Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник

Подождите немного. Документ загружается.

351

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Пробірки

Компоненти

1 2 3 4 5 6 7

Живильне середовище, мл 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5

Сироватка хворого 1:5, мл:

І (1-ий ряд) 0, 5

→

↓

– 0, 5

ІІ (2-ий ряд) 0, 5

→ → → ↓

– 0, 5

Розведення сироваток 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 – –

Поліовірус певного типу,

100 ЦПД

/мл

0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 –

Інкубування 30 хв при 18-20 °С

Завись клітин HeLa з

індикатором, 40000 кл/мл

0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5 0, 5

Інкубування 5-7 діб при 37 °С

Результати:

перша сироватка

друга сироватка

жають її найбільше розведення, при якому відбулась нейтралізація вірусу (остан-

ня пробірка з культурою клітин, де середовище жовтого кольору). Діагностичне

значення має наростання титру антитіл у другій сироватці не менше, ніж у 4 рази

в порівнянні з першою сироваткою.

Експрес-методи лабораторної діагностики ентеровірусних інфекцій не знай-

шли широкого застосування із-за особливостей їх патогенезу. Можливе викорис-

тання реакції непрямої гемаглютинації з еритроцитарним поліовірусним діагнос-

тикумом та непрямої реакції імунофлуоресценції. Для постановки останньої

використовують імунну діагностичну антивидову сироватку, виснажену гомоло-

гічними клітинами крові, амніону, фібробластами. Така сироватка реагує лише з

вірусним антигеном, що знаходиться всередині клітин досліджуваного матеріалу.

Останнім часом для експрес-діагностики використовують каріологічний

аналіз, оснований на виявленні характерних змін в структурі ядер клітин клінічного

матеріалу, взятого у перші дні захворювання. Мікроскопують мазки з осаду після

центрифугування змивів з носоглотки і сечі та мазки-відбитки з органів, які взяті

при автопсії. Їх фіксують у холодному ацетоні, забарвлюють гематоксиліном. Спе-

цифічним для ентеровірусних інфекцій є виявлення в препаратах зміщення хро-

матину до периферії ядра і утворення яскраво-фіолетових тілець, що нагадують

півмісяць. Це дає змогу дати попередню відповідь про репродукцію ентеровірусів

у досліджуваному матеріалі.

Диференціацію даних та атенуйованих поліовірусних штамів здійснюють за

допомогою ПЛР, ІФА, РН з моноклональними антитілами. Для поліовірусів І типу

використовується бентонітовий тест (вірулентні поліовіруси мають характерис-

тики А

бент

–, а авірулентні – А

бент

+).

Таблиця 73

Схема титрування антитіл за допомогою кольорової проби

352

Частина ІV. Вірусологія

Ротавірусні гастроентерити

У високорозвинених країнах понад 60 % гострих гастроентеритів виклика-

ють віруси з родини Reoviridae. Серед них домінують ротавіруси. Рід Rotavirus

включає ротавіруси людини і віруси, що викликають діареї у тварин. Останні для

людини непатогенні. Ротавіруси людини викликають, в основному, гастроентери-

ти у дітей до трьох років і людей похилого віку. Збудник передається фекально-

оральним способом при побутових контактах. Висока стійкість вірусів у зовніш-

ньому середовищі сприяє розвитку спалахів гастроентеритів особливо в зимовий

період (до 90 %). За білковими антигенами ротавіруси поділяють на 4 сероваріанти.

Матеріалом для лабораторної діагностики служать випорожнення і кров.

Проби калу беруть у перші години і дні хвороби у стерильні пеніцилінові флакони

і направляють до вірусологічної лабораторії в контейнерах із льодом. Готують 10-

20 % суспензію в розчині Хенкса, центрифугують 30 хв при 3000 об/хв. Центри-

фугат переносять у стерильний флакон, додають фреон 113 або 1000 ОД/мл пені-

циліну і 500 ОД/мл стрептоміцину, вміщують у холодильник на 10-12 год. Кров

для серологічних реакцій беруть у перші 2-3 дні хвороби і через 12-14 днів.

Лабораторна діагностика ротавірусних діарей ґрунтується на швидкому

виявленні вірусів у випорожненнях за допомогою електронної та імунної елект-

ронної мікроскопії, реакції непрямої гемаглютинації з антитільним еритроцитар-

ним ротавірусним діагностикумом. Використовують також імуноферментний

аналіз у твердофазному варіанті, реакцію коаглютинації, метод клонованих РНК-

зондів і полімеразну ланцюгову реакцію.

