Новиков Д.К. (и др.). Медицинская микробиология

Подождите немного. Документ загружается.

251

Так как заболевание связано с действием токсина, то основным

экспресс-методом диагностики является выявление токсина, парал-

лельно ведутся традиционные методы исследования.

Проводят выявление токсина в фильтрате исследуемого материа-

ла (пленки, ткани трупа) или материала после 4-5-часового подращи-

вания бактерий в сывороточном бульоне. С этой целью можно ста-

вить реакцию коагглютинации со стафилококковым антительным

противодифтерийным диагностикумом.

С этой же целью можно ставить РПГА, ИФА и ПЦР и ДНК-

зонды для обнаружения гена tox в бактериальной хромосоме. Исполь-

зуют также заражение куриных эмбрионов, наблюдают их гибель при

наличии токсина. При заражении культур клеток Vero дифтерийный

токсин дает ЦПД (цитопатическое действие). В реакции нейтрализа-

ции идентифицируют вид токсина.

Бактериоскопический метод. В мазке из слизи зева и фибриноз-

ного налета при окраске по Нейссеру выявляют типичную морфоло-

гию возбудителя и явление метахромазии. Можно окрашивать препа-

рат корифосфином и изучать препарат в люминесцентном микроскопе

(оранжево-красное свечение).

В остром периоде заболевания за счет антагонистических

свойств возбудителя коринебактерии видны прямо в мазке при мик-

роскопии практически в чистой культуре.

Бактериологический метод – засевают материал на сывороточ-

ный агар и другие селективные среды (Клауберга, Тинсдаля и кровя-

ной агар, т.к. некоторые штаммы дифтерийного возбудителя не растут

при наличии теллура). Идентифицируют возбудителя по культураль-

ным, морфологическим, биохимическим свойствам и токсигенности,

которую определяют методом иммунопреципитации. Для этого на

чашку с сывороточным агаром накладывают фильтровальную бумагу,

смоченную антитоксической противодифтерийной сывороткой, а во-

круг на расстоянии 1,5 см сеют выделенные и идентифицированные

дифтерийные культуры. Если культура выделяет экзотоксин, то он

диффундирует в среду, и на месте встречи с антителами видны линии

преципитации.

При идентификации культуры в бактериологическом методе

необходима дифференциация возбудителя дифтерии от других кори-

небактерий, которые могут вызывать дифтериеподобные заболевания

или просто находиться в слизи зева.

С.ulcerans – бактерии палочковидной формы, располагаются

беспорядочно, имеют одно зерно волютина на конце; глюкозу и крах-

мал разлагают до кислоты, сахарозу не разлагают, выделяют уреазу,

желатиназу, иногда цистиназу, не восстанавливают нитраты в нитри-

ты, непостоянно могут выделять экзотоксин.

252

C.xerosis располагаются параллельными рядами, не имеют зерен

волютина, разлагают глюкозу и сахарозу, мальтозу, восстанавливают

нитраты, не разлагают крахмал и мочевину.

C.pseudodiphtericum – представитель нормальной микрофлоры.

Может располагаться параллельными рядами или беспорядочно с од-

ним зерном волютина. Не разлагает углеводы, восстанавливает нитра-

ты в нитриты, разлагает мочевину, не имеет цистиназы, не выделяет

экзотоксин.

Для установления источника инфекции необходимо проверить

эпидмаркеры: фаговары (их 9), бактериоциновары (5), серовары (их

57, чаще встречается 11), биовары (4), антибиотикограмму.

Серологический метод используют при стертых формах для ре-

троспективной диагностики или для выявления неиммунной прослой-

ки населения. С этой целью ставят РПГА, ИФА и реакцию нейтрали-

зации токсина в культуре клеток Vero.

Профилактика. Неспецифическая: проводят изоляцию и лечение

больных, санацию носителей антибиотиками, дезинфекцию в очаге.

Специфическая профилактика – с трех месяцев после рождения

детям вводят вакцину АКДС 3 раза с интервалом в 45 дней. Ревакци-

нация через 1,5-2 года, вводят АКДС, или АДС-М, или АД (адсорби-

рованный дифтерийный анатоксин) по схеме. При низком титре анти-

тел (менее 1:40 в РПГА или 0,03 мE/мл в реакции флоккуляции) по

эпидемическим показаниям проводят ревакцинацию. К группам риска

для вакцинации в РБ относят не только детей, но и взрослое населе-

ние с низким уровнем (менее 1:40) антитоксических антител.

