Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник

Подождите немного. Документ загружается.

371

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

матеріалу. Однак у зв’язку з великою трудоємністю, цей метод у практичних лабо-

раторіях не використовується.

Реакцію імунофлуоресценції можна використати і при дослідженні біоптатів

печінки. При прямій імунофлуоресценції користуються міченим флуоресцеїнізо-

тіоцианатом IgG, виділеним із сироваток реконвалесцентів. Цінність методу по-

лягає в тому, що він дозволяє знайти окремі клітини, які містять антиген.

Радіоімунний та імуноферментний аналізи в твердій фазі. Ці методи

найрозповсюдженіші в діагностиці, мають однакову високу чутливість і спе-

цифічність. Вони мають один і той же принцип постановки з тією різницею, що

в РІА використовують специфічні імуноглобуліни (IgG), мічені

125

І, а в ІФА –

ферментом пероксидазою.

Наявність вірусів у фекаліях є 100 % підтвердженням діагнозу, однак від-

сутність їх за даними серологічних реакцій не виключає гепатит А.

У окремих випадках матеріалом від хворого можна заражати лабораторних

тварин. Найчастіше у високоспеціалізованих лабораторіях використовують мавп

шимпанзе, мармозет, павіанів та інших.

Пізніше в матеріалі від тварин виявляють віруси гепатиту А або його антиге-

ни вищеописаними способами.

Експрес-діагностика гепатиту А спрямована на безпосереднє визначення

вірусів у випорожненнях хворого. З цією метою використовують сучасні методи

імунної електронної мікроскопії, радіоімунний аналіз, реакцію ензиммічених ан-

титіл. Останній є достатньо чутливим і ефективним. Генетичний аналіз базується

на ПЛР.

Серологічне дослідження. Одним із способів доказу етіологічної належності

виділеного від хворих вірусу є виявлення в парних сироватках крові зростання

титру специфічних антитіл. При захворюванні антитіла з’являються рано, їх син-

тез починається ще в інкубаційному періоді, а титр різко зростає. У зв’язку з пізнім

поступленням хворих у стаціонар чотирикратне діагностичне збільшення титру

антитіл виявити практично неможливо. Тому цей метод діагностики не знайшов

широкого застосування.

Антитіла проти вірусу гепатиту А в інкубаційному періоді й на початку гос-

трої фази захворювання представлені класом IgM. Поступово знижуючись у титрі,

вони циркулюють протягом 6-8, а деколи й 12-18 місяців. Анти-ВГА IgM синтезу-

ються у всіх хворих, незалежно від форми інфекції. Знаходження їх – ранній тест

діагностики, який дозволяє не тільки підтвердити або заперечити клінічний діаг-

ноз, але й виявити стерті, безсимптомні форми хвороби, що має вирішальне зна-

чення в епідеміологічих дослідженнях. У подальшому їх заміщує IgG. Імуногло-

буліни класу М можна знаходити в крові протягом 3-6 місяців після перенесеного

захворювання, в той час як IgG – протягом усього життя. Антитіла виявляють за

допомогою РІА або ІФА.

Крім визначення анти-ВГА IgM, для діагностики в гострому періоді захво-

рювання в сироватці виявляють анти-ВГА IgA, які також є ранніми антитілами і

372

Частина ІV. Вірусологія

зростають паралельно з IgM, проте зниження їх титру відбувається значно швид-

ше. Секреторні анти-ВГА IgA знайдено також у фекаліях.

Найчастіше для визначення титру антитіл використовують ІФА, РІА, деко-

ли – РЗК.

Гепатит В

Вірус гепатиту В (ВГВ) належить до родини Hepadnaviridae. Він представ-

ляє собою сферичної форми складнорганізований вірус діаметром до 42 нм (див.

вкл., рис. 30). Зовні вірус вкритий білково-ліпідною суперкапсидною оболонкою.

Капсид побудований за кубічним типом симетрії, складається з 180 капсомерів.

