Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник

Подождите немного. Документ загружается.

341

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Досліджувані пробірки

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 7 8

Ізотонічний розчин

хлориду натрію

– 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Вірусмісткий матеріал,

попередньо розведений

в 10 разів

0,2 0,2

→

↓

–

Розведення 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 –

1 % завись еритроцитів

курки

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Інкубація при температурі 18-20

C протягом 30 хвилин

Результат

Таблиця 70

Схема титрування вірусів за допомогою РГА

порожнини. Заражають, як правило, 3-5 ембріонів. Ембріони інкубують при опти-

мальній температурі 33-34 °С протягом 72 год. З метою збільшення кількості

віріонів у досліджуваному матеріалі його попередньо концентрують. Для цього

використовують методи адсорбції вірусів на курячих еритроцитах, обробку 0,2 %

розчином трипсину з метою підсилення інфекційних властивостей вірусів або

осаджують їх за спеціальними методиками.

Після інкубації курячі ембріони охолоджують при температурі 4 °С протягом

2-4 год, потім відсмоктують стерильними піпетками або шприцем алантоїсну чи

амніотичну рідину. У ній за допомогою РГА визначають наявність інфекційного

вірусу. Для цього змішують рівні об’єми (0,2 мл) вірусмісткого матеріалу і 1 %

зависі еритроцитів курей. Про позитивну реакцію (наявність вірусу в матеріалі)

свідчить осідання еритроцитів у вигляді парасольки.

За умови наявності в матеріалі вірусу, який має гемаглютинуючі властивості,

його титрують за допомогою розгорнутої РГА, визначаючи титр гемаглютинуючої

активності (табл. 70).

За допомогою цієї реакції визначають титр гемаглютинуючого вірусу – най-

більше розведення матеріалу, яке ще дає реакцію гемаглютинації. Цю кількість

вірусу приймають за одну гемаглютинуючу одиницю (ГАО ).

Ідентифікують віруси грипу за допомогою РГГА (табл. 71). Для цього спо-

чатку готують робоче розведення вірусного матеріалу, яке містить 4 ГАО вірусу в

певному об’ємі.

Облік реакції проводять після утворення осаду еритроцитів в контрольних

лунках. Про позитивну реакцію свідчить затримка гемаглютинації в досліджува-

них лунках.

Виділяти віруси грипу можна, використовуючи різноманітні лінії культур

клітин – ембріону людини, нирок мавп, перещеплювані лінії клітин нирок собаки

(MDCK) тощо. У клітинних культурах проявляється цитопатична дія вірусів (по-

ява клітин з фестончастими краями, вакуолями, формування внутрішньоядерних

і цитоплазматичних включень), яка завершується дегенерацією моношару клітин.

342

Частина ІV. Вірусологія

Для ідентифікації виділених вірусів використовують РГГА (за умови, якщо титр

гемаглютинінів становить у культуральній рідині не менше 1:8). Крім цієї реакції,

можна використати РГГ

адс

, однак вона є менш чутливою і вимагає титру імунної

сироватки не менше, ніж 1:160

а також

РЗК, РН, РЕМА тощо.

Серологічне дослідження використовують для підтвердження діагнозу гри-

пу. Воно грунтується на визначенні чотирикратного зростання титру антитіл у

сироватці хворого.

Першу сироватку отримують на початку хвороби в гострому періоді (2-5-й

день хвороби), другу – після 10-14-го дня захворювання. Оскільки сироватки дослі-

джують одночасно, першу з них зберігають у холодильнику при температурі -20 °С.

Найчастіше використовують РГГА, РЗК, РНГА. Ці реакції ставлять із спеці-

альними наборами стандартних вірусних діагностикумів (еталонні штами вірусів

грипу різних серологічних типів). Оскільки сироватки хворих можуть містити

неспецифічні інгібітори гемаглютинації, їх спочатку прогрівають при темпера-

турі 56 °С, а також обробляють спеціальним ферментом (наприклад, нейрамініда-

зою) або розчинами перйодату калію, риванолу, хлориду марганця, суспензією

білої глини тощо за спеціальними схемами.

Реакцію гальмування гемаглютинації можна ставити в пробірках (макроме-

тод) або в спеціальних планшетах для імунологічних досліджень (мікрометод).

Схема постановки РГГА наведена в таблиці 72.

