Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Трансферрины.

(сидерофилины)

333

2. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА

2.1. Сывороточный трансферрин

Первые препараты сывороточного трансферрина были получе-

ны по методу Кои [16], а также фракционированием с помощью'

сульфата аммония в сочетании с осаждением этанолом [1]. Bno--

следствии стали использовать ионообменную хроматографию,

которая проще и, вероятно, мягче, чем методы, в которых исполь-

зуется спирт [17]. Последнее замечание, по-видимому, имеет неко-

торое значение, так как Шэйд [18] указывал, что некоторые пре-

параты трансферрина могут быть физиологически неактивны, хотя

их способность связывать железо остается неизменной. Самой

главной проблемой при очистке трансферрина было отделение его

от связанного с гемом сывороточного белка, гемопексина. Кристал-

лизацию сывороточного трансферрина проводили следующим об-

разом: постепенно добавляли спирт к концентрированному раство-

ру белка [19] с одновременной диффузией спирта в раствор белка

во время его концентрирования в аппарате для ультрафильтрации

[20]; кристаллы были также выделены из концентрированных

растворов при низкой ионной силе и низких значениях рН [13].

2.2. Кональбумин

Кональбумин был получен из белка куриных яиц фракциониро-

ванием с сульфатом аммония [21] или этанолом [22], а также

с помощью ионообменной хроматографии с использованием суль-

фометилцеллюлозы (СМ-целлюлоза) или сульфометилсефадекса

(СМ-сефадекс) [23]. Упрощенный метод для получения относи-

тельно больших количеств кональбумина, в котором используется

осаждение сульфатом аммония и ионообменная хроматография,

был предложен Финн и Коматчу [9]. Оба соединения — и апоко-

нальбумин и железосодержащий кональбумин — были выделены

в виде кристаллов из водно-этанольных растворов [21].

Следует отметить, что поступающие в продажу препараты ко-

нальбумина и трансферрина обычно гетерогенны и могут содер-

жать переменные количества низкомолекулярных веществ, в част-

ности хелатирующих агентов, используемых для их получения

[24].

2.3. Лактоферрин

В 1959 г. Гровс [25] детально описал процесс выделения лакто-

феррина из осажденной кислотой казеиновой фракции коровьего

молока. Этот метод состоит в использовании фракционирования

334

i лава 2

с сульфатом аммония и хроматографии на диэтиламиноэтилцел-

люлозе и позволяет выделить приблизительно 1 г белка из 60 л

молока. Гораздо более простой метод выделения лактоферрина из

женского молока был предложен Юханссоном [26]. Этот метод

состоит в прямой адсорбции протеина на СМ-сефадексе, который

добавляют к молоку. Выходы составляют от 0,5 до 1 г белка

на 1 л молока; такое повышение выхода по сравнению с тем, ко-

торый был достигнут при использовании коровьего молока, воз-

можно, связано и с различием в методике, и с большей концентра-

цией лактоферрина в женском молоке. Кристаллический лакто-

феррин можно выделить из разбавленного фосфатного буфера без

использования спирта [26].

3. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ

3.1. Аминокислотный состав

В основном данные об аминокислотном составе и определении

N-концевой аминокислоты в трансферрине и кональбумине, по

сведениям из ряда лабораторий, находятся между собой в хоро-

шем согласии (табл. 9.1) и не содержат ничего необычного. Так

как было сообщено, что кональбумин и птичий сывороточный

трансферрин имеют одинаковую белковую часть [8], можно пола-

гать, что различия в аминокислотном составе между сывороточным

трансферрином человека и кональбумином отражают видовое раз-

нообразие. Оба — и трансферрин и кональбумин, — по-видимому,

содержат только по одному концевому N-аминокислотному остат-

ку в молекуле. Иногда сообщают о присутствии небольшого коли-

чества остатков второй аминокислоты; возможно, это обусловлено

недостаточной чистотой анализируемого препарата белка или ча-

стичным гидролизом чувствительных к нему пептидных связей

[30].