Серцевина вірусу містить ДНК, що складається з 3200 нуклеотидних основ, кова-

лентно пов’язану з поліпептидом, ДНК-полімеразу, протеїнкіназу. ДНК має фор-

му кільця, один з ланцюгів якої дефектний. У процесі репродукції вірусів ДНК-

полімераза добудовує дефектну ДНК.

ВГВ має декілька антигенів. Поверхневий антиген (HBsAg) високостійкий

до дії фізико-хімічних факторів. Його виявляють практично в усіх біологічних

рідинах хворих. Серцевинний антиген (НBcAg) входить до складу нуклеокапсиду

ВГВ. Цей антиген присутній в ядрах гепатоцитів хворих людей. HBeAg міститься

між HBcAg і НВsAg. Його можна виявити в цитоплазмі та ядрах гепатоцитів лю-

дей, які інфіковані вірусом. Деякі дослідники висловлюють припущення про існу-

вання ще одного антигену – HВxAg, який може мати відношення до ракової транс-

формації гепатоцитів.

Віруси гепатиту В мають високу резистентність до дії різноманітних фак-

торів зовнішнього середовища. Зокрема, вони витримують кип’ятіння протягом

15-20 хв, а при 60 °С – до декількох годин. Автоклавування при 121 °С інактивує

вірус протягом 30 хв, сухий жар (160 °С) – за 60 хв, а при 180 °С – за 40 хв.

У зв’язку з тим, що вірус гепатиту В не репродукується ні в культурах тка-

нин, ні в курячих ембріонах, можна виділити два основних напрямки лаборатор-

них досліджень – серологічну та експрес-діагностику.

Експрес-діагностика спрямована на виявлення у крові хворого антигенів

вірусу гепатиту – HBsAg, HBcAg і HBeAg. У рутинній лабораторній практиці най-

частіше визначають HBsAg. Він з’являється в крові хворих ще протягом інкубацій-

ного періоду, за декілька тижнів до появи основних клінічних симптомів хвороби

і зростання активності печінкових ферментів трансаміназ. Як правило, у сиро-

ватці крові поверхневих антигенів у декілька сотень або тисяч разів більше, ніж

самих вірусів. Розроблено декілька методів, що дозволяють виявити в сироватці

хворої людини або вірусоносія ці антигени: реакція преципітації в гелі, реакція

зворотної непрямої гемаглютинації, зустрічний імуноелектрофорез, РІА, ІФА.

Останні дві реакції за своєю чутливістю значно перевищують попередні. HBeAg

можна виявити за допомогою ІФА, РНГА, РНЗГА, РЗК, а HBcAg – ІФА, РІА та

інших.

Серологічні дослідження. З цією метою досліджують сироватку крові хво-

рих на наявність антитіл проти різних антигенів вірусів гепатиту В. Сучасні серо-

373

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

логічні методи дозволяють визначити в крові антитіла проти різноманітних вірус-

них антигенів: анти-HBs, анти-HBc і анти-HBe.

Найзручніші методи, що використовуються, – ІФА, РІА. Однак антитіла про-

ти HBsAg можна знайти ще за допомогою реакції преципітації в гелі, реакції не-

прямої гемаглютинації тощо.

Визначення взаємозв’язку між вірусними антигенами, що з’являються в крові

хворих або вірусоносіїв, та відповідними антитілами IgM i IgG, які нагромаджу-

ються в сироватці крові, є вкрай важливим з діагностичної точки зору, оскільки

дозволяє слідкувати за динамікою хвороби та прогнозувати її перебіг. Ці антигени

і антитіла названі маркерами вірусного гепатиту В. До них, таким чином, нале-

жать у першу чергу HBsAg, HBсAg, HBeAg, анти-HBs, анти-HBe, анти-HBs IgM і

сумарний пул антитіл проти цього антигену.

HBsAg можна знайти в організмі людини приблизно через 3-5 тижнів після

зараження. Про видужання після гострого гепатиту В свідчить повне зникнення

HBsAg та поява антитіл (анти-HBs) у сироватці крові. Останні можуть зберігатись

протягом всього життя. Однак антитіла проти поверхневого HBsAg з’являються

не відразу після його зникнення, а через деякий проміжок часу (від 2-4 тижнів до

1 року). У цей період маркером гепатиту виступають антитіла до HBсAg і, зокре-

ма, IgM, а сам цей період називається корівським вікном (від англ. core – серцеви-

на). Ці антитіла існують у сироватці не тільки при гострій формі гепатиту, але й

при хронічній. Не менш важливим маркером є анти-НВс антитіла, які належать до

класу IgG. Ці імуноглобуліни вторинної імунної відповіді можуть бути знайдені в

крові людини протягом всього життя.