Таблиця 71

Схема типування вірусів грипу в РГГА

Досліджувані лунки

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 7

Контроль

сироватки

Контроль

еритроцитів

Ізотонічний розчин

хлориду натрію

– 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

0,2

Діагностичні

сироватки (1:10)

H1N1 (1-ий ряд)

0,2 0,2

→ → → → ↓

0,2 –

H2N2 (2-ий ряд)

0,2 0,2

→ → → → ↓

0,2 –

H3N2 (3-ій ряд)

0,2 0,2

→ → → → ↓

0,2 –

Досліджувані віруси

(4 ГАО в 0,2 мл)

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 – –

Розведення 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 – –

Інкубація при 18-20

C протягом 30 хв

1 % суспензія

еритроцитів курки

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0.4

Інкубація при 18-20

C протягом 1 год

Результат

Сироватки: H1N1

H2N2

H3N2

343

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Таблиця 72

Схема РГГА для серологічної діагностики грипу

Досліджувані лунки

Компоненти, мл

1 2 3 4 5 6 7

Контроль

сироватки 1:5

Контроль

діагностикуму

Контроль

еритроцитів

Ізотонічний розчин

хлориду натрію

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Сироватки хворого

(1:5):

І (1-ий ряд) 0,2

→

↓

0,2 – –

ІІ (2-ий ряд)

0,2

→ → → → → ↓

0,2 – –

Вірусний

діагностикум

(4 ГАО в 0,2 мл)

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 – 0,2 –

Розведення

сироваток

1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 – – –

Інкубація при 18-20

C протягом 30 хв

1 % суспензія

еритроцитів курей

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0.4

Інкубація при 18-20 °C протягом 1 год

Результат

Сироватки: І

ІІ

Реакція вважається позитивною при утворенні компактного, щільного осаду

еритроцитів з рівними краями.

Експрес-діагностика. Метод базується на виявленні в досліджуваному ма-

теріалі специфічних вірусних антигенів за допомогою імунофлуоресценції в прямій

або непрямій РІФ. Слиз отримують із носових ходів або задньої стінки глотки,

центрифугують і з осаду клітин циліндричного епітелію слизової оболонки готу-

ють мазки на предметних скельцях. Їх обробляють імунофлуоресцентними сиро-

ватками, кон’югованими з флуорохромами, наприклад, ФІТЦ (флуоресцеїнізоті-

оцианат). При дослідженні препаратів за допомогою люмінесцентного мікроско-

па спостерігають характерне зелено-жовтувате світіння вірусів грипу, які

локалізуються на початку хвороби в ядрах епітеліальних клітин.

Останнім часом пропонується використовувати для індикації специфічних

вірусних антигенів ІФА, РЗНГА, ПЛР.

344

Частина ІV. Вірусологія

Параміксовірусні інфекції

До родини Paramyxoviridae (para – біля, myxa – слиз) належать віруси пара-

грипу, епідемічного паротиту, кору та респіраторно-синцитіальний вірус.

Парагрип

Віруси парагрипу за формою та ультраструктурою подібні до грипозних, але

значно більші за розмірами. Діаметр сферичних форм – 150-300 нм. Зустрічають-

ся також грушеподібні й гіллясті форми. Віруси містять однониткову лінійну не-

фрагментовану “мінус” нитку РНК. Суперкапсидна оболонка має гемаглютинін і

нейрамінідазу. Віруси містять 6-8 структурних білків, серед яких білки нуклео-

капсиду – HN, P, L. Особливий білок М локалізується між нуклеокапсидом і су-

перкапсидною оболонкою.

Віруси здатні аглютинувати еритроцити гвінейських свинок, курей, мавп і

людини. Культивуються в перещеплюваних і первинних культурах клітин людини

й мавп (HeLa, BHK-21, Vero, HЕp-2, СМЦ), але погано розвиваються в курячих

ембріонах. За антигенною будовою розрізняють 5 серотипів, які спричиняють різні

респіраторні захворювання: гострі фарингіти, ларингіти, трахеобронхіти, пнев-

монію, круп. Особливо тяжкий перебіг захворювань у дітей першого року життя.

