Каминская Э.А. Общая генетика

Подождите немного. Документ загружается.

рии А. С. Серебровского у дрозофилы в сложном гене scute-achaete

были обнаружены высоко мутабильные центры, так называемые го-

рячие точки. Позже аналогичные центры были выявлены у фагов

и прокариот. Установлено, что их положение меняется при смене

мутагенного фактора, который одновременно оказывает влияние и на

уровень мутабильности генов. Изменение мутабильности генов про-

исходит также под влиянием особых генов-мутаторов и вследствие

перемещения (транспозиции) специфических генетических элемен-

тов (см. гл. 8).

Следовательно, возникновение мутации связано не только с про-

никновением в ядро радиации и химических веществ и с их взаимо-

действием с ДНК, но и с состоянием самих генов и хромосом.

Станет ли повреждение ДНК стойкой мутацией, зависит также от

структурных особенностей клетки, подвергающейся воздействию

мутагенов, и от состояния организма в целом. Очевидно, в процессе

формирования мутации участвует весь комплекс биохимических и

структурных компонентов клетки.

После того как были открыты химические мутагены, Ш. Ауэрбах

(1949), Р. Свенсон (1955) и другие исследователи изучили механиз-

мы индуцированного мутагенеза у дрозофилы и микроорганизмов

и пришли к принципиально важному выводу, что мутация не явля-

ется мгновенной перестройкой ДНК, а представляет собой процесс

определенной продолжительности. По их мнению, мутации предшест-

вует пред мутационное, или потенциальное, повреждение ДНК, кото-

рое представляет собой состояние возбуждения ее молекулы, возни-

кающее под влиянием мутагена.

Потенциальными предмутационными повреждениями ДНК могут

быть также включение в молекулу ДНК вместо нормального осно-

вания химического мутагена (например, 5-БУ), изменение азотистого

основания таким образом, что оно начинает ошибочно спари-

ваться (например, ошибки спаривания при дезаминировании, выз-

ванном действием азотистой кислоты) и повреждение мутагеном од-

ного или нескольких оснований в молекуле ДНК (например, обра-

зование димера), в результате чего данный отрезок молекулы ста-

новится неактивным.

Предмутационному состоянию, по мнению некоторых авторов,

в свою очередь предшествует первичное молекулярное поврежде-

ние ДНК. Оно сводится к возмущениям и ионизации ее молекулы,

к отрыву от нее атомов и радикалов. При таких повреждениях нор-

мальное состояние молекулы ДНК может самопроизвольно восста-

новиться.

F" i Потенциальное предмутационное состояние может либо восста-

новиться до нормального, либо реализоваться в мутацию. Возврат

предмугационного изменения ДНК к норме обеспечивается специ-

альными ферментативными системами репарации, или восстановле-

ния. Если возврата ДНК к нормальному состоянию не происходит,

потенциальное изменение фиксируется и превращается в стойкую му-

тацию.

Впервые возможность репарации генетических повреждений была

'217

установлена в 1948 г. А. Кельнером, Р. Дульбеко и И. Ф. Ковале-

вым. Они обнаружили ферменты, участвующие в восстановлении

потенциальных генных мутаций и даже разрывов хромосом. В 1962 г.

К. Руперт расшифровал сущность одной из систем репарации, полу-

чившей название фотореактивации. Она была выявлена у Т-четных

фагов, бактерий, дрожжей и парамеций. У этих организмов УФ-

облучение обычно вызывает резкое снижение жизнеспособности.

Однако выживаемость их увеличивается во много раз, если на них

дополнительно воздействовать интенсивным видимым светом. Внача-

ле считали этот процесс неферментативным, но в 60-х годах Руперту

удалось выделить из клеток Е. coli активирующий элемент —

дезоксирибопиримидинфотолиазу, который, используя энергию света,

расщепляет димеры и таким образом восстанавливает УФ-повреж-

дения в ДНК фагов и бактерий. Димеры представляют собой

сдвоенные буквы генетического кода, нарушающие процесс считыва-

ния информации. Дезоксирибопиримидинфотолйаза в условиях тем-

ноты образует с ними комплекс, который на свету распадается, в ре-

зультате чего образуются мономеры:

ГА А 4 ^ F А А Ц

i г i г г ;

Функциональная способность ДНК при этом восстанавливается.