Іншим діагностичним маркером гострого періоду хвороби є наявність HBеAg,

який може циркулювати у крові до 7 тижнів. Його вважають маркером реплікації

ДНК вірусу гепатиту В або антигеном інфекційності, тому що знаходять його най-

частіше разом з ДНК-полімеразою і ДНК вірусу гепатиту В. Хоча концентрація

цих антигенів у крові нижча, ніж HBsAg, вони є майже у всіх хворих.

При гострому гепатиті В HBeAg можна виявити в крові протягом 6-8 тижнів.

Пізніше там нагромаджуються антитіла проти них (анти-HBе), а вони самі

зникають. Якщо при відповідних дослідженнях у хворого виявляють HBeAg після

9-10 тижня від початку захворювання, це може розглядатись як свідчення хроні-

зації процесу. У таких випадках цей ензимний антиген циркулює в крові протягом

декількох років.

Ретельне вивчення антигенної будови вірусу гепатиту В та системи генів, які

його кодують, привернуло увагу до вірусних поліпептидів (антигенів), які коду-

ються геном env, зокрема, його зонами пре-S1 та пре-S2. Вважають, що наявність

пре-S2 антигену в крові свідчить про її високі інфекційні властивості. У той же

час у хворих, які одужали, в крові присутні антитіла до цього антигену. Пре-S1

антигени також засвідчують інфекційність крові, реплікацію вірусів в організмі, а

також достатньо високий ризик можливості вертикальної передачі вірусу гепати-

ту В від матері до дитини.

374

Частина ІV. Вірусологія

Гепатит С, Д, Е, G

Вірус гепатиту С належать до родини Flaviviridae. Його відносять до склад-

них вірусів. Віріон має діаметр 30-60 нм. У центрі міститься одноланцюгова плюс-

РНК, що складається з майже з 9500 нуклеотидних основ. Зверху вірус вкритий

суперкапсидною білково-ліпідною оболонкою. Віруси чутливі до ефіру, дезокси-

холату натрію, УФ-опромінення, здатні витримувати нагрівання до 50 °С.

Лабораторна діагностика спрямована на виявлення анти-ВГС IgM і IgG за

допомогою імуноферментного аналізу. Ці антитіла з’являються в крові приблизно

через 1 місяць після інфікування. У той же час розроблені тест-системи для іму-

ноферментного аналізу 1-3-го поколінь з використанням рекомбінантних антигенів

вірусів, дозволяють визначати антитіла безпосередньо до антигенів.

Дослідити наявність вірусної РНК у крові хворої людини можна за допомо-

гою полімеразної ланцюгової реакції.

Вірус гепатиту D належить до роду Deltavirus. Він круглої форми, діамет-

ром 35-37 нм. У центрі віріона міститься кільцева однониткова РНК, розташована

на HDAg. Вірус оточений суперкапсидною оболонкою, представленою HBsAg.

Вірус гепатиту D є дефектним, оскільки його реплікація відбувається за рахунок

геному ВГВ.

Вірус гепатиту D стійкий до високих температур, ферментів нуклеаз, однак

легко руйнується лугами і протеазами.

З метою лабораторної діагностики вірусного гепатиту D проводять визна-

чення таких його маркерів як HDAg, анти-HD IgM і IgG за допомогою РІА та ІФА.

Підтверджує діагноз гепатиту D безпосереднє виявлення ВГD у сироватці

крові або в гепатоцитах. HDAg з’являється в ядрах гепатоцитів у кінці інкубацій-

ного періоду і зберігається протягом гострої фази захворювання. Однак методи

його концентрування і отримання досить складні, тому доступні тільки для висо-

коспеціалізованих лабораторій.