У перші дні хвороби вміст ротавірусів у копроматеріалах досягає 10

-10

1 г, тому їх виявлення при прямій електронній мікроскопії можливе без додатко-

вої концентрації. Краплю досліджуваного матеріалу наносять на спеціальні плівки

з нітроцелюлози і мікроскопують при збільшенні 50000.

Метод чутливий і надійний, дає змогу швидко виявити вірус і дослідити його

морфологію. При виявленні 5-6 віріонів практично у кожному полі зору можна

достовірно підтвердити діагноз ротавірусного гастроентериту.

Ще більше діагностичне значення має метод імуное-

лектронної мікроскопії. Принцип її полягає в тому, що імун-

ну противірусну сироватку додають до освітленої низько-

швидкісним центрифугуванням суспензії фекалій, витри-

мують 60 хв при кімнатній температурі і ще 12 год при 4°С,

потім центрифугують при 15000 об/хв для осадження вірус-

них частинок та імунних комплексів. Осад ресуспензують

у 2-3 краплях дистильованої води, контрастують у фосфор-

но-вольфрамовій кислоті і досліджують під електронним

мікроскопом. У препаратах виявляють характерні скупчен-

ня ротавірусів (рис. 89). Висока ефективність методу прак-

тично не залежить від вихідної концентрації вірусів у дослі-

джуваних пробах.

Рис. 89. Ротавіруси

у фекаліях хворого.

353

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Вірусологічні дослідження з метою виділення ротавірусів у культурах клітин

або на лабораторних тваринах у рутинних вірусологічних лабораторіях не проводять.

Найбільш широко в діагностиці ротавірусних гастроентеритів використову-

ють імуноферментний аналіз. Принцип його полягає в тому, що лунки полістиро-

лових планшет спочатку сенсибілізують антитілами проти ротавірусів, а потім

додають у них освітлену суспензію фекалій, інкубують 1 год в термостаті. Утво-

рений в лунках комплекс антиген-антитіло після трикратного промивання фос-

фатним буфером виявляють внесенням антиглобулінової сироватки, кон’югова-

ної з ферментом. Після інкубації в термостаті додають хромогенний субстрат до

появи забарвленого продукту реакції. Облік результатів проводять за допомогою

імуноферментного аналізатора.

У невеликих лабораторіях досить часто проводять реакцію оберненої непря-

мої гемаглютинації з використанням антитільного ротавірусного еритроцитарно-

го діагностикуму. Вона проста за методикою постановки, хоч і менш чутлива в

порівнянні з реакцією ензиммічених антитіл.

У практику лабораторної діагностики ротавірусних інфекцій впроваджують

також тест коаглютинації для індикації ротавірусного антигену у випорожненнях

хворих. На предметне скло наносять краплю зависі стафілококів (штам Cowan 1),

сенсибілізованих ротавірусною сироваткою, і додають краплю освітленого цент-

рифугуванням копроматеріалу. При наявності ротавірусів через 30-60 с виникає

аглютинація навантажених антитілами стафілококів.

Дуже чутливим способом швидкої діагностики ротавірусних гастроентеритів

є метод виявлення вірусоспецифічної РНК за допомогою молекулярної гібриди-

зації. Він заснований на гібридизації мічених РНК-зондів, фіксованих на нітроце-

люльозних фільтрах. Мічення здійснюють біотином або ферментом, що значно

спрощує і здешевлює метод у порівнянні з радіоізотопними мітками.

Аналіз ротавірусної РНК, не зважаючи на його дорожнечу, все ширше впро-

ваджується в практику, особливо після розробки методу полімеразної ланцюгової

реакції. Остання є найчутливішим і специфічним методом діагностики, який, бе-

зумовно, є діагностичним тестом нового покоління, так званим “золотим стандар-

том”. Однак постановка цієї реакції все ще вимагає високої кваліфікації дослід-

ника, дорогих реактивів і складної апаратури.

Серологічна діагностика спрямована на виявлення специфічних антитіл у

парних сироватках, взятих з двотижневим інтервалом. Для цієї мети використову-

ють різноманітні нейтралізаційні або преципітаційні тести та непряму реакцію

імунофлуоресценції. Але останнім часом найширше застосовують імунофермен-

тний аналіз.