Для вірусологічної діагностики парагрипозної інфекції досліджують слиз

із задньої стінки глотки, нижніх носових ходів, автопсійний матеріал (тканини

трахеї, бронхів, легень). Як правило, матеріал забирають у перші дні хвороби, що

пов’язано з високою концентрацією віріонів у ньому. Забір проводять одночасно

за допомогою 2-3 стерильних ватних тампонів, які пізніше занурюють в одну про-

бірку з 5 мл розчину Хенкса та 5 % бичачого сироваткового альбуміну або грітої

бичачої сироватки крові. Перед наступним виділенням вірусів тампони віджима-

ють і видаляють з пробірки, і після відстоювання відбирають середню порцію

рідини для подальшого дослідження. Присутню мікрофлору знищують додаван-

ням по 500 ОД/мл пеніциліну і стрептоміцину, виримуючи пробірки протягом 30

хвилин при кімнатній температурі, і заражають моношари культур клітин. Матері-

ал, який залишився, зберігають певний час при температурі -18 °С для повторно-

го, у разі потреби, дослідження.

Довести наявність вірусів у культурах клітин можна через 2-4 дні за цитопа-

тичною дією. При цьому спостерігається утворення симпластів з численними яд-

рами, заокруглені контури клітин, культура набуває вигляду твердого сиру (ділян-

ки відсутності клітин). З цією метою також широко використовується реакція ге-

мадсорбції (РГ

адс

.), яку ставлять з еритроцитами гвінейських свинок. Починаючи

з 6-8 дня культивування вірусів для індикації їх в культурі клітин можна викорис-

тати РГА з еритроцитами гвінейських свинок.

Для типування парагрипозних вірусів використовують РН, РГГА, РЗК, РГГ

адс

та інші. У реакції гальмування гемаглютинації використовують 0,7 % завись ерит-

роцитів гвінейських свинок або людини. Слід звернути увагу, що чутливість ре-

345

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

акції підвищується, якщо систему „вірусмісткий матеріал – противірусна діагно-

стична сироватка” інкубувати при кімнатній температурі протягом 2 год або 18

год при 4 °С. Після додавання відповідних еритроцитів реакцію ще витримують

при 22 °С протягом 1 год і оцінюють результати. Оскільки різні серотипи вірусів

парагрипу мають спільні антигени імунологічні реакції ставлять, попередньо зро-

бивши розведення діагностичних сироваток. Серологічний тип вірусу визначають

за найбільшим титром діагностичної сироватки, яка дала позитивний результат.

Значного поширення набула для ідентифікації вірусів парагрипу РН, в якій

результати оцінюють за гемадсорбцією. При її постановці спочатку витримують

суміш інактивованих прогріванням при 56 °С 30 хв типоспецифічних діагностич-

них сироваток з виділеним вірусом протягом 2 год при кімнатній температурі.

Потім заражають культури клітин, інкубуючи їх при 35 °С 4-5 днів, і додають

завись еритроцитів гвінейських свинок. Після інкубації протягом 20 хв при тем-

пературі 37 °С читають результати. При нейтралізації сироваткою вірусів пара-

грипу не спостерігається адсорбції еритроцитів на поверхні клітин.

Серологічна діагностика проводиться з парними сироватками хворого, які

одержують відповідно на початку захворювання і двома тижнями пізніше. Протя-

гом цього часу першу сироватку зберігають у холодильнику в замороженому стані.

Чотирикратний приріст титру антитіл визначають паралельно у двох рядах про-

бірок, використовуючи стандартні методики постановки РГГА і РЗК.

Експрес-діагностика є достатньо інформативним методом, який дозволяє

визначити віруси в досліджуваному матеріалі. З цією метою частину матеріалу,

який було отримано для вірусологічної діагностики, центрифугують 5-7 хв при

1000 об/хв. Отриманий осад ресуспензують у 3-5 краплях надосадової рідини і

готують з нього мазки. Їх обробляють імунофлуоресцентними сироватками і до-

сліджують у люмінесцентному мікроскопі.

Спостерігаються циліндричні або полігональні клітини і заокругленої фор-

ми лейкоцити. За умови наявності вірусів у клітинах з’являється характерне зеле-

не світіння цитоплазми окремих клітин, у той час як клітини, що не містять вірусів,

мають цегляно-червоний колір. Оцінити достовірність результатів дозволяє вив-

чення контрольних препаратів.

До супернатанту, що залишився, додають пеніцилін і стрептоміцин в концен-

трації 500 ОД/мл. Через 30 хв інкубації при температурі 18-20 °С матеріалом зара-

жають культури клітин, які вирощуються заздалегідь на стерильних предметних

скельцях, вміщених у пробірки. Культивують віруси у такому стані 24-72 год при

температурі 35 °С, а потім скельця з культурою клітин промивають стерильним

буферним розчином і висушують. Для фіксування використовують охолоджений

до -20 °С ацетон (10-20 хв при кімнатній температурі), пізніше скельця висушу-

ють і обробляють специфічними імунофлуоресцентними сироватками (пряма або

непряма реакція імунофлуоресценції).

