Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Таблица 10.1

Аминокислотный состав церулоплазмина человека

Аминокислота

Количество

остатков,

отнесенных

к молекулярной

массе 151 000

[79]

Аспарагиновая кислота

143

Треонин

Серии

Глутаминовая кислота

132

Пролин 60

Глицин

Аланин

'/г цистина

Цистеин

—

Валин 73

Метионин

Изолейцин

Лейцин

Тирозин

Фенилаланин

Лизин

Гистидин

Аргинин

Триптофан

N-Концевые аминокислоты на молекулу белка [57]

Валин 0,9

Лизин

0,25

Количество SH-ipynn., обнаруживаемых в молекуле

дерулоплазмин

1 [45, 57, 80]

апоцерулоплазмин

5 [45]

4 [81]

В предположении, что молекулярная масса белка равна

151

ООО

и что приблизительно 9% от нее составляет масса угле-

водов и меди, на долю аминокислотных остатков приходится

масса от 137 000 до 138 000.

Таблица 10.2

Физические свойства церулоплазмина человека

Молекулярная

масса

Метод Литература

151 ООО

Седиментационно-диффузион-

ный

160 ООО

То же 33

155 ООО

Приближение к равновесию 33

143 ООО

То же

132 ООО

Рентгеноструктурный

Коэффициент седиментации (S)

7,08 [33]

Коэффициент диффузии, см

/с

3,76-10-' [зз|

Парциальный удельный объем, см

/г

0,714 [28]

0,713 [33]

Отношение осей (а/6)

3,6 [451

Вязкость,

г-см

-1

-с

-1

4,1 [45]

Изоэлектрическая точка

4,4 [34]

Размеры кристаллографической ячей-

а=Ь=268 [32]

ки, А (пространственная группа 14)

с= 129 [32]

Таблица ЮЛ

Оптические свойства церулоплазмина человека

Длина волны,

Коэффициент поглощения

на 1 г-атом Cu

[83)

794

850

610

4400

0,68 [23]

459

460

0,71 [45]

332

1600

280

14,6 [23]'

15,4 [45]

В предположении, что поглощение света обусловлено все-

ми нонами Cu

+ и только этими ионами.

Церулоплазмин

365'

Таблица 10.4

Электрофоретические свойства церулоплазмина человека

Буфер

у/2 PH

Подвижность,

105 СМ2.B-I-C-K

Барбитуратный

0,1

8,76

—5,20[33]

Трис-буфер

0,1

8,41

—5,26[33]

Фосфатный

0,1

7,01 —4,72[33]

Ацетатный

0,1

5,48 —2,74

[33]

0,2

5,40

—3,50[44]

Электрофорез с движущейся границей. С помощью электрофореза на крахмальном ге-

ле [84), на бумаге [85] или микроиммуноэлектрофореза [86] удается выделить две и более

компонент, обладающих оксидазной активностью.

шению к ряду полиаминов, полифенолов и иону железа(II). Его

легко можно получать в количестве граммов из объединенных

фракций плазмы человека, в 100 мл которой обычно содержится

20—40 мг церулоплазмина, либо из обогащенной им фракции, на-

пример фракции IV Кон. Разработано несколько препаративных

методов его выделения с помощью хроматографии на диэтилами-

ноэтилцеллюлозе или гидроксиапатите либо путем осаждения суль-

фатом аммония, этанолом или смесью этанола с хлороформом

[20—27]. Степень очистки обычно оценивают по отношению свето-

поглощения растворов образца при 610 и 280 нм, которое для наи-

более чистых образцов достигает значения 0,046. Из таких раство-

ров церулоплазмин человека выкристаллизовывается в виде тетра-

гональных призм [28] (рис. 10.1).