Раніше для серодіагностики широко ставили РЗК з використанням в якості

антигену заздалегідь відібрані фекалії хворих на гастроентерит або ротавіруси

телят. Але за своєю чутливістю і специфічністю вона значно поступається методу

імуноферментного аналізу. Для виявлення специфічних антитіл до ротавірусів

ставлять також реакцію гальмування непрямої гемаглютинації з парними си-

роватками.

354

Частина ІV. Вірусологія

Гастроентерити у дітей можуть також викликати каліцівіруси, астровіруси і

віруси Норволк. Всі вони виділяються з випорожненнями в перші 2-3 дні захво-

рювання, не розмножуються в культурах клітин або слабко репродукуються без

цитопатичної дії. Для лабораторної діагностики гастроенетеритів, викликаних

даними вірусами, використовують, в основному, метод імунної електронної мікро-

скопії. Інших методів діагностики, доступних для вірусологічних лабораторій, поки

що немає.

Герпесвірусні інфекції

Віруси родини Herpesviridae поділяються на три підродини: Alphaherpesvirinae

(викликають простий оперізуючий герпес та вітряну віспу), Betaherpesvirinae (спри-

чиняє цитомегалію), Gammaherpesvirinae (асоціюється з лімфомою Беркітта, на-

зофарінгеальною карциномою). Всього в родині нараховують біля 50 вірусів.

Простий герпес

Захворювання має декілька клінічних форм, але найчастіше вірус персистує

в організмі, і хвороба має безсимптомний перебіг. Звичайні клінічні прояви – ве-

зикулярна висипка на шкірі і слизових оболонках, рідко виникає менінгоенце-

фаліт, кератит і генералізована форма у новонароджених. Вірус герпесу 1-го типу

проникає в організм ще в ранньому дитинстві й постійно персистує у 70-90 %

дорослих людей. Передається контактним шляхом через слину, посуд, побутові

речі. Вірус 2-го типу передається статевим шляхом і викликає генітальний герпес.

Лабораторна діагностика включає проведення вірусоскопічних, прискоре-

них, вірусологічних і серологічних методів. Залежно від клінічних проявів матер-

іалом для дослідження служать слина, вміст пухирців, кірочки, ліквор, мазки з

виразок на слизовій оболонці рота, статевих органів, рогівки; при автопсії – шма-

точки головного і спинного мозку та паренхіматозних органів. Взятий матеріал

найкраще зберігати в 10 % сироватці при температурі – 70 °С.

Мікроскопія. Зскрібки, мазки, пухирцевий вміст після негайної фіксації в

суміші Никифорова забарвлюють за методом Романовського-Гімзи і досліджують

під імерсійним об’єктивом на наявність гігантських багатоядерних клітин з ха-

рактерними внутрішньоядерними включеннями (тільця Каудрі).

Для експрес-діагностики використовують електронну мікроскопію, реакцію

імунофлуоресценції, імуноферментний аналіз, генетичну діагностику. Під елект-

ронним мікроскопом досліджують вміст пухирців, рідку фракцію кірок після їх

гомогенізації в дистильованій воді, змиви з елементів висипу. Виявлення 2-3

віріонів з типовою морфологією цілком достатньо для встановлення діагнозу

(рис. 90). Швидке виявлення герпетичного антигену можливе в реакції імунофлуо-

ресценції. Мазки з пухирцевої рідини, виразок на рогівці або осаду з ліквору фіксу-

ють і обробляють протигерпетичною флуоресцентною сироваткою. Антиген зна-

ходять у цитоплазмі та ядрах уражених клітин за характерним золотаво-зеленим

355

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

світінням. Вірусспецифічний антиген у досліджува-

ному матеріалі легко виявляють за допомогою іму-

ноферментного аналізу, чутливість і специфічність

якого може сягати 95-96 %.

Виділення герпесвірусів. Ізоляцію вірусів про-

водять шляхом інокуляції досліджуваного матеріа-

лу в культури клітин ниркового епітелію кроля, ку-

рячого ембріона, амніона людини, HeLa та ін., або

зараженням мишей-сисунців, хом’ячків, кроликів,

курячих ембріонів.

Репродукція вірусів у культурах клітин настає

через 4-7 днів. Вона супроводжується розвитком

цитопатичних змін, утворенням гігантських багато-

ядерних клітин та синцитію.

