Каминская Э.А. Общая генетика

Подождите немного. Документ загружается.

возросла частота аномалий сегментов брюшка (Abnormal abdomen).

Через 5 лет эта мутация обнаружилась почти у 15 % особей в попу-

ляциях дрозофилы в разных районах Украины, Кавказа, Средней

Азии, а затем ее уровень начал падать, и в 1973—1978 гг. стала

преобладать мутация singed (опаленные щетинки). Все эти мутации

носили нестабильный характер, так как в потомстве мутантов с

большой частотой происходила реверсия к дикому типу. Причину

таких вспышек мутаций вначале было трудно объяснить. Предпола-

галось, например, что они обусловливаются воздействием инфек-

ционного, точнее вирусного, фактора, поскольку вирус то поселяется

в хромосоме эукариот, то покидает ее. В 60-е годы, после того как

в геноме бактерий были обнаружены подвижные элементы, ряд ис-

следователей высказали предположение, что и у дрозофилы вспышки

мутаций могут быть связаны с перемещением генетического материа-

ла. Они полагали, что этот материал, находясь вблизи или внутри

гена, резко увеличивает частоту его мутаций, а покидая ген, вызы-

вает реверсию к дикому типу. Данное предположение получило

экспериментальное подтверждение несколько позже, когда в

Институте общей генетики АН СССР была выведена линия дрозо-

филы с неустойчивой мутацией cut (изрезанный край крыла): на

каждые 1000 таких мух встречалась одна муха с диким фенотипом

или с новой мутацией. Цитологически было показано, что в локус

cut попадает какой-то генетический элемент, который закрепляется

в нем непрочно и часто меняет локализацию. Причем, когда он

оказывается в этом локусе, возникает мутация cut; когда покидает

его, происходит реверсия к дикому типу; когда же перемещается

на другое место в хромосоме, возникает новая мутация.

В 70-х годах советские и американские исследователи обнару-

жили у дрозофилы группу генов, представленных множественными

копиями, которые были разбросаны по разным участкам хромосом.

Причем одинаковые гены у разных особей локализовались в хромо-

сомах по-разному, особенно у мух разных линий. Оказалось, что

30 % этих генов не имеют постоянной локализации и как бы кочуют

по хромосоме. Они были названы мобильными (прыгающими)

диспергированными элементами или генами (МДГ). В геноме дрозо-

филы выявлено 20 семейств МДГ, содержащих по 10—15 копий.

В каждом из них насчитывается 100—200 прыгающих генов; в целом

в геноме их около 9000, что составляет 5 % всего генетического мате-

риала. От этих элементов зависит характер генной активности и тип

мутаций.

С открытием прыгающих генов разрушились представления о

генном постоянстве и стабильности гена, а также о случайности

мутаций. Современная, так называемая подвижная, генетика

утверждает, что мутации не случайны, зависят от типа МДГ и могут

одновременно возникать у большого числа особей (составляют не-

сколько десятков процентов от числа особей в популяции). Это не

согласуется с представлениями классической генетики, утверж-

дающей, что мутациям подвергаются единичные особи с частотой

примерно 1 : 100 000.

'237

Таким образом, в течение последних 10 лет сформировалось

представление, что в состав генома про- и эукариот входят гены,

имеющие либо стабильную, либо нестабильную локализацию.

К группе генов со стабильной локализацией в геноме относятся

уникальные, а также многократно повторяющиеся последователь-

ности нуклеотидов.

Уникальные последовательности нуклеотидов представлены в

геноме единичным или малым числом копий. К ним относятся струк-

турные и регуляторные гены. Длина их составляет около 900—1000

нуклеотидов и более. В геноме они чередуются с повторами длиной

около 200 нуклеотидов. Уникальные последовательности эукариот,

в отличие от генов прокариот, могут иметь мозаичное строение.

В процессе жизнедеятельности клетки они активно реплицируются

и транскрибируются. Исключение составляет ген-оператор, который

не несет генетической информации и в силу этого не транскриби-

руется.

Многократно повторяющиеся последовательности нуклеотидов

являются копиями, или повторами, уникальных последователь-

ностей. (У прокариот они не встречаются.) Копии обычно группиру-

ются по несколько десятков или сотен и образуют блоки, локализую-

щиеся в определенном месте хромосомы. Повторы реплицируются, но,

как правило, не транскрибируются. Некоторые авторы приписывают

им роль регуляторов генной активности. Другие предполагают,

что наличие множественных дубликатов уникальных последо-

вательностей служат защитным механизмом от точковых му-

таций. Высказывается также мнение, что один из повторов может

нести ответственность за хранение и передачу наследственной инфор-

мации. Большинство же авторов считают, что повторы как результат

дупликации генов являются механизмом эволюции, подтверждая

это тем фактом, что обнаруживается корреляция между большой

продолжительностью жизни и высоким содержанием повторов в

ДНК.