Визначити незначну кількість вірусів у будь-якому досліджуваному матері-

алі можна, використовуючи методи генетичної діагностики, і, зокрема, полімераз-

ну ланцюгову реакцію.

346

Частина ІV. Вірусологія

Епідемічний паротит

Під електронним мікроскопом паротитний віріон має неправильну куполо-

подібну форму діаметром 150-170 нм. Збудник паротиту добре культивується в

курячих ембріонах, а також у клітинах HeLa та ниркового епітелію ембріона лю-

дини. Віруси мають виражені гемаглютинуючі, нейрамінідазні й гемолітичні вла-

стивості. Вони нестійкі до дії фізичних і хімічних факторів, швидко інактивують-

ся ефіром, трипсином, формаліном, ультрафіолетовими променями. Резистентні

до висушування, не втрачають інфекційних властивостей при 4°С протягом 2 міс.,

при кімнатній температурі – 4 дні. При 55 °С гинуть через 20 хв.

Вірусологічна діагностика. Для дослідження від хворого беруть слину,

спинномозкову рідину (при підозрі на менінгіт, менінгоенцефаліт), сечу. Забір ма-

теріалу краще проводити в перші дні захворювання. Для знищення сторонньої

мікрофлори отриманий матеріал обробляють сумішшю пеніциліну і стрептоміци-

ну в концентрації 500-1000 ОД/мл. Спочатку його центрифугують при 1500 об/хв,

потім супернатант підлягає повторному центрифугуванню при 40000 об/хв протя-

гом 1,5 год. Для подальших досліджень використовують осад, попередньо ресус-

пензований в розчині Хенкса.

Щоб виділити з нього вірус, осад вводять в амніотичну порожнину 7-8-ден-

них курячих ембріонів. Ембріони інкубують при температурі 35 °С протягом 6-7

днів. Щоб довести наявність вірусу в матеріалі, використовують РГА з 1 % сус-

пензією еритроцитів курей. Можна використати як досліджуваний об’єкт освіт-

лену 20 % суспензію амніотичних оболонок, оскільки при декількох пасажах

вірусів у алантоїсній рідині їх гемаглютинуючий титр зростає.

Іншим методом виділення вірусів є зараження культур клітин. Найчастіше

використовують клітини нирок мавп, ембріону людини, перещеплювані лінії Vero,

BHK-21. Довести наяність вірусів можна за допомогою оцінки цитопатичної дії,

РГА та РГА

адс

. Для постановки останньої до інфікованої культури клітин додають

0,4 % суспензію еритроцитів курей або гвінейських свинок. Систему витримують

до 5 хв при температурі 18-20 °С, відмивають вільні еритроцити і спостерігають

під мікроскопом явище адсорбції останніх на поверхні заражених клітин.

Для ідентифікації збудників використовують РЗК, РГГА, а при використанні

культур клітин – РН. Можна використати з цією метою метод антитіл, які флуо-

ресцують. Як діагностичні препарати використовують сироватки імунізованих

тварин або людей, які перехворіли на епідемічний паротит.

Серологічна діагностика. З цією метою досліджують парні сироватки для

виявлення приросту титру антитіл проти вірусів епідемічного паротиту в РГГА,

РЗК, РН, РГГ

адс

. Як антиген використовують стандартний діагностикум із збуд-

ників або антигени, які одержують із амніотичної чи алантоїсної рідини зараже-

них курячих ембріонів. Діагностичним вважається чотирикратний приріст титру

антитіл у другій сироватці в порівнянні з першою. Як правило, титри антитіл у

другій сироватці при використанні РГГА сягають 1:320, а при РЗК – 1:64.

347

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Експрес-діагностика. Довести наявність вірусів у слині, сечі чи спинномоз-

ковій рідині можна при використанні методу антитіл, які флуоресцують. Найчас-

тіше використовують метод непрямої імунофлуоресценції.

Останнім часом у спеціалізованих вірусологічних лабораторіях використо-

вують полімеразну ланцюгову реакцію для виявлення вірусної нуклеотидної кис-

лоти у досліджуваному матеріалі.