Серологічна діагностика використовується для визначення у сироватці крові

антитіл IgM і IgG проти HDAg. Анти-HD IgM з’являються вже через 2 тижні після

інфікування, а пізніше починає зростати титр анти-HD IgG.

Вірус гепатиту Е не знайшов ще свого остаточного положення в класифі-

каційній системі. Вважалось, що він є представником родини Caliciviridae. Збуд-

ник має сферичну форму, його діаметр становить 32-34 нм. Геном вірусу пред-

ставлено однонитковою РНК, оточеною капсидом. Його поверхня має специфічні

виступи та невеликі западини.

Достатньо ефективних методів діагностики цієї форми гепатиту ще немає. Є

спроби виявити інфекційні агенти у фекаліях хворих за допомогою імунної електрон-

ної мікроскопії, ПЛР. Серологічна діагностика спрямована на визначення сумарної

кількості антитіл, які можна знайти, використовуючи відповідні системи для ІФА.

Вірус гепатиту G описано зовсім недавно (1995 р.). Це складний вірус, ге-

ном якого представлено однонитковою плюс-РНК. Зовні він оточений капсидною

та суперкапсидною оболонками.

375

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Основний матеріал для дослідження – кров хворих. У ній можна виявити або

вірусну РНК за допомогою ПЛР, або дослідити навність загального пулу імуно-

глобулінів проти інфекційного агента. З цією метою можна використати ІФА.

ВІЛ-інфекція

Віруси імунодефіциту людини (ВІЛ) входять до родини Retroviridae, роду

Lentivirus. Виділяють два види збудників синдрому набутого імунодефіциту – ВІЛ-І

і ВІЛ-ІІ.

ВІЛ-1 має округлу форму, його розміри – 100-120 нм (рис. 94). Геном скла-

дається з двох ідентичних „плюс”-ниток РНК, асоційованих з ревертазою та внут-

рішніми білками. У геномі міститься 9 генів (3 структурних: gag, pol, env, і 6 не-

структурних: tat, rev, vif, nef, vpr, vpu, які кодують внутрішні білки вірусу, реверта-

зу, ендонуклеазу, протеазу і специфічні білки зовнішньої оболонки). Серцевина

віріона оточена білками капсиду й набуває конусоподібної форми. З нею асоційо-

вані білки р7, р9, р24. Вона відділена від зовнішньої оболонки ще одним шаром

білків – матриксним (р17). На зовнішній ліпідній оболонці розміщені глікопротеї-

нові шипики, які складаються з двох субодиниць глікопротеїду (gp 41 i gp 120). У

сукупності їх позначають як gp 160. У зв’язку з особливостями структури генома,

ВІЛ має значну антигенну мінливість.

При нагріванні до 56 °С протягом 30 хв вірус інактивується. Він чутливий до

дії спирту, ефіру, ацетону, іонізуючого й ультрафіолетового випромінювання.

ВІЛ-2 за своєю будовою принципово не відрізняється від ВІЛ-1, однак має

певні відмінності в складі геному, білків тощо.

Діагностика СНІДу – складна і відповідальна. Вона ґрунтується на основних

клінічних проявах захво-

рювання, а також результа-

тах вірусологічних, серо-

логічних та інших методів

дослідження, і вимагає їх

комплексної оцінки.

Серологічна діагно-

стика. Сьогодні в Україні

розроблена двоетапна си-

стема лабораторної діаг-

ностики захворювання,

яка включає дослідження

сироватки крові людини

на наявність антитіл про-

ти ВІЛ. Сироватка крові

осіб з підозрою на ВІЛ-но-

сійство обстежується за

допомогою ІФА. Це відбу-

Рис. 94. Вірус імунодефіциту людини (схема).

Ліпідна

мембрана

Ревертаза

gp120

gp41

p17

p24

Серцевина

РНК і

білки р9, р7

376

Частина ІV. Вірусологія

вається в спеціалізованих лабораторіях з діагностики СНІДу, які розгортаються

на базах санепідстанцій, станцій переливання крові, поліклінік, диспансерів, інфек-

ційних лікарень тощо.