Аминокислотный состав церулоплазмина человека приведен

в табл. 10.1. О последовательности аминокислот в его белковой

цепи данных пока не имеется. Вторичная структура имеет |3-кон-

фигурацию и беспорядочную укладку с небольшой примесью а-спи-

ралей или при их отсутствии. Судя по гидродинамическим свой-

ствам церулоплазмина (табл. 10.2), третичная структура его

молекулы представляет собой очень плотную упаковку. Недавно

Саймоне и Берн [29] на основании своих исследований предложи-

ли тетрамерную модель четвертичной структуры белка, которая

зключает две полипептидные цепи с молекулярной массой 15 900

i N-концевыми аминогруппами валина и две полипептидные цепи

• молекулярной массой 59 000, в которых в качестве N-концевых

выступают остатки лизина. В табл. 10.3 и 10.4 представлены неко-

торые оптические, электрофоретические и кристаллографические

:войства церулоплазмина человека.

366

i лава 2

3.СОСТОЯНИЕ МЕДИ В ЦЕРУЛОПЛАЗМИНЕ

Атомы меди являются неотъемлемой частью молекулы церуло-

плазмина, и в ходе всех процессов с его участием они постоянно

соединены с белком [30]. При введении неорганической соли

радиоактивной меди она не обменивается с медью, содержащейся

в церулоплазмине in vivo. Следовательно, сразу отпадает гипоте-

за о том, что церулоплазмин способен обратимо диссоциировать,

выделяя ионы меди, и что физиологическая функция его в связи

с этим может якобы состоять в поддержании определенного гра-

диента концентрации ионов меди и регулировки их усвоения из

пищи [31].

Большая прочность связывания меди белком в церулоплазмине

обусловлена строением всей молекулы белка. Диссоциация моле-

кулы на субъединицы или ее протеолитическое расщепление приво-

дит к разрыву или значительному ослаблению связи меди с остав-

шимися компонентами. Особый характер этих связей можно понять

только при изучении исходного белка в целом, либо путем приго-

товления апопротеина с последующим переведением его в холопро-

теин при добавлении солей меди.

3.1. Число атомов меди в молекуле церулоплазмина

Эта величина остается до сих пор неопределенной из-за отсут-

ствия точных данных о молекулярной массе церулоплазмина и со-

держании меди, которое стало известным в самое последнее время.

Величина молекулярной массы церулоплазмина, по-видимому, на-

ходится между 150 000 и 160 000, хотя по рентгеноструктурным

данным она составляет всего 132 000 [32]. Содержание меди пс

данным ранних исследований было 0,32—0,34%, однако позже

анализ кристаллически:* образцов показал, что содержание медг

в них близко к 0,28% [35]. Исходя из последних данных, можнс

считать, что в молекуле церулоплазмина содержится шесть ил!

семь атомов меди.

3.2. Свойства церулоплазмина,

обусловленные присутствием в нем меди

Способность ионов меди(II) обратимо восстанавливаться суб

стратом и окисляться кислородом обусловливает оксидазнук

активность церулоплазмина [36]. Все ли атомы меди, входящи

в состав белка, ответственны за его ферментативную активность

не известно. Интенсивная синяя окраска церулоплазмина обуслов

лена ионами меди (II), и белок может полностью (и обратимо

обесцветиться под действием восстановителей. В этом отношени

Церулоплазмин

367'

также неизвестно, все ли атомы меди, входящие в состав церуло-

плазмина, являются хромофорами, обусловливающими синюю

окраску.

Степень окисления меди в церулоилазмиие первоначально была

определена химическими методами с помощью избирательных реа-

гентов на ионы меди(II) [38], а позже — методами полярографии

и ЭПР. Различные методы дали хорошо согласующиеся результа-

ты, согласно которым примерно половина атомов меди находится

в церулоплазмине в степени окисления II (табл. 10.5). Эти ионы

меди (II) неэквивалентны между собой, поскольку при последова-

тельном их восстановлении аскорбиновой кислотой интенсивность

синей окраски уменьшается не линейно с изменением эффективно-

сти ионов меди в магнитной релаксации протонов [39]. Ионы

меди(I) церулоплазмина окисляются только при разрушении бел-

ка, хотя ионы Cu(II) могут восстанавливаться обратимо. Послед-

ние могут реокисляться только кислородом, и не могут реокислять-

ся такими окислителями, как Cu

+, Fe

+ или феррицианид [34].

