
пространственная
локализация,
может
jJассыатриваться
как
произведение
локализации
поля
возбуждения
и
поля
детекти
рования.
что
следует
из
(4.49).
Для
получения
сильно
локализованных
световых
потоков
необходимо
включать
широкий
спектр
пространственных
частот
(k
x
,
k
y
),
что
требует
использования
линз
с
высокой
числовой
апертурой.
Однако
в
оптике
даль
него
поля
мы
имеем
жесткую
границу
отсечки
пространственного
спектра:
только
свободно
распространяющиеся
плосковолновые
компоненты
с
волновыми
векторами
k < k
(1.-
=
1,2iГ
/
л,
/.:11
=
/.:"
=
Jk~
+
k~)
попадают
в
спектр.
д,lЯ
увеличения
спектра
пространственных
частот
нам
необходимо
включить
в
раСС~lOтрение
эванесцентные
волны
с
волновым
числом
kll
~
k.
К
сожалению,
они
не
~IOГYT
свободно
распространятся
и,
следовательно,
не
могут
быть
направлены
к
образцу
посредством
стандартных
оптических
элементов.
Эванесцентные
волны
привязаны
к
поверхности
вещества
или материальных
структур.
Это
означает,
что
122
Гл.
4.
Пространственное
разрешение
и
качество
позиционирования
а
Образец
I
Детектор
Возбуждающий
пучок
Плоскость
объекта
ПлоскосТl,
изображения
б
Образец
I
Возбуждающий
пучок
/
Металлический
экран
с
отверстием
Плоскость
объекта
Плоскость
и·юбражеНIIЯ
Рис.
4
17
Оптическая
микроскопия
ближнего
поля
представлена
как
обобщение
конфока.1Ь
ной
микроскопии:
а
-
в
обычном
микроскопе
(дальнего
поля)
бегущие
компоненты
ПО.1Я
фокусируются
на
плоскость
объекта
в
образце
Ширина
пространственного
спектра
частот
ограничена:
k
ll
<
k,
где
k =
n21Г/Л,
что
устанавливает
предел
достижимого
разрешения.
б
-
в
оптическом
микроскопе
ближнего
поля
фокусирующая
линза
заменяется
объеhТО~1
(отверстием),
который
расширяет
спектр
пространственных
частот
за
пределы
k
Таl\
как
компоненты
поля
вне
этого
предела
не
распространяются
свободно,
этот
объект
должен
быть
расположен
в
непосредственной
близости
от
ооразца
для
расширения
пространственного
спектра
частот
нам
необходимо
создать
«устрой
ства
передачи
эванесцентных
волн.,
расположенные
в
непосредственной
близости
от образца.
Таким
устройством
могут
стать
освещаемая
металлическая
головка
И.1И
очень
маленькое
отверстие
в
металлическом
экране,
как
показано
на
рис
4 17,
б
Цена,
которую
мы
должны
заплатить
за
включение
эванесцентных
волн,
весьма
велика!
Устройство,
располагаемое
непосредственно
рядом
с
образцом,
становится
частью
всей
системы,
и
взаимодействие
между
ним
и
образцом
может
очень
си.1ЬНО
усложнить
решение
задачи.
Кроме
того,
расширенный
пространственный
спектр
доступен
только
в
непосредственной
близости
от образца;
а
т.
к.
мы
не
можем
внести
устройство
внутрь
образца, то
нам
доступна
только
его
поверхность.
За
плоскостью
источника
локализованные
поля
очень
быстро
расходятся
дей
ствительно,
из
самых
общих
рассуждений
следует:
чем
больше
локализовано
ПО.lе
в
поперечном
направлении,
тем
быстрее
оно
расходится.
Это
явление
-
следствие
дифракции
и
может
быть
легко
объяснено
в
терминах
углового
спектрального
пре.1-
ставлен
ия.
Рассмотрим
локализованное
поле
в
плоскости
: =
О
(плоскости
источ
ника).
Предположим,
что
х-компонента
этого
поля
имеет
гауссово
распределение
по
амплитуде
в
соответствии
с
(З.8).
В
разд.
З.2.1
мы
получили,
что
фурье-образ
поля
Е
х
также
представляет
собой
функцию
Гаусса,
т.
е
з.
2
+у2
Ех(х,
у,
О)
=
Еое
-
WБ
(467)