К группе генов с нестабильной локализацией относятся также

многократно повторяющиеся последовательности, но не сгруппиро-

ванные, а рассеянные по геному и локализующиеся в разных хро-

мосомах. Локализация их может изменяться у особей одной линии

и даже у одной особи в пределах пары хромосом. Эти гены как бы

прыгают с места на место. Установлено, что явление перемещения,

или транспозиции, генов довольно широко распространено. Однако

механизм его и функция прыгающих генов пока еще полностью не

выяснены. Возможно, транспозиция генов играет важную роль в

эволюции генетического аппарата, а также в регуляции действий

генов, в том числе и в процессе дифференцировки клеток. Очевидно,

в этих перемещениях кроются причины индивидуальных различий

между организмами.

В настоящее время выделены 4 основные группы перемещающих-

ся элементов: инсерционные сегменты, транспозоны, эписомы и

умеренные фаги.

Инсерционные сегменты, или IS (от англ. Insertion sequence —

'238

Рис. 130. Инвертированные последова-

тельности элемента IS1 (один из воз-

можных вариантов дуплексов, образуе-

мых концами одной нити ДНК IS1);

точка соединения — граница с ДНК-ми-

шенью (место встраивания IS1).

последовательные вставки),

представляют собой дополни-

тельные фрагменты ДНК, отли-

чающиеся друг от друга и со-

стоящие из 500—1400 пар азо-

тистых оснований. У прокариот

выделено 7/5. Инсерционные

сегменты содержат только гены,

необходимые для транспозиции

(например, ген, контролирую-

щий синтез фермента транспоа-

зы). Некоторые IS имеют про-

моторные и терминаторные

участки. Каждый инсерционный

сегмент обладает короткими

(от 15 до 25 нуклеотидных пар)

инвертированными концевыми

повторами (ККП), необходи-

мыми для транспозиции (рис.

130). Предполагается, что ин-

серционные сегменты являются

нормальными компонентами

бактериальных хромосом

(Е. coli, S. typhimurium, С.

freundii), плазмид (F и R) и

умеренных фагов (X). В хромо-

соме Е. coli, например, содержится 8 копий IS\ и 5 копий IS2.

Инсерционные сегменты перемещаются в геноме из одного места

в другое и одновременно реплицируются, но при этом не переходят

в свободное автономное состояние (рис. 131). Причем последова-

тельность ДНК хромосомы в месте внедрения /S-элемента дуплици-

руется. Инсерционные сегменты, встраиваясь в геном и исклю-

чаясь из него в различных местах, вызывают целый ряд генетических

эффектов.

Прежде всего IS могут оказывать влияние на экспрессию соседних

генов — инактивировать, или, напротив, усиливать их функцию. Эта

способность зависит от ориентации промоторного участка IS по

отношению к направлению транскрипции структурных генов. Инсер-

ционный сегмент, включаясь в тот или иной оперон, резко снижает

скорость транскрипции генов, если ее направление не совпадает с

направлением транскрипции /5, и, наоборот, повышает ее, если

направления транскрипции генов и IS совпадают (рис. 132).

'239

Кроме того, /S, встраиваясь вблизи или внутри гена, могут в

значительной степени усиливать его мутабильность. В некоторых

случаях эксцизия инсерционного сегмента может вызвать разрыв

хромосомы, что приводит к крупной хромосомной перестройке

(например, делеции). При этом сам сегмент нередко остается на

прежнем месте и продолжает вызывать новые делеции.

Под влиянием IS могут возникать и дупликации. Например,

обнаружены дупликации /5

, включенного в галактозный оперон

кишечной палочки.

Транспозоны (Тп-элементы), или прыгающие гены, содержат,

кроме последовательностей, ответственных за транспозицию, струк-

турные гены, не связанные с этим процессом (например, гены

устойчивости к антибиотикам, ионам тяжелых металлов и др.).

К структурным генам с обеих сторон присоединяются длинные кон-

'240

цевые повторы (ДКП) с одинаковой (чаще) или инвертированной

ориентацией. Иногда на концах Тп располагаются идентичные инсер-

ционные сегменты, как, например, в Тп9 Е. coli:

Нередко в транспозон встраивается еще один IS (/S3), и тогда

функциональная активность структурного гена транспозона пол-

ностью подавляется. Если через какое-то время IS3 вырезается из

него, активность структурного гена восстанавливается.