Лечение. Антитоксическая противодифтерийная сыворотка

применяется в ранние сроки. Ее вводят по методу Безредки (дробно,

постепенно увеличивают дозу). Параллельно используют антибиоти-

ки, глюкозу, витамины, антигистаминные препараты.

14.3. Патогенные микобактерии

Туберкулез (от латинского слова tuberculum – бугорок) – хрони-

ческое инфекционное заболевание. Локализация процесса зависит от

пути передачи, входных ворот и степени генерализации. Чаще встре-

чается туберкулез легких, реже мочеполовой системы, костей, лимфо-

узлов. В распространении заболевания решающее значение имеют

социально-бытовые условия жизни. Возбудитель открыт в 1882 г.

Р. Кохом.

Туберкулез известен с глубокой древности. Туберкулезные по-

ражения обнаружены при исследовании останков человека периода

неолита (около 5000 лет до нашей эры), египетских мумий (около

2700 лет до нашей эры), мумии молодого жреца в Фивах (около 1000

253

лет до нашей эры). Такое древнее происхождение болезни связано с

широким распространением микобактерий в природе среди различ-

ных животных и возможностью постоянной встречи человека с этими

микроорганизмами.

Легочная форма тубекркулеза была описана еще Гипократом,

Галленом, Авиценой. В древнем Китае, Индии описаны классические

симптомы заболевания легких людей, которые страдали чахоткой.

В 70-80 г.г. XX века были достигнуты значительные успехи в

борьбе с туберкулезом. Этому способствовали регулярное обследова-

ние населения флюорографическим методом и методом туберкулино-

диагностики, обязательная вакцинация БЦЖ новорожденных, прове-

дение химиопрофилактики людям с повышенным риском заболева-

ния, применение сильных противотуберкулезных препаратов.

С 1991 г. отмечается рост заболеваемости туберкулезом и появ-

лением большого числа полирезистентных микобактерий. В Респуб-

лике Беларусь в 1996 г. заболеваемость составила 48,8; 1998 г. – 54,9;

199 г. – 53,6 на 100 тыс. населения. Очень напряженной является эпи-

добстановка в тюрьмах, где заболеваемость заключенных выше в 28

раз.

Таксономия. Семейство Mycobacteriaceae, род Mycobacterium.

По роли в патологии все представители рода микобактерий под-

разделяются на 4 группы:

I. Возбудители туберкулеза у человека:

M. tuberculosis (M.hominis) вызывает туберкулез у 85-90 % боль-

ных;

M. bovis (бычий тип) – у 10-15% больных;

M. africanum – у 3% больных туберкулезом.

II. Возбудители микобактериозов – более 60 видов, которые вы-

делены из организма людей, теплокровных и холоднокровных живот-

ных, страдающих заболеваниями легких, кожи, мягких тканей, лим-

фатических узлов. Наиболее часто встречающиеся возбудители мико-

бактериозов – атипичные кислоустойчивые бактерии M.kansasii,

M.microti, M.ulcerans и др.

III. Кислотоустойчивые сапрофиты, типичным представителем

которых является M. Smegmatis, M. fortuifum и др.

IV. Возбудитель проказы – М. leprae.

Свойства возбудителей туберкулеза. Морфологические. Выра-

жен полиморфизм, встречаются палочковидные, ветвящиеся, ните-

видные, фильтрующиеся L-формы. Спор, жгутиков, капсул не имеют,

но есть оболочка, напоминающая микрокапсулу. Кислото-, щелоче- и

спиртоустойчивы, реже встречаются кислотоподатливые формы. Это

связано с высоким содержанием липидов, фосфатидов и восков в кле-

точных стенках (до 60%), поэтому бактерии плохо воспринимают

254

анилиновые красители и обычные способы окраски. Окрашиваются

по Циль-Нильсену в красный цвет, грамположительны.

