Новотный Л., Хехт Б. Основы нанооптики
Подождите немного. Документ загружается.
Глава
5
НАНОРА3МЕРНАЯ
ОПТИЧЕСКАЯ
МИКРОСКОПИЯ
Обсудив
распространение
и
фокусировку
оптических
полей,
перейдем
теперь
к
обзору
наиболее
важных
экспериментальных
и
технических
устройств,
используе
\lbIX
в
оптической
микроскопии
высокого
разрешения.
Мы
вновь
обратимся
к
уже
обсуждавшимся
в
предыдущих
главах
вопросам,
чтобы
посмотреть
на
них
с
точки
зрения
открывающихся
в
них
экспериментальных
возможностей.
Мы
будем
обсуж
дать
технику
как
ближнего,
так
и
дальнего
поля.
Микроскопия
в
дальнем
поле,
особенно
конфокальная
оптическая
микроскопия,
является
предметом
нашего
об
суждения,
потому
что
фокальное
пятно
в
повседневных
экспериментах
достигает
величины
дифракционного
предела.
Многие
экспериментальные
идеи,
используемые
в
конфокальной
микроскопии,
были
естественным
образом
перенесены
в
оптическую
~IИКРОСКОПИЮ
ближнего
поля.
В
этом
методе
наноразмерный
оптический
зонд
пото
чечно
сканирует
поверхность
способом,
во
многом
схожим
с
тем,
который
использу
ется
в
атом
но-силовой
микроскопии
(АСМ)
и
сканирующей
туннельной
микроскопии
(СТМ).
Однако
в
сканирующей
оптической
микроскопии
ближнего
поля
существует
~Iножество
различных
экспериментальных
реализаций,
в
то
время
как
в
АСМ
и
СТМ
(в
той
или
иной
степени)
можно
говорить
о
существовании
только
одной
схемы.
Основное
отличие
между
АСМ/СТМ
и
оптической
микроскопией
ближнего
поля
заключается
в
том,
что
в
последней
необходимо
создать
в
образце
или
на
конце
зонда
оптическое
ближнее
поле
еще
до
того,
как
мы
можем
удостовериться
в
наличии
взаимодействия.
Схемы
отличаются
тем,
каким
образом
в
них
измеряется
ближнее
поле
Основные
из
них
приведены
в
табл.
5.l.
5.1.
Излучение
в
дальнем
поле
и
детектирование
5.1.1.
Конфокальная
микроскопия.
Конфокальная
микроскопия
основана
на
использовании
источника,
находящегося
в
дальнем
поле,
и
процесс
детектирования
также
происходит
в
дальнем
поле,
как
было
пока
за
но
ранее,
в
разд.
4.3.
Несмотря
на
ограниченность
по
ширине
спектра
пространственных
частот,
возникающую
из-за
того.
что
источник
и
детектор
находятся
в
дальнем
поле,
конфокальная
микроскопия
успешно
используется
для
высокоточных
измерений
положения
объекта,
как
мы
обсуждали
в
разд.
4.5,
а
также
для
его
визуализации
с
высоким
разрешением, для
чего
используются
нелинейные
эффекты
и
эффекты
насыщения
(см.
разд.4.2.3).
Пе
рейдем
теперь
к
рассмотрению
экспериментальных
аспектов
стандартных
установок
конфокальной
микроскопии.
Экспериментальная
установка
На
рис.
5.1
пока
за
на
простейшая
установка
сканирующего
конфокального
мик
роскопа.
Его
пучок
имеет
фиксированную
длину
пробега
и
при
этом
поточечно
сканирует
образец,
осуществляя
его
запись.
Обычно
свет
в
таких
приборах
проходит
пространственную
фильтрацию,
например
путем
пропускания
его
через
одномодовое
оптическое
волокно
или
точечное
отверстие.
Цель
пространственной
фильтрации
-
134
Гл
5
Наноразмерная
оптическая
микроскопия
т
а
б л
и
ц
а
5.1
Основные
возможные
установки
оптической
микроскопии
высокого
разреше
ния,
КJJассифицированные
по
принципу
«подсветка-детектор»
Подсветка
В
ближнем
поле
В
ближнем
поле
Детектор
В
ближнем
поле
В
дальнем
поле
~
1'1~\
('>
~
:s:
-
~:j
:.:
• ili'
IIQ
..
".
~
о
-
'i
:с
'"
Ра
Iрешенный
'"
!-
~
,
l'
....
в
дальнем
поле
В
дальнсм
поле
В
ближнем
поле
В
даЛЫlем
полс
,
.....