Основним матеріалом для дослідження є кров. Її забирають із ліктьової вени

в об’ємі 5 мл. Отриману пізніше сироватку можна зберігати при температурі 4 °С

протягом 7 днів. Запропоновано також використання способу “сухої краплини”.

Він полягає в тому, що за допомогою стерильної голки проколюють палець і дек-

ілька крапель крові наносять на стерильний диск, виготовлений з фільтрувально-

го паперу. Висушені диски можуть зберігатись тривалий час (до 6 місяців) у полі-

етиленових пакетах. У разі потреби за допомогою фосфатного сольового розчину

імуноглобуліни переводять у рідкий стан і досліджують.

Доведено, що антитіла проти ВІЛ можна виявити в сльозах, слині, грудному

молоці (IgA), спинномозковій рідині (в осіб з енцефалопатіями або неврологіч-

ною симптоматикою), навіть у сечі. Допустимим вважається дослідження на на-

явність антитіл рідини склоподібного тіла в трупів.

ІФА (в основному, непрямий) дозволяє визначити антитіла у будь-якому дос-

лідженому матеріалі. Він є достатньо чутливим методом, що використовується у

будь-яких лабораторіях світу. Антигени для цих тест-систем одержують або із за-

ражених тканинних культур, або за допомогою рекомбінантних ДНК. В Україні

використовують тест-системи “Антиген”, “Рекомбінант-ВІЛ”, “Скрин-ВІЛ”,

“Комбі-ВІЛ”, фірми “Аbbott” та інші.

Слід відзначити, що антитіла у крові з’являються не зразу після попадання

ВІЛ в організм, а не менш, ніж через 2-3 місяці, а деколи й довше (5-8 міс.), тому

слід пам’ятати, що ІФА є малопридатною для діагностики вірусоносійства саме в

серонегативний період. Одноразовий позитивний результат виявлення антитіл в

крові не дає можливості підтвердити діагноз набутого імунодефіциту. Цю реак-

цію рекомендують повторити тричі. Діагностичними вважаються два позитивних

результати в трьох повторах. Така схема постановки реакцій зумовлюється тим,

що сучасні тест-системи все ж таки можуть давати як псевдопозитивні, так і псев-

донегативні результати.

Зразки крові, які дали два позитивних результати з трьох повторів, направля-

ють у спеціалізовані лабораторії при науково-дослідних інститутах для підтвер-

дження наявності ВІЛ-вірусоносійства за допомогою твердофазного імунофер-

ментного аналізу – вестернблоту або імуноблоту (від англ. blott – пляма), реакції

непрямої імунофлуоресценціїї або радіоімунної преципітації. Ці методи дозволя-

ють виявити антитіла до певних вірусних білків.

Метод вестернблоту передбачає попереднє електрофоретичне розділення

вірусних білків у поліакриламідному гелі з наступним переносом їх на спеціальні

нітроцелюльозні мембрани. Після цього на фільтрах розганяються досліджувані

зразки крові з подальшою ідентифікацією їх білків (антитіла проти певних струк-

турних вірусних білків) за допомогою антивидових мічених сироваток. На нітро-

целюльозних фільтрах з’являються кольорові смуги, що відповідають комплек-

сам, утвореним вірусними структурними білками та антитілами сироватки віру-

377

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

соносія. Про позитивний результат реакції може свідчити наявність антитіл проти

вірусних білків р24, p31, gp41, gp120/160.

При негативних результатах на фільтрах не видно характерних зон забар-

влення.

Одним із ефективних способів визначення наявності антитіл проти ВІЛ у

сироватці крові людини є використання реакції мікроаглютинації. Вона подібна

до реакції непрямої гемаглютинації, однак замість еритроцитів, сенсибілізованих

відповідним антигеном, тут використовують як основу частинки желатину або

латексу. У випадку позитивного результату спостерігають за появою специфічного

осаду в лунках планшет. Дана реакція дає подібні результати до ІФА, проте значно

простіша за методикою постановки, швидше виконується, дає менше псевдопози-

тивних результатів.