Культуральные свойства. Требовательны к питательным средам и

условиям культивирования. Строгие аэробы, растут медленно от 2 до

8 недель только при температуре 37

С. Лучшими средами являются

яичные: среда Левенштейна-Иенсена (МПА, картофельный сок, яйца,

молоко, глицерин, аспарагин, малахитовая зелень для угнетения роста

другой флоры); среда Финна (состав тот же, но вместо аспарагина –

сложный солевой раствор). Для глубинного посева применяют цит-

ратную кровь. Вирулентны в R-форме. На жидких средах дают рост в

виде морщинистой пленки. На плотных средах образуют сухие, кре-

мовые, бородавчатые колонии. Характер роста связан с выраженной

гидрофобностью за счет большого количества липидов в клеточной

стенке.

Антигенные свойства микобактерий обеспечиваются белковыми

(туберкулин), полисахаридными и липидными компонентами. Они

являются группоспецифическими для M. tuberculosis, M.bovis и М.

leprae.

Устойчивость в окружающей среде. В высушенной мокроте со-

храняются несколько недель, в воде – больше года, в почве – до 6 ме-

сяцев. Дезинфицирующие растворы разрушают микобактерий в более

высокой концентрации и медленнее, чем других микроорганизмов;

возбудители туберкулеза гибнут при температуре 100

С и под влия-

нием солнечного света.

Факторы патогенности.

Липидный корд-фактор – гликолипид, является фактором адге-

зии, разрушает митохондрии клеток инфицированного организма,

нарушает у них функцию дыхания, тормозит миграцию полиморфно-

ядерных лейкоцитов. При культивировании вызывает склеивание ви-

рулентных особей в виде кос, тяжей.

Туберкулин (туберкулопротеины) обладает аллергизирующим

действием, вызывает развитие ПЧЗТ.

Гликолипиды наружного слоя клеточной стенки (микозиды) и

маннозные рецепторы микобактерий способствуют незавершенному

фагоцитозу.

Туберкулостеариновая, фтионовая, миколевая и другие жирные

кислоты оказывают токсическое действие на ткани.

Сидерофоры микобактерий конкурируют с фагоцитами за железо

– синтезируют железосодержащие ферменты и колонизируют альвео-

лярные макрофаги.

Характеристика заболевания

Источник инфекции – больные люди и больные животные (круп-

ный рогатый скот), выделяющие микобактерии.

255

Пути передачи – чаще воздушно-капельный, реже контактный и

алиментарный (молоко коров). Заражению способствует постоянный

контакт, проживание с больным туберкулезом.

Патогенез туберкулеза. Ингалированные бактерии фагоцитиру-

ются альвеолярными легочными макрофагами и транспортируются в

регионарные лимфоузлы. Фагоцитоз носит незавершенный характер.

Гликолипиды-микозиды усиливают токсическое действие корд-

фактора, поражая мембраны митохондрий, и ингибируя фагосомо-

лизосомальное слияние. Корд-фактор тормозит активность поли-

морфноядерных фагоцитов.

У входных ворот легких в ацинусах развивается первичный аф-

фект, идущие от него лимфатические сосуды и регионарные лимфо-

узлы воспаляются, формируется первичный комплекс. В ацинусе воз-

никает гранулема в виде бугорка. Этому способствует накопление в

очаге молочной кислоты, низкое значение рН, высокая концентрация

углекислого газа. В гранулеме накапливается большое количество

лимфоидных, плазматических клеток и фибробластов. В центре гра-

нулемы возникают участки творожистого некроза. Здесь располага-

ются возбудители, вокруг них эпителиоидные и гигантские клетки.

При формировании иммунитета размножение возбудителя замедляет-

ся, а потом прекращается, развивается ПЧЗТ. Очаг воспаления зати-

хает, подвергается кальцификации и фиброзу, формируются кальци-

наты (очаги Гона). Клинические проявления отсутствуют.

При ослаблении иммунитета снижается чувствительность мак-

рофагов к гамма-интерферону, ослабевает HLA-зависимое представ-

ление антигенов, тормозится пролиферация Т-лимфоцитов, активиру-

ется система комплемента по альтернативному пути, развивается ге-

нерализация инфекционного процесса.

Высокая сенсибилизация организма приводит к токсико-

аллергическим реакциям. Клинически этот период сопровождается

кашлем, кровохарканьем, снижением массы тела, потливостью, суб-

фебрилитетом.