...
...
•
l'
...
добиться
получения
пучка
с
идеальным
гауссовым
профилем.
После
прохождения
через
волокно
или
отверстие
свет
собирается
при
помощи
линзы.
Фокальное
расстоя
ние
линзы
должно
выбираться
таким
образом,
чтобы
диаметр
пучка
был
достаточно
велик
для
перекрытия
выходной
апертуры
объектива
микроскопа,
собирающего
и
фокусирующего
свет
на
поверхность
образца.
Большим
преимуществом
является
воз
можность
использовать
объектив,
способный
работать
с
коллимироваными
пучка~IИ.
такие
объективы
называются
«аккомодированными
на
бесконечность».
Получаемый
на
образце
размер
пятна
!:::.Х
зависит
от
числовой
апертуры
объектива
N
А,
а
также
от
длины
волны
источника
(см.
разд.
4.2).
Она
определяется,
как
правило,
дифрак
ционным
пределом
света
на
входном
отверстии
объектива,
л
!:::.x=0,61
NA
,
(51)
где
..\
-
длина
волны
света.
Для
N
А
=
1.4
поперечный
размер
пятна
для
зеленого
света
(..\
= 500
нм)
равен
200
нм,
т.
е.
ненамного
превосходит
..\/2.
Лазерный
свет
взаимодействует
с
образцом,
в
результате
чего
возникает
отра
женный
и
рассеянный
свет
на
длине
волны
возбуждения,
а
также
на
сдвинутых
относительно
возбужденного
перехода
длинах
волн.
Тот
же
объектив
микроскопа.
который
используется
для
подсветки,
может
использоваться
для
собирания
света.
исходящего
от
образца
Можно
использовать
и
второй
объектив,
расположенный
рядом
с
первым,
но
это
требует
больших
экспериментальных
усилий,
nOCKOJJbKY
в
таком
случае
необходима
юстировка
объективов
относительно
друг
друга
с
точ
ностью
больше
чем
..\/2.
С
другой
стороны,
схема
на
двух
объективах
открывает
новые
возможности
для
возбуждения,
например
путем
перекрытия
фокусов
двух
распространяющихся
навстречу
пучков
[1].
Мы
вернемся
к
этим
вопросам
ниже
Если
входящий
пучок
коллимирован,
то
при
использовании
одного
объектива
пучок
собираемого
света
также
коллимирован,
когда
объектив
микроскопа
скоррек-
5 I
Излучение
в
дальнем
поле
и
детектирование
135
.l·yz-сканер
rn
. .
L\
.J
~
,
F
~
L2
~
,
t
SPAD
I
Рис
5 \
ЭксперимеllтаЛЫlая
установка
конфокального
оптического
микроскопа
с
подсвет
кой
в
беЛОJl,I
CBeTe
l
)
Лазерный
источник
света
пространственно
фильтруется,
например
путем
пропускания
через
одномодовое
оптическое
волокно
или
точечное
отверстие
После
выхода
из
волокна/отверстия
свет
собирается
при
ПОМОLЦи
линзы
L{ихроическая
светоделительная
П.lастина
направляет
свет
на
объектив
микроскопа,
обладаюLЦИЙ
высокой
числовой
апертурой.
д,lЯ
достижения
оптимального
размера пятна
выходная
апертура
объектива
должна
полностью
перекрываться
пучком
(см
гл
4)
Оптический
сигнал
(например,
флуоресцентный),
а
также
возникаюLЦИЙ
в
фокусе
рассеянный
свет
собираются
этим
же
объективом,
формируя
колли
~Iированный
пучок
L{ихроическая
светоделительная
пластина
преобразует
свет,
переводя
его
в
ограниченный
спектральный
диапазон,
затем
он
eLЦe
раз
фильтруется
и
в
конечном
итоге
фOl\~сируется
на
eLЦe
одно точечное
отверстие
на
передней
панели
детектора
Изображение
формируется
пиксел
за
пикселом
путем
сканирования
образца
в
фокальной
области
тирован
по
хроматическим
аберрациям.
Работа
с
коллимированным
пучком
позволяет
вносить
фильтры
и
другие
оптические
элементы
в
любом
месте
оптического
пути
пучка
без
искажения
светового
пути.
Собираемый
свет
должен
быть
отделен
от
входящего.
Этого
можно
достичь
разными
способами:
используя
разницы
длин
волн
между
ними,
при
помощи
ди
хроического
зеркала;
используя
разницу
поляризаций,
при
помощи
поляризационной
светоделительной
пластины;
используя
временное
селектирование,
если
речь идет
об
импульсном
излучении,
или
просто
пространственное
разделение
при
помощи
обыкновенной
(неполяризационной)
светоделительной
пластины.