Фермент не связывается с неповрежденной ДНК и не «лечит» другие

нарушения ее структуры. Он кодируется у эукариот ядерными генами,

а у прокариот — генами нуклеоида. Предполагается, что генетичес-

кий контроль ферментативной активности носит полигенный харак-

тер. Например, у мутанта Е. coli по гену phr димеры не вос-

станавливаются, а ряд других повреждений фотореактивируется.

Фотореактивация происходит до репликации ДНК-

Дорепликативной репарацией также является темповая, или

эксцизионная, репарация. Она была описана в 50—60-е годы рядом

исследователей (А. Герен, Р. Светлоу, Р. Хилл), которые обнару-

жили, что восстановление генетических повреждений, вызванных

УФ, происходит не только на свету, но и в темноте. Сущность

данного процесса сводится к вырезанию поврежденных участ-

ков из облученной молекулы ДНК. Вначале предполагалось, что тем-

новая репарация действует только на тиминовые димеры. Однако

впоследствии было установлено, что эксцизионная репарация не спе-

цифична и активна по отношению к различным повреждениям ДНК

(утрата азотистого основания с сохранением сахаро-фосфатной

связи, дефект азотистого основания, структурные дефекты). Эксцизи-

онная репарация осуществляется поэтапно, и каждый этап контро-

лируется определенным ферментом. На первом этапе с помощью

эндонуклеаз происходит «узнавание» повреждения ДНК. Этот же

фермент участвует в образовании одноцепочечного разрыва ДНК

(инцизин) вблизи дефекта. На следующем этапе с помощью экзону-

'218

клеазы вырезается (эксцизия) и

"удаляется дефектный фрагмент.

В результате в одной из цепей

ДНК образуется брешь (рис. 123),

которая затем с помощью репа-

рационной ДНК-полимеразы за-

страивается. В качестве матрицы

в этом случае используется непо-

врежденная цепь ДНК- После за-

вершения синтеза участка ДНК

непрерывность цепи восстанавли-

вается путем замыкания фосфо-

диэфирных связей с помощью ли-

газы.

Эксцизионная репарация мо-

жет также осуществляться только

с помощью инсертазы.

Однако ii TpiT" фотореактива-

ции, и при эксцизионной репара-

ции не всегда восстанавливаются

все повреждения ДНК до ее реп-

ликации. В таких случаях после

репликации ДНК мутация приоб-

ретает стойкий, стабильный ха-

рактер, но и при этом поврежден-

ная ДНК может восстановиться,

т. е. наступает пострепликатавная репарация. Она была обнаружена

в клетках Е. coli, в которых в результате мутации нарушились

процессы дорепликативной репарации. Оказалось, что при репли-

кации поврежденной ДНК против ее тиминовых димеров в дочерних

цепях образуются пробелы:

Указанные пробелы ликвидируются путем рекомбинации между

дочерними цепями или между дочерней и родительской цепями. Про-

белы в родительской цепи ДНК заполняются вследствие репара-

тивного синтеза.

В 1974 и 1975 гг. М. Радман и Э. Виткин открыли еще один меха-

низм репарации — индуцируемую репарацию, или SOS-репарацию.

Она включается по сигналу бедствия после воздействия ионизиру-

ющих излучений, когда в молекуле ДНК появляются одно- и двуните-

вые разрывы, модифицированные основания или другие повреж-

дения. SOS-репарация заключается в реакции клетки на эти повреж-

дения, в результате которой активизируются гены, отвечающие за

'219

синтез ферментов репарации. (В необлученной клетке таких фермен-

тов нет.) SOS-репарацию называют еще репарацией, склонной к

ошибкам, поскольку она не обеспечивает полное и точное восстано-

вление первичной структуры молекулы ДНК и этим отличается от

безошибочной эксцизионной репарации. Репаративный SOS-ответ

длится несколько часов, в связи с чем данную репарацию нередко

называют медленной пострепликативной репарацией.