У лиц с иммунодефицитом наблюдается диссиминированный

(милиарный) туберкулез – гранулемы развиваются в различных орга-

нах.

Клинические формы туберкулеза:

- очаговый: поражает отдельные органы (чаще в легких, костной

системе);

- генерализованные формы: милиарный туберкулез, туберкулез-

ный менингит, туберкулез мочеполовой системы, кишечника и др. ор-

ганов.

Иммунитет носит нестерильный клеточный характер. Имеют

значение Т-лимфоциты, выделяющие медиаторы, усиливающие фаго-

256

цитоз, иммунологическая память. Антитела не ингибируют возбуди-

теля. Развивается инфекционная аллергия ПЧЗТ.

Существует высокая естественная резистентность к возбудителю

туберкулеза.

Лабораторная диагностика

Материалом для исследования служат мокрота, моча, ликвор,

пунктат лимфоузла, биоптаты тканей.

Бактериоскопический метод. Окрашивают мазки по Циль-

Нильсену, выявляют мелкие красные палочки. При окраске флюорес-

центными красителями (аурамином, родамином) микобактерии дают

желто-белое свечение в люминесцентном микроскопе.

При малом количестве возбудителя используют методы обога-

щения.

Гомогенизация – материал обрабатывают щелочью, фибрин при

этом растворяется, а возбудитель высвобождается. Из осадка после

центрифугирования готовят мазки.

Флотация – гомогенизированную мокроту обрабатывают ксило-

лом или бензолом и тщательно встряхивают. Возбудитель всплывает

в силу гидрофобности вместе с пеной. Из нее готовят мазок и окра-

шивают по Цилю-Нильсену.

Бактериологический метод. Материал обрабатывают серной кис-

лотой и засевают на яичные среды.

Таблица

Дифференциация микобактерий

Свойства

M.tuberculosis

Атипичные ми-

кобактерии

Сапрофиты

Характеристика ко-

лоний

R-форма, сухие,

морщинистые,

бородавчатые,

«цветная капуста»

S-, R-формы, го-

могенные

S –форма, сочные

Пигментообразование

Цвета «слоновой

кости»

Желтые, оранже-

вые

Беспигментные,

желтые, оранже-

вые

Оптимальная темпе-

ратура роста

20-42

20-45

Скорость роста на

средах

Медленный

(2-6 недель)

Медленный

(3-4 недели)

Быстрый

(2-3 дня)

Ниациновый тест

Каталазная актив-

ность:

термостабильная ка-

талаза;

257

термолабильная ката-

лаза

Наличие корд-

фактора

Для идентификации M. tuberculosis проводят оценку свойств воз-

будителя:

характер роста – обнаруживают сухие, бородавчатые, кремовые

колонии (R-форма); длительность роста – 12-60 дней; выявляют нали-

чие корд-фактора (определяют по методу Прайса – на стекло наносят

исследуемый материал, обрабатывают серной кислотой для уничто-

жения кислоточувствительной флоры и погружают препараты в цит-

ратную кровь, через 3-4 дня препараты извлекают, окрашивают по

Циль-Нильсену, при микроскопии видны «косы» палочек, при отсут-

ствии корд-фактора возбудитель располагается аморфно); для мико-

бактерий туберкулеза характерен рост только при температуре 37-

С; они не растут на простых средах и средах с салицилатами; по-

ложительный ниациновый тест (среда с хлорамином В желтеет при

накоплении никотиновой кислоты); обладают термолабильной ката-

лазой; восстанавливают нитраты в нитриты; выделяют уреазу; к ми-

кобактериям туберкулеза чувствительны морские свинки.

Для внутривидовой дифференциации используют фаготипирова-

ние штаммов десятью микобактериофагами.

Для выявления АГ используют ИФА или РИФ, для генной диа-

гностики ставят ПЦР и выявляют генетические маркеры.

Mycobacterium bovis вирулентны в S-форме; колонии кремовые,

гладкие; ниациновый тест отрицательный; рост до 40 дней; каталаза

термолабильная; выделяют уреазу; не восстанавливают нитраты; рост

только при температуре 37-40

С.

Mycobacterum africanum – рост 31-40 дней; ниациновый тест по-

ложительный; вирулентны в S-форме; каталаза термолабильна; не

восстанавливают нитраты; выделяют уреазу. Остальные свойства как

у M.tuberculosis.