На
рис.
5 1
пока
зан
случай,
когда
используется
дихроическое
зеркало,
пропускающее,
например,
ф.lуоресценцию,
смещенную
в
сторону
красной
границы.
Фильтрованный
пучок
собираемого
света
фокусируется
при
помощи
второй
линзы
на
точечное
отверстие,
находящееся
непосредственно
перед
детектором.
Некоторые
конкретные
детекторы,
как,
например,
лавинные
фотодиоды,
работающие
в
режиме
счета
фотонов,
имеют
сравнительно
небольшое
рабочее
отверстие.
Такие
детекторы
могут
использоваться
без
До/lО.~нительного
отверстия.
Размер
входного
отверстия
должен
быть
очень
точно
соотнесен
с
диаметром
фокального
пятна
(диска
Эйри),
создаваемого
второй
.1ИНЗОЙ,
дЛЯ
того
чтобы
эффективно
устранять
сигнал,
идущий
извне
фокусного
пространства
Увеличение
этого
отверстия
ослабляет
фильтрацию
такого
сигнала,
но,
с
другой
стороны,
может
помочь
в
оптимизации
эффективного
прохождения
света
через
отверстие.
Было
показано,
что
когда
размер
пятна
в
два
раза
меньше
диаметра
))
в
ориг
ернllummаtюn
-
Примеч
пер
136
Гл.
5.
Наноразмерная
оптическая
микроскопия
отверстия, это
дает
хорошие
результаты
и
по
отсечению
засветки,
и
по
попереЧНО~IУ
разрешению
Другим
способом
формирования
оптического
пути
к
детектору
может
быть
c,le-
дующий
Соотносить
поперечный
размер
пятна,
позволяющего
с
хорошей
аппрокси
мацией
эффективно
и
равномерно
собирать
свет,
с
размером
уменьшенного
изобра
жения
входной
апертуры
детектора,
получаемого
в
фокальной
плоскости
объектива
микроскопа.
Используя
геометрическую
оптику,
можно
показать,
что
коэффициент
уменьшения
задается
отношением
двух
фокусных
расстояний:
линзы
объектива
и
линзы,
фокусирующей
свет
на
отверстие
(линзы
тубуса).
Этот
способ
неоБХОДИ~I.
когда
речь
идет
о
микроскопе
ближнего
поля
со
сканирующей
головкой,
и
Ha~1
необходимо
убедиться
в
том,
что
вся
область
сканирования
лежит
в
пределах.
доступных
детектированию.
Здесь
мы
хотели
бы
отметить,
что
профиль
пучка
на
выходе
из
одномодового
оптического
волновода
представляет
собой
основную
гауссову
моду.
Как
показано
выше,
в
разд.
3.7,
можно
создать
и
другие
моды,
причем
некоторые
из
них
ведут
к
возникновению
в
полях
в
фокальной
плоскости
характерных
свойств,
таких
как
уменьшенный
размер
пятна
и
продольная
поляризация.
Если
необходимо
создать
вы
сокие
моды,
в
оптический
путь
возбуждающего
пучка
до
светоделительной
пластины.
чтобы
не
вносить
искажений
в
детектируемый
пучок,
вносится
блок
преобразоватеJ1Я
мод
(см.
разд.
3.7).
Конфокальный
nринциn
Конфокальное
детектирование
основано
на
том,
что
свет,
исходящий
не из
фо
кальной
области,
не
сможет
пройти
через
отверстие детектора
и,
следовательно,
не
будет
продетектирован.
Сдвинутые
в
поперечном
направлении
пучки
будут
отсеяны
апертурой
детектора,
а
пучки,
исходящие
из
точек,
сдвинутых
вдоль
оптической
оси,
не
попадут
в
фокус
в
плоскости
детектора
и,
следовательно,
будут
сильно
ослабляться
входным
отверстием
детектора.
Это
явление
было
теоретически
описано
в
разд.
4.2.2
и
качественно
проиллюстрировано
на
рис.
5.2.
Визуализирующие
ха
рактеристики
конфокального
микроскопа
лучше
всего
обсуждать
в
терминах
полной
функции
рассеяния
точки,
введенной
в
разд.
4.3.
Функцию
рассеяния точки
можно
представлять
себе
как
объем,
вне
которого
вероятность
возбуждения
и
детекти
рования
фотона
превосходит
определенный
заданный
порог.