По аминокислотному составу лактоферрин человека и коровии

лактоферрин заметно отличаются от соответствующих сывороточ-

ных белков. По-видимому, лактоферрин человека должен содер-

жать мало или совсем не содержать триптофана, который благо-

даря его свойствам можно обнаружить спектрофотометрическим

методом (см. ниже). Один N-концевой остаток аланина был обна-

ружен в коровьем лактоферрине [29]. Еще никак не объяснено от-

сутствие аминокислотного остатка со свободной аминогруппой

в лактоферрине человека [31]*.

* Массой (частное сообщение) недавно показал, что лактоферрин человек;

содержит 10 остатков триптофана на молекулу.

Трансферрины.

(сидерофилины)

335

Таблица 9.1

Аминокислотный состав сидерофилинов

<о£

SSa

Аминокислота

I =S

IsS

О. Г>-

о.

Т!

Но

ге о

я —<

S S

аа

SllE

S S

Ё Orn

5-оо

Ч SEl

о CX

с; Д

£§

Лизин

42 62

Гистидин

Аргинин

Аспарагиновая кислота

Треонин

Серии

41 42

Глутаминовая кислота

Пролин 31

34 31

Глицин 55 53

Алании

60 58

Цистеин

('/г цистина)

Валин

40 43

Метионин

4 11

Изолейцин

Лейцин

Тирозин

Фенилаланин

29 30

Триптофан

1 или 0

Для сравнения взята молекулярная масса 77

ООО.

Единственное сообщенное значение

молекулярной массы лактоферрина человека равно 95 000 [9].

3.2. Пептидные карты

Дальнейшие доказательства структурных различий между

трансферрином и лактоферрином были получены в результате ис-

следования пептидных карт, полученных путем протеолитического

расщепления этих белков. Интересно отметить, что когда металл

присоединен к белку, наблюдается гораздо большая устойчивость

к протеолитическому расщеплению, чем в отсутствие металла [32].

Исследование белка человека показало, что в двумерных картах

336

i лава 2

триптического расщепления обнаруживается гораздо меньше пеп-

тидов, чем можно было бы ожидать на основании известного

числа имеющихся остатков лизина и аргинина [27]. Значение это-

го наблюдения будет обсуждаться в разделе, посвященном субъ-

единичной структуре трансферрина.

3.3. Углеводный состав и структура

Все известные сидерофилины правильно классифицировать как

гликопротеины. Трансферрин содержит около 5% углевода, кото-

рый расположен в двух разветвленных цепях, идентичных по со-

ставу и оканчивающихся остатком сиаловой (N-ацетилнейрамино-

вой) кислоты и, возможно, присоединенных к полипептидной цени

аспарагинильными связями [33]. Концевые остатки сиаловой кис-

лоты могут быть полностью удалены обработкой нейраминидазой

[34]. Сообщалось, что трансферрин, дефицитный по нейраминовон

кислоте и, возможно, другим углеводам, находится в крови пупо-

вины и цереброспинальной жидкости [35]. После удаления сиало-

вой кислоты из трансферрина с помощью нейраминидазы белок

может служить субстратом для галактозоксидазы, что указывает

на присоединение нейраминовой кислоты концом к галактозе с об-

разованием углеводных целей [36].

Хотя, по-видимому, кональбумин и сывороточный трансферрин

домашних птиц идентичны по своему аминокислотному составу,

иммунохимической реакционной способности и структуре пептидов,

в их углеводных компонентах замечены отчетливые различия.

В гликопептиде яичного белка не обнаружено ни сиаловой кисло-

ты, ни галактозы. В отличие от сывороточного белка человека

в белках птиц углевод, по-видимому, должен находиться в одной

цепи [37].

Было показано, что лактоферрин человека содержит околс

6,6% углевода, расположенного в трех цепях, каждая из которых

оканчивается остатком сиаловой кислоты и содержит один или двг

остатка фукозы, шесть остатков гексозы и четыре остатка N-ацет

глюкозамина [38]. Представлены также доказательства того, чтс

углеводные цепи связываются с белковой частью при помощи гли

козидной связи к гидроксильной группе треонина. Углеводный со

став коровьего лактоферрина, по-видимому, аналогичен со

ставу белка человека, за исключением того, что в нем обнаруже1

только один остаток сиаловой кислоты на молекулу [25].