Іншим методом виявлення антитіл проти ВІЛ є реакція непрямої імунофлуо-

ресценції. Для постановки цієї реакції використовують антиген, який одержують

з перещеплюваних ліній лімфоцитів, заражених вірусами імунодефіциту. З них

готують препарати фіксованих клітин, які можна зберігати протягом 2 місяців при

температурі -20 °С. У разі необхідності скельця з нанесеним антигеном обробля-

ють розведеними досліджуваними сироватками (1:10, 1:100, 1:1000 тощо), а потім

люмінесцентною антисироваткою проти імуноглобулінів людини. Препарати до-

датково контрастують синькою Еванса і вивчають у люмінесцентному мікроскопі.

Більш чутливим є метод радіоімунопреципітації. Як і при будь-якій імуно-

логічній реакції в його основі лежить взаємодія антигенів ВІЛ з антитілами проти

них. У цій реакції як антигени використовують білки ВІЛ, мічені радіоактивними

ізотопами

125

I або

Реакцію проводять у рідкій фазі, змішуючи гомологічні антигени (вірусні біл-

ки gp120, gp41, p24, p17, p9 та інші) й антитіла (сироватка вірусоносія), внаслідок

чого утворюються імунні комплекси. Вони взаємодіють із спеціальною системою,

яка складається з білка А S. аureus, з’єднаного із сефарозою, внаслідок чого відбу-

вається преципітація. Утворений комплекс за допомогою ультрацентрифугування

осаджують у пробірках, видаляють надосадову рідину, залишаючи тільки субстрат

антиген-антитіло-білок А-сефароза. На наступному етапі дослідження виклика-

ють дисоціацію комплексів додецилсульфатом натрію, піддають їх електрофоре-

зу в поліакриламідному гелі і за допомогою авторадіографії визначають молеку-

лярну масу мічених ізотопами білків. Це дозволяє встановити, які саме вірусні

білки знаходяться в імунних комплексах, отже, до яких вірусних білків утворю-

ються антитіла. Цей метод є чутливішим, ніж імуноблот, проте вимагає спеціаль-

ного обладнання, тому не використовується широко в лабораторній практиці.

Підсумовуючи вищевикладене, можна таким чином підійти до підтверджен-

ня діагнозу ВІЛ-носійства. Одноразовий негативний результат на наявність ан-

титіл, одержаний за допомогою ІФА, дозволяє зробити висновок про відсутність

ВІЛ-інфікування. Два позитивних результати з трьох повторних досліджень сиро-

ваток не дають змоги встановити діагноз вірусоносійства. Це можна зробити тільки

після одержання позитивних результатів про наявність антитіл проти певних вірус-

378

Частина ІV. Вірусологія

них структурних білків за допомогою імуноблотингу або інших методів, що його

замінюють.

Вірусологічна діагностика. Матеріалом для дослідження може бути кров,

спинномозкова рідина, грудне молоко, сперма, біоптати при автопсії тощо. Для

виявлення вірусу використовують електронну мікроскопію, зараження культур

Т-лімфоцитів (CD

-клітини). Для ідентифікації вірусів можливе використання ви-

сокочутливих тест-систем ІФА, реакції непрямої імунофлуоресценції, характер-

ної цитопатичної дії тощо.

Важливим для діагностики СНІДу є визначення провірусу в лімфоцитах, або

вірусних нуклеїнових кислот у патологічному матеріалі. З цією метою широко

використовують методи молекулярної гібридизації. Використання цього методу

набуває важливого значення особливо через те, що серонегативний період при

СНІДі може тривати декілька місяців. Висока чутливість запропонованого методу

дозволяє виявити навіть поодинокі вірусні частинки в крові (0,1-1,0 нг нуклеїно-

вих кислот). Принцип його полягає в тому, що в умовах in vitro викликається про-

цес гібридизації між вірусною нуклеїновою кислотою (ДНК, РНК) та спеціальним

зондом, який мічений радіоактивним фосфором

Р. Утворений комплекс достат-

ньо легко можна ідентифікувати за допомогою авторадіографії. Однак викорис-

тання

Р-зондів у певній мірі ускладнює цей метод, оскільки вони мають корот-

кий (2 тижні) період напіврозпаду, вимагають дотримання суворих правил техні-

ки безпеки при роботі з радіоактивними ізотопами тощо. Враховуючи це,

перспективним напрямком є використання зондів, які можна виявити за допомо-

гою кольорових ферментативних реакцій. Такою міткою є біотин (біотиновий зонд).