Так же как и ионы Cu(II), ионы Cu(I) церулоплазмина неравно-

ценны между собой: из трех или четырех ионов Cu(I), входящих

3.3. Степень окисления меди в церулоплазмине

Таблица 10.5

Характеристика меди, содержащейся в церулоплазмине

Количество атомов Cu в молекуле церулоплазмина

8 [33, 34]

7 [35, 87, 88]

6 [32]

Доля ионов Cu

по отношению к общему количеству

атомов Cu, определенная методом:

ЭПР

0,52 [89]

0,29 [83]

0,43; 0,48 [90]

полярографическим

Параметры спектра ЭПР

магнитной восприимчивости

0,40 [91]

0,40 [92]

0,44 [87]

0,54 [93]

2,048 [94]

2,214 [94]

0,008 см-

[94]

368

i лава 2

в молекулу белка, только два связаны с атомами серы. В исходном

синем церулоплазмине ни Cu(II), ни Cu(I) не взаимодействуют

сколь-нибудь заметно с молекулярным кислородом [40].

3.4. Обмен меди церулоплазмина на медь

из растворов ее солей

Ионы радиоактивной меди(I) из раствора могут замещать

атомы меди церулоплазмина только in vitro при условии полного

восстановления меди(П) до меди(1)* [31, 41]. Различные атомы

меди в белке обмениваются с неодинаковыми скоростями. В при-

сутствии цистеина медь церулоплазмина не обменивается па рас-

творенную. Вероятно, разбросанные по всей молекуле церулоплаз-

мина остатки цистеина могут служить по крайней мере одной из

причин того, что in vivo меченые атомы

Cu или

Cu, введенные

в церулоплазмин, не обмениваются с нонами меди из раствора

[30].

4. АПОЦЕРУЛОПЛАЗМИН

Если церулоплазмин подкислить до рН ниже, чем его изоэлек-

трическая точка, или обработать цианидом [42], из него можно

удалить медь и получить бесцветный белок. Однако при добавле-

нии к такому белку ионов меди реставрировать исходный фермент

не удается. Обратимое удаление меди из церулоплазмина дости-

гается при обработке его диэтилдитиокарбаматом (ДТК) [43].

Предварительно медь(II), содержащаяся в белке, восстанавли-

вается цистеином при рН 5,0 и высокой ионной силе. Образующий-

ся затем коллоидальный комплекс ДТК с вышедшей из белка

медью с помощью ультрацентрифуги отделяют от раствора апофер-

мента. Последний может быть очищен от всплывающих примесей

путем осаждения сульфатом аммония, повторного растворения и

диализа. В замороженных растворах апофермент устойчив в тече-

ние нескольких месяцев. При добавлении к такому апоферменту

ионов меди(I) и реокисления на воздухе из него можно вновь

получить синий церулоплазмин, который по всем своим свойствам

неотличим от исходного. В процессе перевода церулоплазмина

в его апофермент и обратно не было обнаружено никаких форм

в которых содержание меди было бы промежуточным, т. е. отлич-

ным от содержания ее в апоферменте и холоферменте [44].

Согласно последним данным, полученным в лаборатории, где

работают авторы, обратимое удаление меди из церулоплазминг

* Первоначально сообщалось об обмене только половины атомов меди бел

ка [31]. Однако при увеличении периода обмена и концентрации соли

меди (I

можно достигнуть обмена всех атомов меди.

Церулоплазмин

369

сопровождается заметными изменениями конформации белка,

а в нативной форме его два иона меди(I) связаны с атомами серы

[45].

При инъекции апоцерулоплазмина экспериментальным живот-

ным он быстро выводится из физиологического кругооборота.

5. ОКСИДАЗНЫЕ СВОЙСТВА ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА

Ферментативная активность церулоплазмина была впервые

описана Холмбергом и Лоуреллом [46], которые показали, что это

единственный фермент, катализирующий окисление полиаминов и

полифенолов в плазме. Катализируемая церулоплазмином реак-

ция окисления ге-фенилендиамина и других аналогичных соедине-

ний используется обычно для количественного определения белка

в растворе [31, 47, 48]. Однако не было замечено, чтобы церуло-

плазмин играл сколь-нибудь существенную физиологическую роль

при окислении таких важных биологических субстратов, как адре-

налин, норадреналин, серотонин, катехоламин или допамин [49].