Кір

Зрілий віріон кору має овальну форму діаметром 120-250 нм. У середині містить

однониткову “мінус”-нитку несегментованої РНК. Суперкапсидна оболонка має

вирости (шипики). Вірусні структурні компоненти представлено гемаглютиніном,

F1- і F2-білками, нуклеокапсидним та М-протеїном, а також білком полімеразного

комплексу. На відміну від інших парамікосвірусів, не містить нейрамінідази, однак

має гемаглютинін, який спричиняє аглютинацію еритроцитів мавп. Репродукується

в первинно-трипсинізованих культурах клітин ниркового епітелію, HeLа, HЕp-2, Vero,

погано культивується в курячих ембріонах. У культурах клітин викликає цитопатичну

дію у вигляді симпластів. Існує лише один антигенний тип вірусу. Він нестійкий до

дії факторів зовнішнього середовища, при кімнатній температурі гине через кілька

годин, але вірулентність втрачає через 30 хв. Чутливий до дії високих температур,

ультрафіолетового опромінення, добре зберігається в замороженому стані.

Вірусологічна діагностика. Найчастіше кір діагностують на підставі клінічної

симптоматики, спостерігаючи етапи появи висипань, появу плям Бельського-Філа-

това-Копліка на слизовій оболонці щік тощо.

Лабораторна діагностика проводиться рідко. Методи виділення та ідентифі-

кації вірусів у звичайній лабораторній практиці не застосовують, хоча знайти вірус

у досліджуваному матеріалі можна за 2-3 дні до появи висипань. Проте, як дослі-

джуваний матеріал для виділення вірусів, можуть бути використані змиви з носо-

вої частини глотки, виділення з кон’юнктиви, сеча, кров, спинномозкова рідина, а

також секційний матеріал. Після відповідної підготовки (додавання пеніциліну і

стрептоміцину, в разі потреби центрифугування тощо) матеріалом заражають пер-

винно-трипсинізовані культури клітин ембріона людини, нирок мавп або пере-

щеплювані лінії Hela, HЕp-2 та інші. Культури клітин підлягають спостереженню

протягом 30 діб. Одним з критеріїв наявності вірусів у матеріалі є поява цитопа-

тичної дії, що проявляється утворенням синцитіїв і злиттям клітин. Типувати віруси

можна, використовуючи метод імунофлуоресценції, РГГ

адс

, РН у культурі клітин

за феноменом гемадсорбції, ІФА.

Серологічна діагностика кору використовується в лабораторній практиці

значно частіше. Дослідженню підлягають парні сироватки хворих. Віруснейтралі-

зуючі, антигемаглютинуючі та комплементзв’язуючі антитіла виявляють в крові

досить рано. Часто вони досягають високих титрів разом з появою висипань. Пер-

шу сироватку беруть у перші дні захворювання, другу – через 12-14 днів. Став-

лять реакції паралельно в двох рядах пробірок.

348

Частина ІV. Вірусологія

Для спостереження за динамікою зростання титру антитіл використовують

РН, РГГА, РНГА, РЗК. Для постановки РГГА використовують еритроцити при-

матів. РНГА є однією з найдоступніших у лабораторній практиці. Позитивними

вважають ті реакції, які довели чотирикратне зростання титру антитіл.

Експрес-діагностика. Як і при більшості інших вірусних захворювань, ме-

тод флуоресцуючих антитіл дозволяє швидко визначити вірус в епітеліальних клі-

тинах носоглоткових змивів, осаді сечі, лейкоцитах крові, секційному матеріалі

(мозок) тощо. Антигени, що локалізуються в цитоплазмі, світяться в ультрафіоле-

тових променях люмінесцентного мікроскопа при обробці специфічними сиро-

ватками, міченими флуорохромами.

Полімеразна ланцюгова реакція надає можливість швидко визначити нуклеї-

нову кислоту віріонів кору безпосередньо в досліджуваному матеріалі.

Респіраторно-синцитіальні інфекції

РС-віруси належать до роду Pneumovirus. У центрі віріона розташована од-

нониткова “мінус”-нитка несегментованої РНК. Вона вкрита капсидною та супер-

капсидною оболонками. На поверхні вірусу розташовується F-білок (білок злит-

тя), який забезпечує проникнення вірусів у чутливі клітини. Поверхня віріонів

вкрита особливими виростами (шипиками), які складаються з глюкопротеїдів.