Існують різноманітні варіанти молекулярної гібридизації, серед яких найча-

стіше застосовуються точкова гібридизація, блот-гібридизація, сандвіч-гібриди-

зація, гібридизація in situ (в заражених тканинах).

Одним з варіантів молекулярної гібридизації розглядається полімеразно-лан-

цюгова реакція, в основі якої лежить ампліфікація генів. Використання ДНК-полі-

мерази, наприклад, з Thermophylus aquaticus дозволяє за кілька циклів ампліфі-

кації значно збільшити кількість досліджуваних нуклеїнових кислот, внаслідок

чого їх можна виявити будь-якими відомими методами – ІФА, електрофорез у полі-

акриламідному гелі тощо. Ця реакція суттєво перевищує чутливість попередньо-

го методу (на декілька порядків), тому може бути використана при дослідженні

мікрооб’ємів матеріалу або таких тест-об’єктів, де іншими методами віруси іму-

нодефіциту не виявляються, наприклад, змиви з носоглотки, слина.

Крім описаних методів діагностики, допустимим визнається виявлення ан-

тигенемії, яка зумовлена білком р24. Цей р24-антиген можна визначити за допо-

могою модифікованих методів ІФА.

Одержання позитивного результату при застосуванні одного з наведених ме-

тодів є достатнім аргументом для встановлення етіологічного діагнозу ВІЛ-

інфекції.

Вірусологічна діагностика СНІДу – достатньо складний процес, доступний

для виконання тільки у високоспеціалізованих лабораторіях, де створюються всі

379

Розділ 14. Шпитальні інфекції

необхідні умови для роботи (захист персоналу від зараження під час культивуван-

ня, очищення та концентрування ВІЛ) і є висококваліфіковані фахівці.

Таким чином, при наявності ВІЛ-інфекції у вірусоносіїв або хворих на СНІД

можна виявити такі вірусспецифічні маркери: антитіла до ВІЛ, безпосередньо

інфекційний вірус, провірус у ДНК уражених імуноцитів, вірусний антиген у си-

роватці крові та інфікованих клітинах-мішенях.

Розділ 14

ШПИТАЛЬНІ ІНФЕКЦІЇ

Захворювання мікробної етіології, що виникають у госпіталізованих хворих

під час перебування їх у стаціонарах або у медичних працівників під час роботи в

них, називаються нозокоміальними або внутрішньолікарняними (шпитальни-

ми) інфекціями.

Зустрічаються вони в усіх країнах світу і є серйозною проблемою для ліку-

вально-профілактичних закладів охорони здоров'я. Вони, як правило, приєдну-

ються до основного захворювання або вперше виникають у новонароджених

Розрізняють такі основні групи нозокоміальних інфекцій: бактеріємії й сеп-

тицемії, гнійно-запальні ускладнення ран і опіків, гострі кишкові, респіраторні,

урогенітальні, посттрансфузійні інфекції та захворювання, обумовлені довготри-

валим лікуванням антибіотиками.

Збудниками цих захворювань можуть бути найрізноманітніші види бактерій,

вірусів, грибів і найпростіших. Однак провідна роль належить представникам

кокової групи, бактероїдам, клостридіям та численним грамнегатавним паличкам

Питома вага грамнегативних бактерій у виникненні шпитальних інфекцій з року

в рік зростає.