У мишей виникають паралічі і смерть, у кроликів через 2-5 днів спостеріга-

ють кератит, у хом’ячків захворювання закінчується летально. На хоріоналантоїсній

оболонці курячих ембріонів через 48 годин з’являються опуклі непрозорі бляшки.

Виділені штами вірусів ідентифікують за допомогою стандартних протигер-

петичних сироваток у тестах нейтралізації на культурах клітин, лабораторних тва-

ринах або курячих ембріонах.

Серологічну діагностику проводять шляхом постановки реакції непрямої

гемаглютинації, імунофлуоресценції та імуноферментного аналізу обов’язково

методом парних сироваток. Діагностичне значення має наростання титру антитіл

у 4 рази і більше. Серологічна діагностика простого герпесу значною мірою утруд-

нена із-за широкої циркуляції вірусів серед населення і наявністю спільних анти-

генів у 1-го і 2-го сероваріантів герпетичних вірусів. При первинному захворю-

ванні на простий герпес певне діагностичне значення має постановка РЗК для

виявлення комплементзв’язуючих антитіл. Особливо важливе значення при цьому

набуває визначення Іg M.

Вітряна віспа – оперізуючий герпес

Збудник вітряної віспи й оперізуючого герпесу належить до роду Varicellovirus

і є двома варіантами одного і того самого вірусу. За морфологічними, біологічни-

ми властивостями вони ідентичні до вірусів простого герпесу, але не репродуку-

ються в організмі лабораторних тварин. Той самий вірус у дітей до 10 років ви-

кликає вітряну віспу – сильнозаразне, але легке захворювання. У дорослих (і дуже

рідко у дітей) він викликає оперізуючий герпес (герпес зостер). Розпізнавання цих

захворювань, як правило, проводять на основі характерних клінічних симптомів

та епідеміологічних даних. Значно рідше використовують вірусологічні або серо-

логічні дослідження.

Лабораторна діагностика. Найбільш цінним матеріалом для виділення

вірусів є вміст пухирців (везикул). Забирають також зскрібки з папул, кірочки,

Рис. 90. Вірус герпесу.

356

Частина ІV. Вірусологія

виділення з носоглотки, кров для постановки серологічних реакцій. Лабораторні

дослідження проводять так само, як і при простому герпесі, але необхідно врахо-

вувати, що віруси вітряної віспи і оперізуючого герпесу не вражають клітин куря-

чого ембріону, нервових клітин мишей, рогівки кролів. У культурах клітин вони

розвиваються значно повільніше (3-5 днів) у порівнянні з вірусом простого герпе-

су (18-24 год).

Експрес-методи базуються на виявлені вірусспецифічних антигенів у мазках

і відбитках за допомогою реакції непрямої імунофлуоресценції. Використовують

антивидову сироватку проти імуноглобулінів людини, мічену ФІТЦ. Специфічне

світіння проявляється в цитоплазмі і ядрах уражених клітин. Герпесвірусні анти-

гени можна виявити і за допомогою імунодифузії в гелі з відповідними преципі-

туючими сироватками. При наявності діагностичних тест-систем і відповідної

апаратури можна використати полімеразну ланцюгову реакцію.

Виділення вірусів проводять на первинних і перещеплюваних культурах

клітин щитоподібної залози людини, фібробластів, ниркового епітелію, амніона

людини тощо. Цитопатична дія носить острівковий характер, розвивається по-

вільно і супроводжується утворенням багатоядерних клітин з характерними вклю-

ченнями.

Ідентифікацію виділених вірусів проводять в реакціях нейтралізації, зв’язу-

вання комплементу і непрямої імунофлуоресценції.

Серологічна діагностика проводиться на основі постановки реакції зв’язу-

вання комплементу, нейтралізації, непрямої імунофлуоресценції з парними сиро-

ватками хворих. Необхідною умовою для постановки діагнозу є 4-кратне збільшен-

ня титру антитіл. Останнім часом для серологічної діагностики частіше викорис-

товують імуноферментний аналіз.

Цитомегалія

Цитомегаловірус подібний до інших видів герпесвірусів, але відрізняється

більш тривалою репродукцією всередині клітини. Він викликає захворювання,

що характеризується ураженням слинних залоз та інших органів з утворенням в їх

тканинах гігантських клітин з крупними внутрішньоядерними включеннями.