Элементы, подобные Тп, найдены и у эукариот (у грибов,

у ряда растений, у дрозофилы, млекопитающих и др.). У дрожжей,

например, таковым является Ту\ -элемент, содержащий структурный

ген длиной 5700 пар азотистых оснований; у дрозофилы — несколько

типов МДГ. Прыгающие гены у эукариот обычно состоят из 5000—

10 000 нуклеотидных пар, из которых по 300—600 пар приходится на

ДКП и по 20—30 пар нуклеотидов — на ККП.

Транспозоны, как и IS, могут встраиваться в любое место бак-

териальной хромосомы или плазмиды с помощью фермента транс-

поазы. Если в транспозоне возникает делеция, синтез транспоазы

нарушается и Тп теряет способность к перемещению. Саму возмож-

ность транспозиции исключает также потеря концевых повторов.

Механизм перемещения транспозонов наиболее детально изучен

у бактерий. Установлено, что транспозоны у них способны самостоя-

тельно перескакивать из плазмиды в хромосому и обратно (рис. 133)

и тем самым обеспечивать наследственную устойчивость бактерий к

антибиотикам и другим вредным факторам. С помощью плазмид

77?-элементы очень быстро распространяются в природе, что не всегда

желательно, поскольку выработка устойчивых к антибиотикам

штаммов бактерий может осложнить борьбу с инфекцией, особенно в

больничных условиях.

Транспозоны способны также вызывать мутации генов, распола-

гающихся вблизи места их встраивания. Возможно, большая часть

спонтанных мутаций, распространенных в природных популяциях,

является результатом внедрения в гены подвижных элементов, в том

числе и Тп.

Механизм транспозиции у эукариот не выяснен. Не установлена

и роль самой транспозиции. Предполагается, что с ее помощью про-

исходит сближение прежде разобщенных генов, контролирующих

синтез какой-то одной белковой молекулы. Существует также мнение,

что инсерции и транспозиции генов у эукариот играют определенную

роль в онтогенезе.

Транспозиция МДГ происходит ненаправленно и довольно ред-

ко,— с частотой один раз на сотни тысяч всех событий в жизни клет-

'241

Рис. 133. Механизм транспозиции в бак-

териальную плазмиду и получение плаз-

мид с транспозоном.

ки. Однако при определенных

условиях ее частота может рез-

ко возрастать и тем самым об-

условливать интенсивное воз-

растание частоты мутаций в по-

пуляциях, так называемый

транспозиционный взрыв. В ре-

зультате таких взрывов у боль-

шого числа особей одновремен-

но могут происходить скачко-

образные изменения генети-

ческого аппарата, которые ста-

новятся материалом для эволю-

ционного процесса. Они об-

условлены встраиванием МДГ в

кодирующую часть гена и изменением вследствие этого записи

наследственной информации. Иногда МДГ не затрагивают кодирую-

щую последовательность гена, и тогда ген сохраняет свою функцию,

но свойства его при этом частично могут изменяться. Если МДГ

встраиваются вблизи какого-либо гена, интенсивность его работы

может измениться в сторону либо усиления транскрипции, либо ее

репрессии.

Эписомы — сложные плазмиды, способные к самостоятельной

репликации и к интеграции в хромосому. Они, как правило, содержат

/5-элементы и транспозоны или только транспозоны и благодаря им

могут перемещаться и встраиваться в хромосому. Эписомы, отно-

сящиеся к конъюгативным плазмидам, легко перемещаются также

из одной бактериальной клетки в другую. Они обнаружены в ядрах

и митохондриях и эукариотических клеток, в частности у дрожжей.

Поэтому можно считать, что такая группа перемещающихся элемен-

тов, как эписомы, свойственна и про-, и эукариотам.

Умеренные фаги, как уже отмечалось (см. гл. 1), тоже способны

к перемещению: нуклеиновая кислота при их переходе в вирулентное

состояние вырезается из хромосомы клетки, реплицируется и

участвует в построении новых фаговых частиц. Последние затем

включаются в хромосомы других клеток и обеспечивают тем самым

перенос наследственной информации от одной клетки к другой по

типу трансдукции.