Ранее
мы
говорили
о
том,
что
в
конфокальной
микроскопии
функция
рассеяния
точки
представляет
собой
эллипсоид,
вытянутый
вдоль
оптической
оси,
центр
которого
совпадает
с
геометри
ческим
фокусом
линзы
объектива.
для
объектива
с
числовой
апертурой
N.4 =
1.4.
к
примеру,
его
ширина
равна
220
нм,
а
длина
750
нм.
Поперечное
разрешение
кон
фокального
микроскопа
несущественно
возрастает
по
сравнению
с
микроскопом
с
ши
рокой
подсветкой
благодаря
тому
факту,
что
нули
поля
в
полной
функции
рассеяния
точки
остаются
неизменными.
Возведение
в
квадрат
изображения
в
приближении
Эйри
(диаграмма
Эйри)
только
сокращает
полную
ширину
на
полувысоте
в
1,3
раза
Однако
боковые
лепестки
при
этом
существенно
подавляются,
что
ведет
к
значи
тельному
возрастанию
динамического
диапазона
изображений,
и
это
означает.
что
слабые
сигналы
могут
быть
зарегистрированы
даже
в
непосредственной
близости
с
сильными.
Более
детальное
обсуждение
этих вопросов
см.,
например,
в
[21.
Запись
изображений
в
конфокальной
микроскопии
может
быть
произведена
мно
жеством
различных
способов
с
помощью
поточечного
сканирования
или
образца.
или
возбуждающего
пучка.
5 J
Излучение
в
дальнем
поле
и
детектирование
!
Оптическая
ось
!
Сопряженная
----------~~~г_-------плоскость
измерения
--·1
i
,1
'!
i I
'!
,1
11
11
'!
i!
!
11
Н
D
,:
..
~~~
I----H----------~"
-::.
-
~
---.--.---
...
L-.L·-·------······--f
.....
r:::t:
l
__________
.______________________
/"
137
Рис
52
Конфокальный
принцип
Показан
оптический
путь
детектирования
Отображены
три
объекта
из
образца
Только
объект,
находящийся
на
оптической
оси
(круг),
лежащий
в
пространстве
объекта
в
плоскости,
сопряженной
плоскости
детектирования,
проецируется
на
отверстие
и
может
быть
детектирован
Другие
объекты
(треугольник
и
квадрат)
либо
фок~сируются
сбоку
от
отверстия
(треугольник),
либо
попадают
на
отверстие
не
в
фокусе,
так
что
сигнал
от
них
подавляется
rF
в
:.
®~=
.-
,
Рис
5 3
Формирование
функции
рассеяния
точки'
а
-
Стандартная
конфокальная
микроско
пия
в
геометрии
на
отражение!).
б
-
конфокальная
тета-конфигурация;
в
-
конфокальная
47Г-тета-конфигурация
Заимствовано
из
[3]
1)
В
оригинале
.epi-iIIumiпаtiоп.,
от греч
..
с7ГL
-
над,
изредка
в
русском
используют
термин
.эпиподсветка.
-
Примеч.
пер
138
Гл
5
Наноразмерная
оптическая
микроскопия
в
каждой
точке
измеряется
либо
количество
фотонов
за
время
измерения,
либо
выходное
напряжение
на
фотоумножителе.
Яркость
(или
цвет)
пиксела
определяется
величиной
измерения
на
детекторе.
Информация
со
всех
пикселов
может
зате~1
быть
представлена
в
форме
цифрового
изображения.
В
частности,
благодаря
ко
нечности
ширины
конфокальной
функции
рассеяния
точки,
возможно
осуществлять
оптическое
рассечение
толстого
образца.
В
этом
случае
для
образца
получают
его
трехмерные
реконструкции.
Более
подробное
описание
инструментария
и
техники
реконструкции
можно
найти
в
работах
[2,
3].
Пространственное
разрешение
кон
фокальной
микроскопии
может
быть
ОПТИ~IИ
зировано
путем
«формирования
функции
рассеяния
точки».
Лежащая
в
основе
этого
подхода
идея
заключается
в
том,
что
полная
функция
рассеяния
точки
является
произведением
функций
рассеяния
точки
для
процессов
подсветки
и
детектирования
Если
их
модифицировать,
например,
при
помощи
нелинейных
оптических
взаимо
действий
сместить
или
наклонить
относительно
друг
друга,
то
их
пространственная
ширина
и/или
перекрытие
уменьшатся.
Это
может
привести
к
тому,
что
эффективная
функция
рассеяния
точки
будет
иметь
меньший
объем.