Кроме SOS-репарации, существует еще один вид индуцированной

репарации — адаптивный ответ, возникающий на действие алкили-

рующих агентов. Установлено, что в клетках в ответ на действие,

например, такого алкилирующего соединения, как УУ-метил-УУ-нитро-

зомочевина в очень низких дозах, индуцируется синтез специфичес-

ких ферментов репарации, способных восстанавливать только алки-

лированную ДНК. К примеру, один из таких ферментов переносит

метильную группу с 0

-метилгуанина (предмутационный тип повреж-

дения ДНК при алкилировании) на остаток цистеина, входящего

в состав самого фермента, и повреждение устраняется.

Все системы репарации детально изучены у прокариот. В насто-

ящее время они выявлены и у дрожжей, растений, млекопитающих.

Однако у последних обнаружить SOS-репарацию пока не удалось.

ЛИТЕРАТУРА

Алиханян С. И., Акифьев А. П., Чернин Л. С. Общая генетика. М., 1985.

Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. М., 1978.

Гершензон С. М. Основы современной генетики. Киев, 1979.

Гончарова Р. И. Антимутагенез. Мн., 1974.

Дубинин Н. П. Генетика. Кишинев, 1985.

Завадовский М. М. Внешние и внутренние факторы развития. М.; Л., 1928.

Майр Э. Популяции, виды и эволюция. М., 1974.

Медников Б. М. Закон гомологической изменчивости. М., 1980.

Сойфер В. Н. Молекулярные механизмы мутагенеза. М., 1969.

Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. М., 1981.

Филиппенко Ю. А. Изменчивость и методы ее изучения. М., 1978.

Шмальгаузен И. И. Факторы эволюции. М., 1968.

Глава 8. СТРУКТУРА ГЕНОВ

И ГЕНОМА ПРОКАРИОТ

И ЭУКАРИОТ

Представления о природе генетического

материала по мере расширения возможностей генетического анализа

углублялчсь

°а последние 20—30 лет пополнились столь серьезными

открытиями, что претерпели существенные изменения. В настоящее

время привычные постулаты классической генетики о структурной

и функциональной целостности гена и относительной стабильности

генома сменились постулатами современной генетики, утверждаю-

щими сложное строение и функциональную делимость гена, неста-

бильность генома и способность его элементов к перемещению. Это

'220

позволило изменить и представления о механизмах наследственной

изменчивости, работы иммунной системы и канцерогенеза, о бакте-

риальной устойчивости к антибиотикам.

Хромосомная теория гена

Представление классической генетики о единице наследствен-

ности в основном базируется на положении о функциональной

неделимости гена и стабильности структуры гена и генома.

Термин «ген» впервые применил В. Иоганнсен в начале XX в. для

определения «особых, при известных обстоятельствах отделимых друг

от друга и в силу этого до известной степени самостоятельных еди-

ниц, или элементов, в половых клетках», обусловливающих свойства

организма. Вопрос о локализации этих единиц долгое время оста-

вался нерешенным. Предположение о том, что гены локализуются в

хромосомах, впервые высказал А. Вейсман (1894), а эксперименталь-

но подтвердил Т. Морган (1911), сформулировавший хромосомную

теорию наследственности. Тем не менее В. Бэтсон (1909), совре-

менник Моргана, сомневался в том, что частички хроматина или

какой-либо другой субстанции могут нести те же «силы», что и гены.