Открытие подвижных элементов в геноме про- и эукариот совер-

шило поистине революцию в классической генетике. Действительно,

после их обнаружения были вскрыты новые механизмы регуляции

генной активности, а также хромосомных аберраций, выявлены новые

неканонические способы наследственной изменчивости генов. Кроме

того, было установлено, что блуждающие гены обеспечивают высо-

'242

кую частоту обмена генетической информации без полового раз-

множения и тем самым способствуют быстрому распространению

генов в популяциях и, следовательно, ускорению эволюции организ-

мов. Наконец, был обнаружен горизонтальный перенос наследствен-

ной информации в пределах клеток и особей не только одного

вида, но и разных видов, иногда эволюционно отдаленных. Это

можно считать одним из самых существенных открытий современной

генетики.

Следует, однако, отметить, что возможность к перемещению эле-

ментов генома реализуется лишь при наличии специфических фермен-

тов, которых в клетке обычно бывает очень немного. К тому же,

ничего не известно о их функции и синтезе, а также о его регуляции.

По-видимому, в клетке действуют какие-то механизмы контроля за

количеством и активностью этих ферментов, обусловливающих

все-таки относительно стабильную локализацию генов в хромосомах.

С открытием подвижных элементов генома (МДГ и умеренных

фагов) сформировалось и новое представление о механизмах зло-

качественного роста. Установлено, что опухолевое перерождение

клеток (онкогенез, или канцерогенез) может быть обусловлено

функциональным состоянием особых клеточных с-опс генов, или онко-

генов, кодирующих аминокислотную последовательность специфиче-

ских белков, необходимых для роста и размножения клеток. С-опс

гены имеют мозаичное строение и обычно проявляют очень низкую

активность, причем последняя находится под контролем регуля-

торных систем клетки. При любом нарушении структуры или изме-

нении количества онкогенов они выходят из-под этого контроля,

вследствие чего клетки начинают бесконтрольно делиться, не завер-

шают своего полного развития и превращаются в злокачественные.

В настоящее время предполагается существование следующих

механизмов активации онкогенов:

1. Мутация онкогена с замещением в нем одного или нескольких

нуклеотидов, что приводит к изменению аминокислотных остатков в

структуре белка, контролирующего размножение клеток.

2. Ошибки репликации ДНК, приводящие к росту числа (дупли-

кации) онкогенов; избыток онкогенов выходит из-под контроля ре-

гуляторных клеточных систем.

3. Усиление транскрипции онкогена и ее выход из-под контроля

систем регуляции в результате внедрения МДГ.

Появление опухолеродных клеток может быть также связано с

действием вирусных онкогенов, или v-onc генов. Они обнаружены в

геноме ряда ретровирусов*. Геном типичного ретровируса обычно

содержит три гена: gag, pol и env, контролирующие соответственно

структуру белка сердцевины вируса, полимеразы и белков оболочки

(рис. 134). Если в этой последовательности ген env замещается

геном v-onc, вирус становится дефектным по репликации и приобре-

тает способность превращать нормальные клетки, в которых хра-

* Ретровирус — это РНК-содержащий вирус, цикл размножения которого

проходит через стадию двухцепочечной ДНК.

'243

нится, в опухолевые. По нуклеотидной последовательности v-onc гены

гомологичны информативной (экзонной) части клеточных с-опс

генов. В связи с этим предполагается, что v-onc гены образовались в

результате сплайсинга копий РНК с-опс генов.

Существует большая группа у-онкогенов. Из них наиболее изучен

src ген — ген вируса саркомы Рауса у кур. Он также имеет клеточное

происхождение и представляет собой участок ДНК, который, по-ви-

димому, был случайно захвачен вирусом при инфицировании им

нормальных клеток (рис. 135). Нормальная клетка у кур содержит

1—2 гена src, ответственных за ее размножение; в определенные

периоды жизни клетки эти гены выключаются. Вирус, захватив ген

src и приобретя таким образом онкогенные свойства, может вклю-

читься в другую нормальную клетку и внести в нее дополнительный

ген src у который, встраиваясь в не свойственное для него место,

выходит из-под контроля регуляторных систем. В результате неуправ-

ляемой экспрессии этих генов нормальная клетка превращается

в злокачественную.

'244

Генная и клеточная инженерия

Достижения молекулярной биологии стимулировали развитие

нового направления в генетике — генной и клеточной инженерии,

целью которого является создание неполовым путем (методами гиб-

ридизации на уровне молекул ДНК или соматических клеток) гибрид-

ных форм с новыми, ранее не встречавшимися комбинациями при-

знаков. Генную инженерию следует отличать от генетической инже-

нерии. Последняя преследует цель создания гибридных форм за счет

новых комбинаций хромосом и геномов, полученных путем скрещи-

вания животных или растений.