Кроме
того,
можно
исполь
зовать
интерференционные
эффекты
для
двух
волн,
распространяющихся
навстречу
друг
другу.
Эти
принципы
формируют
основу
техник
конфокальной
микроскопии,
известных
как
471'-,
тета-
и
471'-тета-конфокальная
микроскопия
[4-6].
Относительное
расположение
функций
рассеяния
точки
для
процессов
детектирования
и
подсвеТI\И
в
этих
методах
пока
за
но
на
рис.
5.3.
Нелинейное
возбуждение
и
насыщение
Возможность
перехода
квантовой
системы
в
новое
состояние
путем
одновре
менного
поглощения
двух
и
более
фотонов
была
впервые
исследована
Марией
Гопперт-Майер
(Maгia
G6eppeгt-Mayeг)
в
1929
г.
[7].
Экспериментально
это
явление
оказалось
возможным
наблюдать
только
в
1961
г.
[8]
после
изобретения
лазера,
обеспечившего
необходимую
высокую
плотность
фотонов.
В
настоящее
время,
когда
стали
доступны
фемтосекундные
лазеры,
двухфотонное
и
вообще
многофотонное
возбуждение
стало
стандартным
инструментом
в
конфокальной
микроскопии
высо
кого
разрешения
[9].
Хромофоры,
обладающие
переходами
в
синей
и
зеленой
части
спектра,
могут
быть
возбуждены
инфракрасным
светом.
В
то
же
время
многофо
тонная
микроскопия
позволяет
усовершенствовать
и
упростить
возможности
опти
ческой
диагностики
слоев,
т.
к.
возбуждение
происходит
только
в
области
высокои
интенсивности
поля,
т.
е.
в
жестком
фокусе,
что
делает
эту
методику
незамеНИ~IЫМ
инструментом
при
изучении
трехмерной
морфологии
объектов,
причем
не
только
в
биологии.
На
рис.
5.4
представлены
основы
двухфотонного
возбуждения.
Два
низкоэнерге
тических
фотона
одновременно
поглощаются
и
возбуждают
молекулу,
переводя
ее
из
основного
состояния
на
колебательный
уровень
первого
возбужденного
электронного
состояния.
Таким
же
образом,
как
при
однофотонном
возбуждении,
возбужденная
молекула
релаксирует
на
нижний
колебательный
уровень
первого
возбужденного
со
стояния
и
затем,
спустя
несколько
наносекунд,
переходит
в
основное
состояние
либо
безызлучательно,
либо
с
испусканием
фотона.
Если
при
однофотонном
возбуждении
при
низких
интенсивностях
скорость
флуоресценции
линейно
зависит
от
интенсив
ности
возбуждения
(см.
гл.
9),
то
для
двухфотонного
возбуждения
-
квадратично
При
этом
малость
сечения
процесс
а
двухфотонного
возбуждения,
составляющая
(/
5 I
Излучение
в
дальнем
поле
и
детектирование
б
Интенсивность
возбуждения
в
139
г
Рис
5 4
двухфотонное
возбуждение
флуоресцентной
молекулы
а
-
схема
энергетических
уровней
флюорофор,
имеющий
однофотонное
поглощение
в
синем
диапазоне,
возбуждается
одновременным
поглощением
двух фотонов
из
ближнего
ИК-диапазона.
Испускание
молекулы
происходит
в
зеленом
диапазоне,
б
-
скорость
флуоресценции
возрастает
как
квадрат
интен
сивности
возбуждающего
поля.
Это
при
водит
К
тому,
что
если
для
однофотонного
возбуждения
вся
ф.lуоресцентная
среда,
находящаяся
на
оптическом
пути
пучка,
дает
свечение
(в),
то
в
слу
чае
двухфотонного
возбуждения
(г)
заметная
флуоресценция
происходит
только
в
области
~lаКСИ~IРIOВ
напряженности
поля,
например
в
фокусе
лазерного
пучка
(показано
стрелкой)
Рисунки
(в)
и
(г)
заимствованы
из
[10]
10.50
см
4
/
с
1),
требует
использования
импульсного
лазера
с
длительностью
100
фс
и
высокой
частотой
следования
импульсов.
Импульсы
должны
быть
достаточно
короткими,
для
того
чтобы
ограничить
общую
дозу
излучения,
попадающую
на
образец,
но
при
этом
такими,
чтобы
плотности
фотонов
хватило
для
поддержания
процесса
двухфотонного
возбуждения,
сечение
которого
невелико.
Частота
следо
вания
импульсов
должна
быть
высокой,
т.
к.