Микобактерии туберкулеза необходимо дифференцировать от

атипичных кислотоустойчивых бактерий, вызывающих микобактери-

озы.

Атипичные кислотоустойчивые бактерии имеют оранжевый пиг-

мент, вирулентны в S-форме, растут на средах с салицилатами, имеют

термостабильную каталазу, рост через 10-20 дней при температуре 22-

С, нет корд-фактора.

Кислотоустойчивые сапрофиты M.smegmatis, в отличие от

предыдущих возбудителей, растут на простых средах, длительность

258

роста 3-4 дня, имеют S-форму, оранжевый пигмент, нет признаков

болезнетворности, чувствительны к спирту.

Биопроба применяется при стертых формах. Морским свинкам

внутрикожно втирают исследуемый материал. Через 10-14 дней появ-

ляется долго не заживающая язва, и реакция Манту у них становится

положительной.

Метод аллергических проб – реакция Манту с туберкулином.

Внутрикожно вводят туберкулин PPD (PPD – очищенный белко-

вый дериват). Если организм инфицирован (иммунен), то через 24-48-

72 часа наблюдается инфильтрация и гиперемия, т.е. развивается

ПЧЗТ. У больных туберкулезом диаметр папулы на 6 мм (и более)

больше, чем у вакцинированных.

Генодиагностика – ПЦР.

Серологический метод: для выявления антител используют

РПГА, ИФА.

Профилактика. Неспецифическая профилактика: проводится

изоляция и лечение больных до полного прекращения выделения воз-

будителя. Дезинфекция в очаге 5% фенолом, 1:1000 раствором суле-

мы, хлорамином, хлорной известью.

Специфическая профилактика проводится живой аттенуиро-

ванной вакциной БЦЖ на 3-5 день после рождения с последующей ре-

вакцинацией при отрицательной реакции Манту.

Вакцина БЦЖ получена Кальметом и Гереном из M.bovis путем

многократных посевов на голодные среды, в результате был получен

авирулентный штамм, сохранивший высокую иммуногенность.

Лечение проводится антибиотиками и сульфамидными препара-

тами. Назначают препараты первого ряда – изониазид (тубазид), ри-

фампицин, пиразинамид, стрептомицин, этамбутол. Комбинация из

двух препаратов позволяет преодолеть химиорезистентность возбуди-

теля. Альтернативные средства – канамицин, ПАСК, этионамид, цик-

лосирин, капреомицин.

С декабря 1996 г. в Республике Беларусь внедрена в практику

усовершенствованная методика химиотерапии больных туберкулезом

легких в соответствии с рекомендациями ВОЗ по принципу контро-

лируемой краткосрочной, стантартизованной полихимиотерапии, ко-

торая получила межлдународное название как «стратегия DОТs». Эта

методика предполагает обязательное использование как правило 4

химиопрепаратов на 1 (начальном) этапе до 2-3 месяцев лечения, а

рпи полирезистентности МБТ – до 5-6 препаратов с использованием

основных как наиболее активных и эффективных противотуберкулез-

ных средств – изониазида (тубазид), рифампицина, пиразинамида,

стрептомицина или этамбутола. На втором этапе (до 2-6 месяцев)

продолжение химиотерапии изониазидом и рифампицином в опти-

259

мальных дозах. Проведение химиотерапии осуществляется с учетом

чувствительности микобактерий туберкулеза к препаратоам.

Микобактерии лепры (проказы).

Проказа – хроническое инфекционное антропонозное заболева-

ние, источником инфекции которого являются только больные люди.

Заболевание носит генерализованный характер и сопровождается по-

ражением кожи, слизистых оболочек, периферических нервов и внут-

ренних органов.

Возбудитель проказы был впервые описан в 1874 г. Ганзеном, а в

1879 г. А. Нейссер предложил способ окраски.

Свойства

Морфологические. Мелкие палочки, реже представляют собой

извитые формы, нет спор, капсул, жгутиков, грамположительны. По

Циль-Нильсену окрашиваются в красный цвет. Кислотоустойчивы.

Строгие внутриклеточные паразиты.