Генная инженерия. Развитие генной инженерии началось еще

в 50—60-х годах после расшифровки структуры ДНК и генетиче-

ского кода. Уже тогда был воспроизведен синтез триплетов и белко-

вых молекул in vitro. Но первым серьезным вкладом в это направле-

ние явилась разработка метода выделения группы однородных ге-

нов из хромосомы кишечной палочки учеными Гарвардского уни-

верситета во главе с Дж. Беквитцом в 1969 г. Им удалось выделить

лактозный оперон, состоящий из шести генов: трех структурных и

трех регуляторных. Длина его была немного более 1 мкм. Методика

эксперимента предполагала заражение клетки Е. coli вирусом, пе-

ренос генов бактерии на хромосому вируса и выделение их в изоли-

рованном виде. С этой целью брались два штамма вирусов (фага А,),

неидентичных по структуре, но обладающих одинаковой способ-

ностью при размножении в кишечной палочке захватывать и встраи-

вать в свой геном лактозный оперон бактерии. После денатурации

была выделена чистая ДНК вирусов, включающая лактозный опе-

рон кишечной палочки. При гибридизации тяжелые нити ДНК обоих

вирусов в области лактозного оперона соединялись в двойную спи-

цаль, оставляя по обеим сторонам от него непарные цепи. Эти оди-

ночные нити ДНК удалялись с помощью специального фермента

рестриктазы, и таким образом освобождался лактозный оперон

(рис. 136). Впоследствии способ выделения изолированных генов

был еще более усовершенствован и упрощен.

'245

В 1965 г. Р. Холли с сотрудниками завершил работу по расшиф-

ровке первичной структуры аланиновой т-РНК, состоящей из 77 ну-

клеотидов. Сразу после этого открытия американский ученый Г. Ко-

рана* начал работу по химическому синтезу гена и в 1970 г. осущест-

вил синтез 77-членного участка ДНК, кодирующего аланиновую

т-РНК в клетках пекарских дрожжей. Корана использовал метод

направленного синтеза нуклеотидных связей. Ему удалось получить

двухнитевые фрагменты длиной от 5 до 12 нуклеотидов со свободны-

ми однонитевыми концевыми участками, комплементарными таким

же участкам соседних двухцепочечных фрагментов ДНК. Дальней-

ший синтез успеха не дал, так как более длинные цепочки нуклео-

тидов разрушались. Завершить работу по синтезу гена позволило

открытие фермента ДНК-лигазы, которая способствовала слиянию

соседних фрагментов ДНК за счет соединения комплементарных

одноцепочечных участков в двухцепочечную молекулу (1—4 —

фрагменты ДНК):

лигаза

-ц-т-а-а-г-г-ц-ц т-г-а-г-ц-а-г-г-т-г-г-т

I I I I I I I I I I I I I I I |

ц-ц-г-г-а-ц-т-ц-г-т u-u-am-u-a

3 'I' *

лигаза

Синтезированный Корана ген аланиновой т-РНК, введенный в

клетку Е. coli или в бесклеточную среду, не функционировал. Впо-

следствии оказалось, что он синтезировал только структурную часть

гена без промотора и терминальных кодонов.

В 1976 г. Корана завершил многолетнюю работу по химическому

синтезу гена тирозиновой т-РНК дрожжей, последовательность ну-

клеотидов которого была установлена еще в 1967 г. В состав синте-

зированного гена входил не только участок, кодирующий структу-

ру т-РНК из 126 пар нуклеотидов, но и два регуляторных участка:

промотор (52 пары) и терминатор (21 пара). Успех этого открытия

заключался еще и в том, что синтезированный ген дрожжей нормаль-

но функционировал при введении его в живую кишечную палочку.

Однако химический синтез генов растений, животных и человека,

размер которых достигает нескольких тысяч нуклеотидов (в среднем

1000—3000), практически не осуществим. Для этой цели лучше ис-

пользовать метод ферментативного синтеза на матрице РНК с по-

мощью обратной транскриптазы. Ферментативный путь генного син-

теза на м-РНК, соответствующей определенному гену, с помощью

фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы в принципе позволяет

воспроизвести многие, даже значительных размеров, гены. Так, на-

чиная с 1972 г. американский ученый С. Спигельман синтезировал

* Вместе с Корана над химическим синтезом гена работала интернациональная

группа ученых из СССР, Италии, Норвегии, Голландии, Японии, Индии и США.

'246