за
один
импульс
возникает
максимум
один
флуоресцентный
фотон
от
одной
молекулы.
Для
двухфотонного
возбуждения
ф.lуоресценции
в
широкоrrспользуемых
красителях,
как
правило,
используется
лазер
на
титан-сапфире
(Ti
: Sapph),
генерирующий
импульсы
с
длительностью
100
фс,
с
рабочей
длиной
волны
850
нм
и
частотой
следования
импульсов
80
МГц.
Другим
методом
управления
фокусом
является
так
называемая
техника
истоще
ния
накачки
(ТИН
(STED
2»),
уже
обсуждавшаяся
в
разд.
4.2.3.
Основной
принцип
STED
заключается
в
использовании
вынужденного
излучения
для
селективного
уменьшения
населенности
возбужденного
состояния
соответствующего
флуоресцент
ного
красителя
на
определенных
участках
фокальной
области,
оставляющего
прочие
участки
без
изменения.
В
принципе,
это
требует
субволнового
управления
про
странственным
распределением
поля,
индуцирующего
вынужденное
излучение.
Та
кой
контроль
действительно
возможен,
если
использовать
упомянутое
насыщающее
в
зависимости
от
напряженности
истощающего
поля
поведение
степени
истощения
накачки.
Насыщение
позволяет
достигать
предельно
резких
границ
между
областями
с
истощением
накачки
и
без
него.
В
частности,
если
эта
область
находится
в
фокусе,
где
интенсивность
истощающего
поля
равна
нулю,
вокруг
нее
формируется
неболь
шой
объем
неистощенной
флуоресценции
(см.
разд.4.2.3).
Принцип
SТЕD-микроскопии
отражен
на
рис.
5.5.
Установка
включает
в
се
бя
два
импульсных
лазера.
Один
используется
для
индуцирован
ия
однофотонного
')
таl\же
обозначаемая
1
GM
(Goeppert-Mayer)
2)
В
оригинале
stlmulated emission depletion -
вынужденное
истощение
накачки
-
Прu.ие
l
/
пер
140
Гл
5.
Наноразм,ерная
оптическая
м,икроскоnия
возбуждения
в
молекуле
красителя,
находящейся
в
фокальном
объеме.
А
второй.
более
мощный
лазер,
сдвинут
по
частоте
генерации
в
сторону
красной
границы.
с
тем
чтобы
осуществлять
вынужденное
испускание
из
возбужденного
состояния
в
основное.
1)
Время
задержки
между
импульсами
выбрано
таким
образом,
чтобы
успела
завершиться
колебательная
релаксация
в
первое
возбужденное
электронное
состояние,
на
что
уходит
несколько
фемтосекунд.
Таким
образом,
можно
утверждать.
что
возбужденный
электрон
находится
в
состоянии
с
относительно
большим
време
нем
жизни
и
вынужденное
испускание
может
стать
более
эффективным.
Это
важно.
т.
к.
вероятность
вынужденного
излучения
растет
со
временем.
В
этом
заключается
причина
того,
что
импульс
STED
должен
быть существенно
более
длительным.
чем
импульс
возбуждения,
как
показано
на
рис.
5.5,
а.
Длина
волны
импульса
испускания
должна
выбираться
таким
образом,
чтобы
она
не
могла
возбуждать
процесс
флуоресценции.
Этого
добиваются,
устанавливая
достаточно
большой
сдвиг
в
сторону
красной
границы.
Большой
сдвиг
имеет
еще
и то
преимущество.
что
позволяет
возникнуть
спектральному
окну
между
длиной
волны
возбуждения
и
испускания,
в
котором
может
быть
записан
сигнал
флуоресценции.
Для
увеличения
отношения
сигнала
к
шуму
может
использоваться
временное
селектирование
флу
оресценции.
Лучший
мировой
результат
в
оптической
микроскопии
дальнего
ПО.1Я
(33
нм)
в
настоящее
время
достигнут
с
использованием
комбинации
методов
4/0-
конфокальной
микроскопии
и
STED [12].
а
Лавинный
О
фотодиод
Полуволновая
плаСlина
Рис
5.5
Принцип
конфокальной
микроскопии
с
использованием
истощения
накачки
(STED)
а
-
экспериментальная
установка
конфокальной
микроскопии
STED
Короткий
импульс
воз
буждения
и
длинный
импульс
испускания
соединяются
в
объективе
микроскопа
Импульс
испускания
формируется
таким
образом,
чтобы
в
геометрическом
фокусе
(6.
правая
картинка)
он
имел
нулевую
интенсивность.
а
импульс
возбуждения
имел
бы
обычный
фокус
(6.