Структурні білки вірусів представлено 8 поліпептидами: N, P, L, M, M2, F, G, SH4.

Віруси не мають гемаглютинуючої та нейрамінідазної, проте проявляють частково

гемолітичну та гемадсорбуючу активність. Виділяють два підтипи респіраторно-

синцитіальних вірусів, які диференціюються за допомогою серологічних реакцій.

Віруси культивують у культурах клітин, одержаних із тканин мавп, великої

рогатої худоби, людини, перещеплюваних клітинах Vero, HЕp-2 та ін.

РС-віруси мають досить високу чутливість до дії факторів зовнішнього сере-

довища, таких як температура, ультрафіолетове опромінення, різноманітні жиро-

розчинники, детергенти, дезінфектанти тощо. Тривалий час може зберігатись при

температурі -70 °С.

Вірусологічна діагностика. Досліджуваним матеріалом для виділення вірусів

є виділення з носоглотки, слиз з ділянки голосової щілини, мазки із порожнини

носа, ротоглотки, біоптати, секційний матеріал (шматочки трахеї, бронхів) та ін.

Враховуючи, що вірус надзвичайно чутливий до дії факторів довкілля, бажано

проводити зараження культур клітин біля ліжка хворого або матеріал перед транс-

портуванням у вірусологічну лабораторію заморожується до -70 °С.

Використовуються 3-4-денні перещеплювані лінії культур HeLa, HЕp-2, KB,

Vero та ін. Через 3-7 днів визначають наявність вірусів у клітинах і проводять їх

ідентифікацію. Візуально під мікроскопом можна виявити багатоядерні клітини

(синцитій) з цитоплазматичними включеннями. За декілька днів спостерігають їх

деструкцію та відшарування від скла. Ідентифікують віруси за допомогою РН,

РЗК, методу імунофлуоресценції, ІФА.

349

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Серологічна діагностика. З цією метою досліджують парні сироватки хво-

рого на наявність антитіл. Діагноз підтверджує чотирикратне зростання титру

антитіл у другій сироватці порівняно з першою. РН і РЗК, РНГА, ІФА найчастіше

використовують для ретроспективної діагностики. РЗК ставлять на холоді. Запро-

поновано також нові варіанти РН – у присутності комплементу, мікрометод, реак-

ція пригнічення бляшкоутворення під агаровим покриттям. Діагностикум для цих

реакцій готують, заражаючи респіраторно-синцитіальним вірусом стандартні куль-

тури клітин. У пробірки вносять, як правило, по 100 ЦПД

Експрес-діагностика. Віруси (специфічний антиген) можна знайти в епітелі-

альних клітинах носових ходів, ротоглотки тощо. Після обробки його імунофлуо-

ресцентною сироваткою спостерігають характерне світіння поліморфних вклю-

чень у цитоплазмі або всієї цитоплазми клітини. Може бути використаний непря-

мий метод ензиммічених антитіл, РІА, РЗНГА, а також генетичні методи

діагностики.

Ентеровірусні інфекції

Ентеровіруси людини входять до родини Picornaviridae, яка нараховує понад

70 представників: 3 серотипи поліовірусу, 29 серотипів вірусів Коксакі, 32 серо-

типи вірусів ЕСНО і 4 ентеровіруси 68-71-го серотипів. Сюди віднесено також і

вірус гепатиту А, який часто називають ентеровірусом 72-го серотипу.

Для лабораторної діагностики ентеровірусних інфекцій використовують віру-

сологічні, серологічні та експрес-методи. Останнім часом різко знизилась захво-

рюваність на поліомієліт і зросла кількість поліомієлітоподібних захворювань,

які викликають віруси Коксакі, ЕСНО. Отже, вірусологічні дослідження необхід-

но проводити одночасно на виявлення всіх ентеровірусів.

Матеріалом для дослідження служать випорожнення хворих протягом пер-

шого тижня, змиви з носоглотки не пізніше третього дня, кров, ліквор, сеча не

пізніше п’ятого дня, сироватка крові в перший і 14 дні; в разі смерті – шматочки

мозку, внутрішніх органів, лімфовузли.

Випорожнення беруть у пеніцилінові флакони, емульгують у розчині Хенкса,

центрифугують і додають ефір та антибіотики. Змиви з носоглотки отримують

шляхом двократного полоскання горла стерильним ізотонічним розчином хлориду

натрію, освітлюють центрифугуванням і обробляють ефіром та антибіотиками.