Согласно представлениям хромосомной теории, ген является наи-

меньшей структурной единицей наследственности, ответственной за

формирование определенного признака. Он локализуется в хромосо-

ме и занимает строго постоянное место — локус. Однако это постоян-

ство относительно, так как под влиянием различных факторов ген

может менять положение, в результате чего изменяется и его фено-

типическое выражение. Следовательно, ген является и наименьшей

функциональной единицей наследственности, детерминирующей

один элементарный признак организма и отвечающей за фенотипи-

ческое различие особей.

Структура гена, так же как и его локализация, относительно

постоянна, и под влиянием каких-либо воздействий может изменять-

ся. Это приводит к формированию мутантного фенотипа и обу-

словливает возможность существования гена в двух или нескольких

аллельных состояниях. Аллели оказывают различное действие на

развитие и фенотипическое выражение признака. Значит, ген являет-

ся также элементарной единицей мутации, т. е. единицей, спо-

собной как единое целое изменяться и в таком виде воспроизво-

диться в потомстве.

Согласно положениям классической генетики, ген не может быть

разделен путем кроссинговера; рекомбинация возможна лишь между

локусами хромосомы. Следовательно, ген является и наименьшей

единицей рекомбинации. Кроме того, он способен к редупликации.

Таким образом, в соответствии с хромосомной теорией наслед-

ственности, ген представляет собой участок хромосомы, выступаю-

щий как наименьшая неделимая единица функции, мутации и реком-

бинации. Исходя из этого представления и учитывая, что ген контро-

лирует развитие элементарных менделевских признаков, Морган ввел

функциональный и рекомбинационный тесты определения аллельной

принадлежности гена.

Функциональный тест позволяет определить аллельность рецес-

сивных аутосомных мутаций путем скрещивания между собой му-

тантных особей. Для того чтобы установить, аллельны ли две незави-

симо полученные мутации, детерминирующие один и тот же признак

(т. е. принадлежат ли одному локусу хромосомы), или неаллельны

(т. е. принадлежат разным локусам), достаточно определить

фенотипический эффект от их совмещения в гетерозиготе. Если мута-

ции аллельны, то гетерозигота будет иметь мутантный фенотип,

если неаллельны — дикий. Например, если при скрещивании белой

норки с платиновой, потомство получается платинового цвета, зна-

чит, эти мутации принадлежат одному гену, т. е. аллельны:

Р 9 = X сf ^

щ а

белая платиновый

F] ±

платиновые

Если же при скрещивании платиновой и голубой норок в потом-

стве первого поколения ни одна из этих мутаций не проявляется

и гибриды имеют дикий фенотип, тогда, очевидно, мутации локали-

зуются в разных локусах. В этом случае у гибридного потомства

происходит комплементарное взаимодействие доминантных аллелей

из каждой пары генов:

р 9 di х <3 = =

А\ а

а\ А

платиновая голубой

f fil

CL\ Л 2

коричневые (дикий тип)

Выводы об аллельности или неаллельности мутаций можно под-

твердить анализом второго поколения, полученного от скрещивания

гибридов первого поколения между собой. Если в нем расщепление

особей по признаку составит 3:1, значит, мутации аллельны, если

же 9:3:3:1 либо 9:3:4 — неаллельны.

Рекомбинационный тест на аллелизм сводится к определению воз-

можности и частоты рекомбинаций между мутантными генами. Ре-

комбинации возможны только в том случае, если мутации неаллель-

ны. Если же мутации затрагивают один и тот же локус, они не реком-

бинируют, поскольку кроссинговер происходит лишь между генами.

'222

Функциональный и рекомбинационный тесты оправдывали бы

себя, если бы ген действительно был наименьшей неделимой структу-

рой хромосомы, функционирующей и мутирующей как единое целое.

Однако с расширением возможности генетического анализа было

установлено, что классические тесты на аллелизм не всегда дают од-

нозначный результат. На основании этого некоторые ученые пришли

к выводу, что представления о гене в свете хромосомной теории

несколько упрощены и что необходима более детальная расшифров-

ка его функциональной и структурной сущности.