левая
картинка),
в
-
флуоресценция
из
конфокального
объема
как
функция
интенсивности
пучка
испускания.
Отметим
сильно
нелинейное
поведение
Функция
рассеяния
точки
без
испускания
(г)
и
с
испусканием
(д).
Заимствовано
из
[11]
в
STED
фокусы
возбуждающего
и
истощающего
пучков
перекрываются.
но
распределение
поля
в
фокальной
области
SТЕD-пучка
формируется
таким
обраЗОl\I.
1)
Более
детально
молекулярная
флуоресценция
рассмотрена
в
гл
9 -
Примеч
авт
5 1
Излучение
в
дальнем
поле
и
детектирование
141
чтобы
его
интенсивность
в
геометрическом
фокусе
была
равной
нулю.
Это
позволяет
говорить
о
том,
что
SТЕD-пучок
снижает
населенность
возбужденных
уровней
везде,
кроме
небольшого
объема
с
центром
в
точке
нулевой
интенсивности.
Благодаря
эффекту
насыщения
эта
область
может
быть
по
размеру
меньше,
чем
дифракцион
но
ограниченное
пятно.
Таким
образом,
пространственная
протяженность
области
ф.lуоресценции
может
быть
существенно
сужена.
Этот
эффект
проиллюстрирован
на
рис.
5.5,
г
и
д
(см.
задачу
5.2).
Конфокальная
флуоресцентная
микроскопия,
такая
как
SТЕD-микроскопия
или
~IИКРОСКОПИЯ
многофотонного
возбуждения,
основана
на
наличии
в
образце,
напри
~Iep
в
живой
клетке,
флуоресцентных
меток.
Однако
не
всегда
возможно
прикреп
.1ЯТЬ
метки-красители
к
интересующему
нас
объекту.
Особенно,
когда
речь идет
о
~Iаленьких
молекулах,
которые
существенно
изменятся,
если
их
пометить.
Если
ие.1ЬЮ
использования
оптической
микроскопии
является
определение
химического
свойства,
то
наиболее
очевидным
способом
является
использование
процесса
энерге
тического
обмена
между
фотонами
и
молекулярными
колебаниями.
Так
как
энергия
~IO.lекулярных
колебаний
находится
в
дальнем
инфракрасном
диапазоне,
достичь
высокого
пространственного
разрешения
в
этом
случае
очень
трудно,
т.
к.
получение
.1ифракционно
ограниченных
пятен
технически
сложно
и
сами
они
довольно
велики.
Обойти
эти
трудности
можно,
используя
рамановскую
спектроскопию.
В
этом
процессе
фотоны,
взаимодействующие
с
образцом,
могут
либо
потерять,
.lибо
получить
квант
колебательной
энергии.
По
сути,
рамановское
рассеяние
яв
.lяется
аналогом
амплитудной
модуляции,
используемой
при
радиопередаче
инфор
\lации'
частота
несущей
(лазера)
смешивается
с
частотами
сигнала
(молекулярными
колебаниями)
В
результате
частоты
рамановски
рассеянного
света
соответствуют
суыме
и
разности
частот
лазера
и
колебаний.
Рамановский
спектр
рассеяния
содер
жит
информацию
о
специфичных
для
данной
молекулы
колебательных
переходах
и
поэтому
представляет
собой
весьма
индивидуальный
«слепок»
образца
для
изучения
его
химического
состава
(см.
рис.
5.6,
а-в).
Вероятность
того,
что
фотон,
взаимодей
ствующий
с
молекулой,
испытает
рамановское
рассеяние,
очень
невелика.
Обычно
сечение
рамановского
рассеяния
на
14
порядков
меньше,
чем
сечение
флуоресценции.
Эта
малость
сечения
рассеяния
затрудняет
его
использование
в
микроскопии,
требуя
большого
времени
для
каждого
измерения
и,
значит,
стабильных
и
статичных
образ
иов.
Однако
это
сечение
может
сильно
возрасти
вблизи
металлических
поверхностей
с
наноразмерным
рельефом
или
вблизи
металлических
наночастиц.
Такой
эффект,
названный
поверхностно
усиленным
рассеянием
света
(ПУРС),
ограничен
областью
в
непосредственной
близости
от
этой
поверхности,
как
мы
покажем
ниже
(см.
разд
12.4.3),
и
не
может
быть
использован
для визуализации
глубоких
подповерх
ностных
слоев.
Тем
не
менее
для
визуализации
вещества
в
объеме
сечение
раманов
ского
рассеяния
может
быть
увеличено
при
помощи
когерентной
(резонансной)
схемы
накачки.