Середню порцію сечі (10 мл) також обробляють пеніциліном і стрептоміцином.

Кров та ліквор використовують для вірусологічних досліджень без поперед-

ньої обробки. Секційний матеріал емульгують у стерильних ступках з піском, го-

тують 20 % суспензію в розчині Хенкса, центрифугують і додають антибіотики

Вірусологічні дослідження. Виділення та ідентифікація ентеровірусів є ос-

новним методом лабораторної діагностики. Для цього використовують різноманітні

культури клітин та лабораторних тварин. Оброблений, як вище зазначено, клінічний

матеріал інокулюють у 2-3 види перещеплюваних і первинних культур клітин.

Наприклад, для виділення всіх 3-ох типів вірусу поліомієліту використовують пер-

350

Частина ІV. Вірусологія

винні культури клітин нирок мавп і перещеплювані клітини HeLa, Vero, HЕp-2.

Віруси Коксакі В, ЕСНО успішно виділяють на клітинах ниркового епітелію мавп

та на багатьох клітинах людського походження (RH, HeLa, HЕp-2 та інші). Виді-

лення вірусів Коксаки А здійснюється на культурі клітин RD.

При розмноженні ентеровірусів у культурі клітин мікроскопічно виявляють

цитопатичну дію. Інфіковані клітини зморщуються, стають маленькими, кругли-

ми, в їх ядрах виникає пікноз. Пізніше клітини повністю руйнуються і відпадають

від стінки флакона. Такі зміни викликає вірус поліомієліту, більшість серотипів

вірусів Коксакі В, ЕСНО, деякі серотипи вірусів Коксакі А. В клітинах амніону

людини, епітелію нирок, диплоїдних клітинах W1-38 та RD добре репродукують-

ся віруси Коксакі А та окремі серотипи вірусів ЕСНО.

Віруси Коксакі А і В успішно виділяють із досліджуваного матеріалу шля-

хом зараження одноденних мишей-сисунців у мозок (0,01 мл), під шкіру (0,03 мл)

або в черевну порожнину (0,05 мл). За інфікованими мишами ведуть спостере-

ження протягом 14 днів. При наявності в матеріалі вірусів Коксакі А на 2-5 день у

тварин появляються збудження, тремор, парези і паралічі м’язів спини і кінцівок.

При Коксакі В-інфекції на 4-9 день у новонароджених мишей виникають спас-

тичні паралічі. З тканин і органів тварин, що загинули, готують вірусвмістку сус-

пензію для подальших досліджень. При гістологічному дослідженні виявляють

дегенератині зміни в ЦНС, печінці, підшлунковій залозі та міокарді.

Індикацію ентеровірусів проводять також за цитопатичною дією в культурі

клітин або за бляшкоутворенням під агаровим чи бентонітовим покриттям, а та-

кож за розвитком паралічу і загибеллю тварин.

Для їх ідентифікації використовують імуноферментний аналіз, реакцію галь-

мування гемаглютинації, імунофлуоресценції та РЗК. Реакцію нейтралізації на

моделі клітин проводять як вище описано.

Необхідно враховувати, що при масовій імунізації дітей живою поліомієліт-

ною вакциною можливе виділення вакцинних штамів. Отже, необхідно встанов-

лювати походження виділених вірусів.

Виявлення ентеровірусів і визначення видів та серотипів найефективніше і

найшвидше можна провести за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.

Серологічні дослідження. Методом парних сироваток ставлять кольорову

пробу, реакцію нейтралізації з пригніченням цитопатичної дії, бляшкоутворення,

РЗК, РНГА з еритроцитарними діагностикумами. Кольорову реакцію раніше час-

то ставили при серологічній діагностиці поліомієліту. Вона базується на здатності

вірусу пригнічувати обмінні процеси в інфікованих культурах клітин в результаті

чого зберігається вихідний колір середовища (малиновий).

Антитіла сироватки крові хворих нейтралізують вірус і метаболізм клітин

продовжується. Це призводить до нагромадження кислих продуктів у системі, які

змінюють РН середовища і воно набуває жовтого кольору. Наводимо схему поста-

новки кольорової реакції при серологічній діагностиці поліомієліту (табл. 73).

Результати реакції враховують візуально на 5-7 добу шляхом порівняння ко-

льору середовища в дослідних і контрольних пробірках. Титром сироватки вва-