Антигены: О-АГ – соматический, термостабильный, общий с

возбудителем туберкулеза. В результате возникает перекрестный им-

мунитет, который носит клеточный характер, при заболевании снижа-

ется число и активность Т-лифоцитов, развивается вторичный имму-

нодефицит, антитела не выполняют защитной роли.

Культуральные свойства. Не растут на искусственных питатель-

ных средах. Могут развиваться в организме броненосцев, корейских

бурундуков, в коже лапок белых мышей.

Характеристика заболевания

Единственный источник инфекции – больной человек, который

может выделять возбудителя в окружающую среду при кашле, чиха-

нии. Инкубационный период 3-5 лет и более.

Основной путь передачи – воздушно-капельный, реже – контакт-

ный, трансплацентарный. Остается открытым вопрос о возможности

передачи возбудителя кровососущими насекомыми.

Входные ворота – слизистые оболочки и кожа.

Патогенез: возбудитель проникает в кровь, лимфу, нервную си-

стему, внутренние органы. Образуются гранулемы, состоящие из мак-

рофагов, содержащих много микобактерий, т.е. выражен незавершен-

ный фагоцитоз, формируется ПЧЗТ, развивается вторичный иммуно-

дефицит, лимфоциты не подвергаются бласттрансформации, подавля-

ется миграция макрофагов.

Заболевание может протекать в 3-х формах:

- лепроматозная форма – самая тяжелая, наиболее опасна для

окружающих. На лице, предплечьях, голенях образуются множе-

ственные инфильтраты (лепромы), в них очень много возбудителя. За-

тем лепромы распадаются, образуются язвы. Поражается кожа, слизи-

стые, лимфатические узлы, нервная система, внутренние органы. При

260

диффузной инфильтрации кожи лица формируется «львиное лицо» –

морщины и складки углубляются, нос утолщается, щеки, губы и под-

бородок приобретают дольчатый вид. На более поздних стадиях вы-

падают брови, ресницы, развиваются парезы и параличи;

- туберкулоидная – более легкая, менее заразная. Чаще поража-

ется только кожа, появляются симметрично расположенные папулы.

Они сопровождаются потерей чувствительности. Возбудителя в оча-

гах меньше;

- недифференцированная – при этом образуются асептические

инфильтраты на нижних конечностях, ягодицах. Сначала гипересте-

зия, затем развивается анестезия. Недифференцированная форма мо-

жет переходить в I или II форму.

Комитет экспертов ВОЗ по лепре в 1990 г. предложил рабочую

классификацию, по которой выделяют многобациллярную лепру (леп-

роматозную) и малобациллярную лепру (туберкулоидную и недиффе-

ренцированную).

Без лечения смерть наступает через 5-10 лет от кахексии, имму-

нодефицита и сопутствующих заболеваний.

Иммунитет. Естественный иммунитет является клеточно-

опосредованным. Характерен незавершенный фагоцитоз. При лепре

развивается вторичный клеточный иммунодефицит. Положительная

реакция на лепромин свидетельствует о благоприятном прогнозе.

Лабораторная диагностика

На первый план выступает клиническая диагностика с выявлени-

ем изменения чувствительности слизистых верхних дыхательных пу-

тей к температурным факторам (от гипостезии до анастезии), образо-

вание рубцовых тканей, язв.

Микроскопический метод: исследуют соскоб из гранулем, пунк-

тат из лимфоузлов. Готовят мазки, окрашивают по Циль-Нильсену,

выявляют клетки, наполненные возбудителем в виде «пачки сигар».

При лепроматозной форме в препарате много плазмоцитов, лимфоци-

тов, фибробластов. При туберкулоидной форме возбудителя мало, ос-

новную массу составляют эпителиальные клетки, вокруг которых

располагаются лимфоидные клетки.

Применяют РИФ с люминесцирующими сыворотками для выяв-

ления лепрозных антигенов.

Биопробу проводят на бурундуках и броненосцах. Можно вво-

дить материал в кожу лапки белой мыши, развивается инфильтрат, в

котором микроскопически выявляют скопления клеток в виде «пачки

сигар».

Аллергическая проба носит больше прогностическое, чем диа-

гностическое значение. Вводят внутрикожно лепромин (аллерген),

полученный длительным кипячением тканей лепроматозного узла.