Когерентная
накачка
усиливает
в
освещаемом
образце
молекулярные
коле
бания,
находящиеся
в
фазе
с
ним,
что
приводит
К
конструктивной
интерференции
в
определенных
направлениях.
Так
называемый
процесс
когерентного
антистоксового
рассеяния
света
(КАРС)
[13,
141
представляет
собой
процесс
четырех
волнового
Сl\lешения,
для
которого
используются
два
перестраиваемых
(импульсных)
лазера.
Разность
частот
генерации
этих
лазеров
может
быть
настроена
таким
образом,
что
она будет
совпадать
с
энергией
молекулярных
колебательных
переходов.
Это,
в
свою
очередь,
ведет
к
увеличению
эффективности
сигнала
рамановского
рассеяния.
Энер
гетическая
диаграмма
процесса
КАРС
и
условий
фазового
синхронизма
показаны
на
рис
5.6,
г и
д
соответственно.
Благодаря
тому
что
сигнал
КАРС
пропорционален
квадрату
интенсивности
пучка
накачки
W
p
и
интенсивности
стоксова
сигнала
W
S
,
значитеJlЬНЫЙ
сигнал
может
быть
получен
только
в
области
высокой
интенсивности
142
Гл
5
Наноразмерная
оптическая
микроскопия
а 6
81--
s,V
±Е
Стоксов
Рэлеевское
сдвиг
рассеяние
г
д
81
W.
wl'
-----------г-
:
....
:
..
1
•••
----,-
wl'
w
p
':,W
ш
;
~~w~
•
....I.._-+-,~.'''''
jW'
8o,-I..-K-A-P-C--z"'-11
=
О
в
-
--1--
v=l
,
----±...-ll
=
О
Антистоксово
иmyченис
Рис
5.6
Энергетическая
схема
спонтанного
комбинационного
рассеяния
и
когерентного
анти
стоксова
рассеяния
света
(КАре).
Рассеяние
света
на
молекуле
может
приводить
к
возник
новению
(а)
стоксовых
(сдвинутых
по
частоте)
фотонов.
(6)
рэлеевскому
рассеянию,
(8)
ан
тистоксову
излучению
г
-
КАре
представляет
собой
процесс
четырехволнового
смешения.
осуществляемый
при
помощи
двух
перенастриваемых
импульсных
лазеров
с
частотаыи
",-'/,
и
UJ
s
Если
разница
частот
лазеров
приближается
к
энергии
колебательного
перехода,
сигна.l
КАре
UJ
as
усиливается
и
излучается
преимущественно
в
направлении
фазового
синхрониз
ма
(д)
е
-
Изображение
клеток
фибропласта,
при
стимулировании
которых
производятся
липиды
Капельки
липидов
могут
быть
визуализированы
с
помощью
КАре
при
настройке
на
алифатические
С-Н
колебания.
Изображение
размером
1()()
х
100
мкм
2
было
сделано
за
2.i
с
Любезно
предоставлено
Кс
е
Ксай
(Х.
S
Xie),
Гарвардский
университет
накачки.
Таким
образом,
возможности
оптической
визуализации
слоев
в
KAPC-r.IИК
роскопии
аналогичны
двухфотонной
микроскопии.
Однако
в
сочетании
с
методами
управления
функцией
рассеяния
точки,
как
это
делается
в
4?Г-
и
тета-микроскопии.
в
будущем
даст
возможность
улучшить
пространственное
разрешение
Твердотельные
иммерсионные
линзы
в
соответствии
с
(5.1)
более
высокая
числовая
апертура
линзы
способствует
лучшему
пространственному
разрешению.
Твердотельные
иммерсионные
линзы
были
предложены
для
оптимизации
числовой
апертуры
линз,
которые
могут
использовать
ся
в
микроскопе.
Твердотельные
иммерсионные
линзы
(ТИЛ)
могут
рассматриваться
как
вариант
масляных
иммерсионных
объективов
микроскопов.
Для
нужд
оптиче
ской
микроскопии
они
были
предложены
в
1990
г.
[15],
а в
1994
г.
применены
для
оптической
записи
информации
[16].
Как
показано
на
рис.
5.7,
ТИЛ
позволяют
получить
дифракционно-ограниченное
сфокусированное
световое
пятно
на
границе
раздела
ТИЛ-образец.
Размер
получающегося
в
результате
пятна
уменьшается
как
л/n,
где
n
может
достигать
величины
3,4,
если
используемые
ТИЛ
изготовлены
из