Діагноз цитомегалії встановлюють на основі проведення цитологічних,

вірусологічних і серологічних досліджень. Матеріалом для дослідження служать

слина, осад сечі, ліквор, пунктати лімфатичних вузлів, печінки, а також лейкоци-

ти крові. Найхарактерніша ознака цитомегалії – поява гігантських клітин з ядер-

ними включеннями розміром від 8 до 20 мкм.

Виділення вірусів проводять шляхом інокуляції досліджуваного матеріалу в

первинну культуру фібробластів шкіри та легеневих клітин ембріона людини.

Цитопатична дія виявляється через 2-3 тижні особливо у вторинних і третинних

субкультурах у вигляді появи гігантських клітин, що мають внутрішньоядерні

включення. При генералізованій формі хвороби цитомегаловірус проникає в лей-

коцити крові, тому для його виділення краще брати лейкоцитарні культури клітин.

357

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Ідентифікацію виділених вірусів, а також їх антигенні варіанти визначають у

реакції нейтралізації з відповідними антисироватками. Титр вірусу встановлю-

ють за допомогою бляшкоутворення або підрахунків фокусів уражених клітин

методом імунофлуоресценції.

Серологічна діагностика. Для визначення титру сироваткових антитіл на

початку захворювання і в період реконвалесценції використовують реакції зв’язу-

вання комплементу і нейтралізації цитопатичної дії вірусу або феномену бляшко-

утворення. Метод флуоресцуючих антитіл застосовують як для визначення 4-крат-

ного наростання титру антитіл, так і для виявлення концентрації lg M. Для серо-

логічної діагностики цитомегаловірусної інфекції більшість лабораторій починає

широко застосовувати імуноферментний аналіз.

Аденовірусні інфекції

Родина Adenoviridae поділяється на два роди: Mastadenovirus – аденовіруси

ссавців, у тому числі понад 40 сероваріантів, що викликають захворювання у лю-

дей, і Aviadenovirus – 14 сероваріантів, що спричиняють захворювання у птахів.

Окремі серотипи (12, 18, 31) мають онкогенні властивості для деяких видів гри-

зунів (сирійські хом’ячки). По відношенню до людини онкогенні властивості аде-

новірусів не проявляються.

Аденовірусні інфекції виникають переважно у дітей від 6 місяців до 5 років,

особливо у холодні пори року. Для них характерний розвиток респіраторного,

кон’юнктивального і кишечного синдромів. Найчастіше виникають тонзиліти, фа-

рингіти, бронхіти, атипові пневмонії, риніти, катаральні і плівчасті кон’юнктиві-

ти. Основні механізми зараження – повітряно-краплинний, контактно-побутовий,

рідше – фекально-оральний.

Лабораторна діагностика. Більшість клінічних симптомів при аденовірус-

них інфекціях подібні до інших респіраторних захворювань як вірусної, так і бак-

теріальної етіології. У зв’язку з цим методи лабораторної діагностики мають ви-

нятково велике значення.

Залежно від клінічних проявів захворювання матеріалом для дослідження

служать мазки і змиви з носоглотки, харкотиння, зіскрібки з кон’юнктиви, кров,

ліквор, випорожнення. Матеріал потрібно взяти у перший тиждень хвороби, пе-

ресилати і зберігати у замороженому стані. Досліджують і секційний матеріал –

шматочки трахеї, бронхів, легень, кишечника, лімфовузлів.

Експрес-діагностику здійснюють за допомогою реакцій імунофлуоресценції

та ензиммічених антитіл з метою індикації групових антигенів аденовірусів у епіте-

ліальних клітинах носоглотки та кон’юнктиви. При цьому виявляють характерні

дрібнозернисті включення зелено-жовтого кольору в центральній частині ядер.

Кишкові аденовіруси, що викликають гастроентерити, виявляють у випорож-

неннях хворих за допомогою прямої та імунної електронної мікроскопії (рис. 91),

імуноферментного аналізу, ДНК-зондів і полімеразної ланцюгової реакції.

358

Частина ІV. Вірусологія

Виділення вірусів проводять на первинно-

трипсинізованих і перещеплюваних культурах

клітин (Hela, HЕp-2, KB та ін.), які чутливі до всіх

сероваріантів аденовірусів. У звичайних умовах

курячі ембріони і лабораторні тварини практич-

но нечутливі до аденовірусів людини, тому біо-

логічну модель виділення вірусів для діагности-

ки не використовують.

У культурах клітин віруси виявляють за їх

цитопатичною дією під світловим мікроскопом.