Центровая теория гена. Псевдоаллелизм

В 20-х годах, после открытия мутагенного действия излу-

чения, представление о неизменности и неделимости генов было поко-

леблено. В конце 20-х — начале 30-х годов А. С. Серебровский с сот-

рудниками (И. И. Агол, Н. П. Дубинин, С. Г. Левит, Н. И. Шапиро

и др.) на основании анализа серии индуцированных рентгеновским

излучением мутаций локуса achaete — scute (определяют число и

характер щетинок на теле мухи) в половой хромосоме дрозофилы

впервые высказали мысль о сложном строении гена. Они обнаружили,

что каждая из 14 изученных ими мутаций по локусу scute (sci — sc

)

обусловливает отсутствие щетинок на том или ином участке тела,

в то время как в норме щетинки развиваются на всем теле (рис. 124).

У гибридов, полученных от скрещивания этих мутантов между собой,

щетинки, по которым они проявляли сходство и которые у гомозигот

не развивались, оказались редуцированными, а щетинки, по которым

мутанты различались, развивались нормально. Например, аллель

SC2 вызывает редукцию щетинок на участках 8—10, a sc\ —6—9.

У гибрида же щетинки отсутствовали только на участке 8—9; на

остальных сегментах тела они развивались нормально.

Обозначив фенотип всех мутаций и расположив их друг за другом,

Серебровский обнаружил явление перекрываемости мутаций и

назвал его ступенчатым аллелизмом. Сущность ступенчатого алле-

лизма заключается в том, что каждый ген может мутировать от-

дельными фрагментами и тот или иной элементарный признак может

контролироваться не всем геном, а его соответствующими участ-

ками. На основании этого исследователи пришли к выводу, что ген не

является ни единицей мутации, ни единицей функции. В результате

была сформулирована так называемая центровая теория гена, сог-

ласно которой основной ген (Серебровский предложил называть его

базигеном) подразделяется на несколько функционально самостоя-

тельных субгенов (трансгенов):

базиген

'223

Согласно центровой теории, формирование мутантного фенотипа

у гетерозиготы определяется совмещением двух одинаковых мутант-

ных участков одного и того же гена:

5С

Л ^ +

Так, с помощью генетического анализа мутаций scute путем ис-

пользования классических тестов на аллелизм Серебровский с со-

трудниками получили результаты, позволившие им выдвинуть гипо-

тезу о существовании функциональных единиц меньшего, чем ген,

порядка — трансгенов. Они предполагали, что трансгены распола-

гаются внутри гена в линейном порядке и что развитие признака

обусловливается их функциональным взаимодействием.

Результаты исследований Серебровский доложил на Всесоюзном

съезде по генетике, селекции, семеноводству и племенному животно-

водству (1929), где присутствовали видные немецкие ученые Э. Бауэр

и Р. Гольдшмидт. Однако центровая теория не нашла п^держки

у многих советских и зарубежных генетиков, так как они оставались

приверженцами господствующих в то время взглядов о неделимости

гена. К идее Серебровского критически отнесся и сам Морган — ав-

тор теории о структурной и функциональной неделимости гена.

Открытие Серебровского получило подтверждение спустя почти

20 лет, после того как выяснилось, что ген может быть разде-

лен путем кроссинговера. Эти сведения были получены в 40-х годах

американскими учеными К. Грин, М. Грином, К. Оливером и Е. Льюи-

сом при изучении рецессивных мутантных аллелей гена lozenge.

Локус lozenge занимает в половой хромосоме участок длиной

около 0,02 ед., в котором располагаются по крайней мере 3 гене-

тических фактора со сходным фенотипическим выражением (умень-

шенные размеры глаз и слияние глазных фасеток, вследствие чего

глаза приобретают яйцевидную форму). Каждый из этих факторов

в отдельности рецессивен.

Изучая у дрозофилы действие двух аллелей гена lozenge, К. Грин

и М. Грин установили, что мутации lz

50е

и lz

в гомозиготе и в компа-

унде (гетероаллельная комбинация) с другими мутациями lz дают

ярко выраженный мутантный фенотип, а в компаунде lz

50e

/ lz

—

частично комплементарны и дают фенотип, близкий к нормальному.