Мікробіологічна діагностика внутрішньолікарняних інфекцій має свої особ-

ливості і труднощі У зв'язку з великою різноманітністю збудників потрібно засто-

совувати різні методи дослідження При бактеріологічній діагностиці гнійно-за-

пальних захворювань часто виділяють мікробні асоціації (стафілококи і грамне-

гативні бактерії, декілька видів ентеробактерій тощо) Коли ж виділяють

умовно-патогенні мікроорганізми, важливо визначати їх кількість у досліджува-

ному матеріалі. Критична концентрація складає 10

-10

клітин в 1 мл. Але кількість

мікробів у досліджуваному матеріалі може дуже різнитися. Тому важливо прово-

дити і видову ідентифікацію бактерій та визначати їх потенційні патогенні влас-

тивості. Необхідно також ставити відповідні серологічні реакції для виявлення

специфічних антигенів у крові хворого, визначати антитіла (особливо наростання

їх титру) до автоштамів, і тим самим обгрунтовано підтверджувати діагноз.

380

Частина ІV. Вірусологія

Нижче наведені основні методичні прийоми мікробіологічної діагностики

окремих госпітальних інфекцій, які найчастіше зустрічаються в лікарняних зак-

ладах.

Бактеріємії й септицемії, як одні з тяжких форм назокоміальних інфекцій,

можуть спричинити практично майже всі види патогенних мікроорганізмів. Грам-

позитивні бактеріємії найчастіше викликають золотисті й епідермальні стафіло-

коки та стрептококи, а грамнегативні бактеріємії – ешерихії, клебсієли, псевдомо-

нади, протей, серації, нейсерії. Збудниками септицемій найчастіше є бактероїди

та клостридії.

Точний діагноз цих форм нозокоміальних інфекцій можна встановити лише

після виділення гемокультури. Для проведення мікробіологічного аналізу беруть

лише венозну кров (по можливості до прийому або через 12-24 год після останнього

прийому антибактеріальних препаратів). При цьому необхідно дотримуватись, жор-

стких правил асептики В місці венепункції шкіру обробляють 70 % спиртом, потім

одним із антисептиків (йодоформ, хлоргексидин) і знову спиртом. Оброблена поверх-

ня повинна висохнути і лише через 1-2 хв беруть 10-20 мл крові (у дітей 3-5 мл).

Посіви проводять у 2 флакони (по 5-10 мл) із збагаченими живильними сере-

довищами у співвідношенні 1:10 і швидко надсилають до лабораторії, не допус-

каючи заморожування Один флакон інкубують у звичайних аеробних умовах, дру-

гий – заливають вазеліновим маслом, щоб забезпечити ріст анаеробів Для виді-

лення аеробних бактерій використовують “подвійне середовище” (скошений агар

і цукровий бульйон у одному флаконі: посів крові проводять у бульйон і при інку-

бації періодично зрошують ним скошену частину агару, на якому потім вироста-

ють ізольовані колонії). Для анаеробних бактерій використовують тіогліколевий

бульйон та середовище Кітта-Тароцці, для грибів – рідке середовище Сабуро.

Мікроскопічне дослідження крові, зазвичай, не проводять, оскільки виявити

бактерії у мазках вдається дуже рідко.

Засіяні середовища у флаконах витримують у термостаті при 37 °С впродовж

7 днів, контролюючи наявність росту макро- і мікроскопічно кожного дня, роб-

лять висіви на відповідні щільні середовища з метою виділення та ідентифікації

чистих культур, вивчення їх біологічних властивостей і чутливості до антибіо-

тиків. При відсутності росту протягом тижня проводять повторне дослідження на

14-ий день. Якщо росту немає протягом двох тижнів, результат вважають негатив-

ним. При виділенні бактероїдів дослідження може тривати три і більше тижнів.

Для підвищення частоти виявлення бактерій рекомендують брати кров для

виділення гемокультури тричі впродовж доби.

Захворювання дихальних шляхів (риніти, фарингіти, бронхіти, пневмонії,

абсцеси і гангрени легень та ін.) викликають паличка інфлуенци, пневмококи,

мікоплазми, пневмоцисти, а також орто- і параміксовіруси, рино- і коронавіруси,

адено- і респіраторно-синцитіальні віруси. Внутрішньолікарняні інфекції дихаль-

них шляхів (особливо пневмонії) домінують серед всіх інших захворювань.

Основним матеріалом для дослідження є мазки з носа, рото- і носоглотки,

харкотиння та промивні води бронхів. Порівняно рідко досліджують біоптати ле-