Уражені клітини округлюються, скупчуються у вигляді грон, в їх цитоплазмі вини-

кає зернистість. Більш точним методом виявлення цитопатичної дії є досліджен-

ня за допомогою люмінесцентного мікроскопа специфічних внутрішньоядерних

включень у клітинах на покривних скельцях, забарвлених акридиновим оранжевим.

Цей метод дозволяє через 1-2 доби виявити навіть поодинокі інфіковані клітини.

Ідентифікацію та типування виділених аденовірусів проводять за допомогою

реакції нейтралізації в культурах клітин спочатку із сумішшю типоспецифічних

сироваток, а потім і з кожною сироваткою тієї суміші, яка нейтралізувала цитопа-

тичну дію. Останнім часом для типування аденовірусів широко застосовують ре-

акцію гальмування гемаглютинації.

За здатністю аглютинувати еритроцити мавп і білих щурів аденовіруси поді-

лили на 3 групи. До першої групи увійшли 9 сероваріантів (3, 7, 11, 14, 16, 20, 21,

25, 28), які аглютинують лише еритроцити мавп, до другої – 14 сероваріантів (8, 9,

10, 13, 15, 17, 19, 22, 23, 24, 26, 27, 29, 30), що викликають повну аглютинацію

еритроцитів щурів, до третьої – 6 сероварів (1, 2, 4, 5, 6, 12), здатних лише частко-

во аглютинувати еритроцити щурів. Спочатку за допомогою тесту гемаглютинації

виділений аденовірус відносять до однієї з трьох груп, а потім в реакції гальму-

вання гемаглютинації з типоспецифічними сироватками визначають серотип.

Серологічна діагностика аденовірусних інфекцій проводиться методом пар-

них сироваток за допомогою РЗК та імуноферментного аналізу з будь-яким типом

вірусів. Другу сироватку беруть на 18-20-й день захворювання. Діагностичне зна-

чення має наростання антитіл в 4 рази і більше. При оцінці результатів реакцій

потрібно враховувати можливість наявності антитіл в результаті широкої цирку-

ляції аденовірусів серед людей. У сироватці крові, взятій у перші дні захворюван-

ня, титр РЗК з аденовірусним антигеном складає 1:16. Особливо важливе значен-

ня має раннє виявлення в сироватці хворих IgM, що свідчить про гострий перебіг

хвороби. Тепер це найчастіше проводять за допомогою імуноферментного аналізу.

Коронавірусні інфекції

До родини Coronaviridaе входить 13 видів вірусів, два з яких – респіраторний

і ентеральний коронавіруси людини – мають високу вірулентність і здатні викли-

кати захворювання.

Рис. 91. Аденовіруси.

359

Розділ 13. Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

Коронавіруси є дуже частими збудниками респіраторних захворювань у до-

рослих: профузного риніту, ринофарингіту, часто навіть без підвищення темпера-

тури. У дітей основними симптомами є профузний нежить, кашель, гарячка, го-

ловний біль. Часто хвороба ускладнюється пневмонією. Клінічно коронавірусну

інфекцію важко відрізнити від інших захворювань респіраторного тракту, тому

лабораторні дослідження мають вирішальне значення.

Лабораторна діагностика. Матеріалом для дослідження служить слиз із носа

і глотки, зібраний сухими ватними тампонами, які занурюють в ізотонічний роз-

чин хлориду натрію з антибіотиками. Секційний матеріал (шматочки трахеї,

бронхів, легень) збирають у фосфатний буфер з гліцерином. У разі виникнення

гастроентериту досліджують випорожнення. Для серологічних реакцій викорис-

товують парні сироватки крові.

Експрес-методи діагностики проводять за допомогою реакції імунофлуо-

ресценції. У цитоплазмі епітеліальних клітин із осаду змивів з носоглотки, оброб-

лених люмінесцентними антисироватками, виявляють специфічні включення. При

можливості використовують пряму та імунну електронну мікроскопію, за допо-

могою яких виявляють поодинокі віріони або їх скупчення з типовою для корона-

вірусів морфологією (віруси зовні покриті виступами грушоподібної форми, що

нагадують корону сонця під час його затемнення). У препаратах з випорожнень

коронавіруси знаходять за допомогою електронної мікроскопії та полімеразної

ланцюгової реакції (рис. 92).