Относительно ферментативных свойств церулоплазмина имеют-

ся противоречивые данные, в особенности это касается реакции

окисления аскорбиновой кислоты [25, 50]. В настоящее время счи-

тают, что ионы меди(II) церулоплазмина попеременно восстанав-

ливаются и окисляются, взаимодействуя то с ионами железа(II),

то с молекулярным кислородом [51]. В процессе этих превращений

могут окисляться некоторые соединения, в том числе ДОПА и

аскорбиновая кислота. Осаки и сотр. [52] для обозначения этого

свойства ввели термин «ферроксидазная активность». По их пред-

положению церулоплазмин способствует окислению железа(II),

хранящегося в печени, после чего железо(III) может быть связа-

но в трансферрин. Действительно, с его помощью можно вызвать

мобилизацию железа из депо печени, что было проделано in vivo

на опытах со свиньями, в организме которых был дефицит меди,

хотя пока не доказано, связано ли это явление с какими-либо

физиологическими или патологическими последствиями. Так, на-

пример, у больных, страдающих болезнью Вильсона, годами может

сохраняться дефицит церулоплазмина или даже наблюдается пол-

ное его отсутствие, что особенно часто бывает во время лечения.

Тем не менее, хотя к моменту начала лечения анемия может до-

стигать средней стадии, почти у всех таких пациентов содержание

гемоглобина и гематокрита вскоре достигает нормального уровня,

а в метаболизме железа не наблюдается каких-либо видимых от-

клонений от нормы. Эти парадоксальные явления нашли объясне-

ние после того, как Тофам и Фриден [54] сообщили об идентифи-

кации и выделении в чистом виде из сыворотки крови человека

нового медьсодержащего белка, отличающегося от церулоплазми-

24—2451

370

Г лава 10

на и обладающего также ферроксидазной активностью. Кроме

того, предполагается, что третьим компонентом, обладающим фер-

роксидазной активностью и присутствующим в сыворотке крови

человека, может быть цитрат-ион [55].

6. НЕОДНОРОДНОСТЬ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ

ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА

Бромэн [56] первым показал, что церулоплазмин человека

представляет собой смесь двух форм, отличающихся между собой

хроматографическими свойствами [57, 58] и подвижностью при

электрофорезе [59]. Причины различий не были ясны, за исключе-

нием догадок о том, что это явление связано с механизмом на-

следственности. Указанные две хроматографические фракции (изо-

ферменты) были идентичны по содержанию меди, аминокислотно-

му и углеводному составу, обладали одинаковыми спектральными

характеристиками и проявляли одинаковую ферментативную

активность. Рихтерич [60] обнаружил различия в относительном

содержании двух изоферментов у новорожденных, взрослых людей

и людей, страдающих болезнью Вильсона, однако Хиршман [61]

и Бромэн [58] не смогли воспроизвести эти данные. Хольцман, со-

ставив пептидные карты кристаллических образцов церулоплазми-

на от здоровых людей и больных болезнью Вильсона, пришел

к выводу, что образцы между собой не отличаются [62]. По не-

опубликованным данным, полученным в лаборатории авторов

данной главы, оба изофермента синтезируются с одинаковой ско-

ростью, а медь для их синтеза используется из одного и того же

источника.

Шреффлеру с сотр. [63] удалось зафиксировать истинный гене-

тический полиморфизм церулоплазмина, который проявляется

в пяти фенотипах: CpA, CpB (обычная форма), CpAB, CpAC и

CpBC. Рассчитанная ими частота появления фенотипа оказалась

для американских кавказцев следующей: CpA = 0,006, CpB = 0,994

и CpC =

а для американских негров — CPA = O,053, CpB = O,944

и CpC = 0,003. По мнению авторов, полученные данные свидетель-

ствуют о том, что в аутосоматическом локусе сосуществуют три

гена, каждый из которых управляет синтезом одного изофермента,

отличающегося своими электрофоретическими характеристиками.

7. ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА

КАК ГЛИКОПРОТЕИДА

В табл. 10.6 приведены данные Джеймайсона об углеводном

составе церулоплазмина. В его молекуле имеется девять или де-

сять гетеросахаридных цепей, каждая из которых состоит из

Церулоплазмин

371

Таблица 10.6

Углеводный состав церулоплазмина человека

Содержание углеводов, %

Число гетеросахаридных цепей на молекулу

Число остатков сиаловой кислоты на молекулу

Число остатков N-ацечилглюкозамина на молекулу

Число остатков фукозы на молекулу

Суммарное число остатков маннозы и галактозы на молекулу

Отношение числа остатков маннозы к числу остатков галак-

тозы

шести-семн углеводных остатков. Эти цепи очень схожи между

•собой, но ио своему составу все же, по-видимому, не идентичны

[64]. Установлено, что на свободном конце каждой цепи находит-

ся остаток N-ацетилнейраминовой кислоты (сокращенное обозна-

чение NANA или реже фукоза), а на другом конце находится оста-

ток N-ацетил-D-глюкозамина, который, вероятно, связан с амид-

ным атомом азота аспарагинового остатка белка.

Сиаловая кислота может быть выделена из церулоплазмина

с помощью гидролиза при умеренном подкислении или путем

ферментативного расщепления. Полученный по второму способу

церулоплазмин, лишенный остатков сиаловой кислоты, при дейст-

вии р-галактозидазы теряет D^галактозу, а при последующей обра-

ботке гексозаминидазой отщепляет N-ацетил-D-глюкозамин. Ли-

шенный остатков сиаловой кислоты асиалоцерулоплазмин

содержит то же количество меди и обладает теми же иммунохими-

ческими, спектральными и ферментативными свойствами, что и на-

тивный белок [35], хотя, разумеется, потеря остатков сиаловой

кислоты, несущих отрицательный заряд, сказывается на подвижно-

сти белка при электрофорезе. Из раствора асиалоцерулоплазмина,

содержащего 0,10 моль/л ацетата натрия с примесью 1% NaCl при

рН 5,45, можно выделить синие кристаллы, имеющие форму гекса-

гональных призм, на основании которых находятся невысокие

пирамидки (рис. 10.2). Эти кристаллы отличаются по форме от

кристаллов исходного церулоплазмина [65].

Хикман и сотр. [66], исходя из полностью десиалилированного

церулоплазмина, сумели при помощи специфической сиалилтранс-

феразы, добытой из печени крыс, и CMP-NANA-

C ввести сиало-

вую кислоту в белок и реставрировать исходный церулоплазмин

на 75%. Авторы установили интересный факт: десиалилированный

апоцерулоплазмин оказался лучшим акцептором NANA, чем де-

сиалилированный церулоплазмин. Отсюда возникает предположе-

7—8

9 или 10

3:2

1:1[62]

24*

372

Г лава 10

кие, что в процессе биосинтеза церулоплазмина присоединение

углеводов к белку предшествует вхождению в него ионов меди.

Протоны концевых спиртовых групп асиалоцерулоплазмина мо-

гут быть замещены на тритий, что достигается последовательной

обработкой белка галактозоксидазой и боргидридом, замещенным

Рис. 10.2. Кристаллы десиалированного церулоплазмина человека [65] (Х 400).

Микрофотография Ирмин Штернлиб.

на тритий. Так же как и церулоплазмин, асиалоцерулоплазмип, ме-

ченный тритием, может быть также помечен радиоактивной медью,,

для чего применяется реакция обмена или реставрация из апофер-

мента [67]. Меченые белки были использованы при выполнении

интересных исследований, описанных ниже.

При инъекции кроликам гомогенного радиоактивного асиалоце-

рулоплазмина он удаляется из биологического кругооборота в те-

чение нескольких минут. В то же время известно, что полупериод

физиологической деятельности нативного церулоплазмина кролика

составляет 55 ч. Оказывается, асиалоцерулоплазмин захватывается

паренхимальными клетками печени и не поглощается ретикуло-эндо-

телиальной системой [67J. Такой быстрый перенос асиалоцеруло-

плазмина из плазмы в печень возможен только в том случае, если

на концах двух или большего числа полисахаридных цепей сохра-

нились остатки галактозы [68]. Если же эти остатки или окислить