Оливер обнаружил также, что в потомстве, получаемом от анали-

зирующего скрещивания гетерозиготы lz

/lz

, с постоянной часто-

той (1 • 10~~

) возникают реверсии (возврат) к дикому типу, кото-

рые, по его мнению, можно объяснить рекомбинацией между сцеплен-

ными с локусом lozenge аллелями. Аналогичный эффект получил и

Льюис при рекомбинационном анализе, произведенном с двумя алле-

лями другого гена, также определяющего развитие глаз у дрозофилы.

Предположив в связи с этим, что отдельные участки гена способны

к рекомбинации, Льюис сделал следующее допущение: мутация за-

'224

хватывает не весь ген, а лишь

небольшую его часть; между ча-

стями гена происходит кроссин-

говер (рис. 125). Мутации одного

гена, т. е. аллельные мутации,

между которыми происходит крос-

синговер, получили название псев-

доаллели. В тех случаях, когда

наблюдаются противоречия между

функциональной и рекомбинаци-

онной оценками мутации на алле-

лизм, используется термин «псев-

доаллелизм».

Исходя из того, что ген пред-

ставляет собой сложную в функ-

циональном и рекомбинационном

отношениях единицу наследствен-

ности, для определения аллель-

ности мутаций у дрозофилы Льюис

предложил тест на комплемен-

тарность, так называемый цис-

транс-тест. Сущность его сводится к тому, что при цис-положении

обе мутации гибрид получает от одного родителя, при транс-поло-

жении — от обоих. Наиболее существенную роль играет транс-тест,

а цис-тест является как бы его контролем. Транс-тест по сути ана-

логичен функциональному тесту на аллелизм, предложенному Мор-

ганом. Принципиальные же различия между ними состоят в том,

что Морган считал ген неделимой структурной единицей хромосомы,

а Льюис исходил из того, что ген представляет собой сложную

систему, состоящую из нескольких самостоятельных в фенотипиче-

ском выражении функциональных единиц.

Цис-транс-тест, таким образом, позволяет установить, аллельны

или неаллельны мутации даже в том случае, если они локализуются

в одном гене, но принадлежат разным функциональным единицам

(табл. 5).

Таблица 5. Цис-транс-тест на аллелизм

Серебровский Александр Сергеевич

(1892—1948).

Неаллельны

Дикий

фенотип

Дикий

фенотип

Если мутации комплементарны, т. е. принадлежат разным функ-

циональным единицам гена, то и при цис-, и при транс-положе-

15.

Зак. Ы07

225

ишшшпшиш

\ \ \ . I /

/лрансгены

tO j-jj (сусГгеш)

iTTTI

ГбТТШ

SC* ИШ

set \4\J\6\7\Q\gUo\

\ 6 I 7 1 в I 9 I

5Св \6\7\в\

5C? [ТЕШ

\6\7\dWW\

Рис. 124. Структура гена scute и ряда му-

тантов по данному локусу (согласно цент-

ровой теории гена).

ниях гибрид будет иметь дикий фенотип. Если же мутации относятся

к одной функциональной единице гена, то у гетерозиготы при транс-

положении может сформироваться мутантный фенотип, т. е. феноти-

пически эти мутации проявят себя как аллельные, например: t

lZ\ -f + /2, /22 + Izi + +

Для нормального функционирования генов и развития-дикого фе-

нотипа нужно, чтобы по меньшей мере в одной хромоецме был полный

набор нормальных факторов.

Гаметы

1 I

Крассоверные

Рис. 125. Псевдоаллелизм; кроссинговер между отдельными участками

одного гена.

Следовательно, открытие явлений ступенчатого аллелизма и псев-

доаллелизма послужило экспериментальным доказательством слож-

ного строения и функциональной делимости гена.

'226