Виділення вірусів з діагностичною метою

проводять дуже рідко, оскільки коронавіруси лю-

дини практично не репродукуються в курячих

ембріонах і перещеплюваних культурах клітин.

Найбільш чутливою системою для їх виділення є

органна культура клітин трахеї ембріона людини.

У пробірки з культурою вносять 0,1-0,2 мл дослі-

джуваного матеріалу, обробленого антибіотиками.

Рідко ставлять біологічну пробу на мишах-сисун-

цях. При інтрацеребральному зараженні у тварин

виникає енцефаліт, від якого вони гинуть. У до-

рослих мишей коронавіруси спричиняють безсимп-

томну інфекцію.

Ідентифікують віруси шляхом визначення в інфікованих клітинах коронаві-

русного антигену методом імунофлуоресценції, імуноферментного аналізу або РЗК.

Можна виявити типові за морфологією віріони і при електронній мікроскопії.

Серологічна діагностика коронавірусних інфекцій до сьогодні залишається

основним методом їх розпізнавання. Для цього використовують визначення при-

росту антитіл у парних сироватках за допомогою реакцій гальмування гемаглю-

тинації, зв’язування комплементу та імуноферментного аналізу.

Рис. 92. Коронавіруси.

360

Частина ІV. Вірусологія

Сказ

Вірус сказу належить до роду Lyssavirus родини Rhabdoviridae, має характер-

ну кулеподібну форму з одним плоским і другим заокругленим кінцем (рис. 92).

Існують два варіанти вірусу – вуличний (дикий), що циркулює в природі серед

тварин, і атенуйований – Virus fixe, отриманий Л. Пастером шляхом багатократ-

них пасажів через мозок кроликів.

На сказ найчастіше хворіють собаки, вовки, лисиці, шакали, коти, рідше ко-

рови, скунси, койоти, кажани. Заражен-

ня людини відбувається через укуси хво-

рих тварин і навіть при ослиненні ними

подряпин шкіри чи слизових оболонок.

Захворювання у людини завжди закін-

чується летально, основні методи діагно-

стики сказу є посмертними, хоч розроб-

лені й деякі прижиттєві тести.

Лабораторна діагностика базується на використанні вірусоскопічного, біо-

логічного і серологічного методів. Матеріалом для дослідження служить мозок

тварин і загиблих людей, слина, тканина слинних залоз, які направляють до лабо-

раторії в стерильному посуді з гліцерином і обкладені льодом.

Метод флуоресцуючих антитіл – найбільш швидкий і точний метод лабо-

раторної діагностики сказу. Для виявлення вірусного антигену в мазках-відбитках

мозку, слинних залоз і рогівки ока (прижиттєвий тест) використовують пряму і

непряму реакцію імунофлуоресценції. Мазки фіксують у холодному ацетоні про-

тягом 8-10 год при температурі 4 °С і обробляють у вологій камері 30 хв антира-

бічним імуноглобуліном, міченим ФІТЦ, промивають фосфатним буфером, вису-

шують і досліджують в люмінесцентному мікроскопі. Антигени вірусу спостері-

гають у вигляді зелених гранул різної форми і величини.

Виявлення тілець Бабеша-Негрі у мазках-відбитках, гістологічних зрізах

мозку і тканини слинних залоз є також швидким методом діагностики сказу. З

мозку загиблої людини чи тварини стерильними ножицями нарізають у попереч-

ному напрямку шматочки товщиною 3-4 мм з довгастого мозку, амонового рогу і

мозочка. Предметне скло притискають до поверхні зрізу щоб отримати відбиток

тканини. В препаратах, забарвлених за Муромцевим або Селлером, тільця мають

різну величину (4-10 мм) округлої або овальної форми пурпурно-червоні, а цито-

плазма і ядра нервових клітин мають синій колір. Гістологічні зрізи забарвлюють

за Романовським-Гімзою, Манном або Туревичем. В одній клітині може бути одне

або декілька тілець. Вони оточені чітко окресленою оболонкою і мають внутріш-

ню структуру у вигляді базофільної зернистості, частіше розташовуються біля ядра

(рис. 93).

Метод виявлення включень Бабеша-Негрі є досить специфічним для сказу,

хоч він і менш чутливий, ніж метод флуоресцуючих антитіл. У тканині мозку со-

бак тільця знаходять у 90-95 % випадків, а в людей, померлих від сказу – в 70 %.

Рис. 92. Вірус сказу.