Функциональная и структурная роль углеводных частей сидеро

филинов еще не выяснена. По-видимому, удаление сиаловой кисло

ты из трансферрина не влияет на ее металлсвязывающие свойств;

и на ее способность служить донором железа для ретикулоцито

[39].

Трансферрины (сидерофилины)

337

3.4. Иммунохимия

Все сидерофилины — антигены. Кональбумин и трансферрин,

полученные из яичного белка и сыворотки домашних птиц, имму-

нохимически идентичны, хотя они синтезируются в разных местах

[8]. В отличие от этого нет перекрестной иммунореактивности

между трансферрином из сыворотки человека и лактоферрином

человека [40]. Это почти определенно указывает на то, что белки

структурно не родственны один другому, за исключением их спо-

собности связывать металл, и что белки молока не являются про-

изводными белков крови.

4. ОСНОВНЫЕ ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

4.1. Молекулярная масса

Более ранние определения молекулярной массы сывороточного

трансферрина с помощью ультрацентрифугирования дали значе-

ния, изменяющиеся от 68 ООО до 93 ООО. Недавно проведенные ис-

следования показали, что молекулярная масса изменяется от 75 ООО

до 80 000 дальтон [27]. В растворах нативного трансферрина не

наблюдается тенденции к образованию агрегатов или диссоциации

[27]. Молекулярная масса не зависит от того, насыщен ли транс-

феррин железом, наполовину насыщен или вовсе не содержит же-

леза [41].

Кональбумин и лактоферрин изучены в меньшей степени, чем

трансферрин. Наиболее точная оценка молекулярной массы ко-

нальбумина, определенная по его способности связывать железо,

дала значение около 76 000 дальтон [42]. Методом седиментацион-

ного равновесия для коровьего лактоферрина получена молекуляр-

ная масса 77 100 [29], для лактоферрина человека исследованием

связывания железа получено значение 80 000 [43], а методом оп-

ределения скорости седиментации при ультрацентрифугировании

[11]—значения 95 000 [11] и 82 000 [14].

4.2. Оптические свойства

В табл. 9.2 приведены молярные коэффициенты поглощения

комплексов трансферрина в ультрафиолетовой и видимой обла-

стях. Особенно интересным является увеличение поглощения в уль-

трафиолетовой области при связывании ионов металла ,[44];

причина этого увеличения будет рассмотрена ниже.

При связывании с ионами металла наблюдается гашение флуо-

ресценции триптофана в трансферрине [46].

22—2451

338

i лава 2

Таблица 9.2

Молярные коэффициенты поглощения сывороточного трансферрина человека

Белок

нм

Литература

Сывороточный апотрансферрин человека

280

11,4 9

Комплекс сывороточного трансферрина

человека

с Fe

280

14,3

470 0,57

с Cr

280

12,75

440

0,22

615

0,18

с Со

280

14,3(45)

405

1,2

9, 44

с Mn

280

14,3

330

1,3

430

1,2

4.3. Гидродинамические свойства

Основываясь на измерении диэлектрической дисперсии и внут-

ренней вязкости, молекулу трансферрина в водном растворе ап-

проксимируют вытянутым эллипсоидом вращения с отношением

главных осей 3,0: 4,5 [27, 47]. Так как связывание с ионами ме-

таллов либо вообще не вызывает, либо вызывает небольшое из-

менение внутренней вязкости и совсем не изменяет диэлектриче-

ские свойства [28, 48], можно предположить, что геометрия и

гидратация молекулы при связывании с ионом металла существен-

но не изменяются.

Измерения зависимости скорости протонной релаксации от

частоты в растворах трансферрина позволили заключить, что при-

близительно только 13 (или 2%) молекул воды в первой гидрат-

ной оболочке белка связаны относительно прочно (невращатель-

но); это число увеличивается на два, когда белок насыщен метал-

лом [49, 50].

На том основании, что скорость обмена водорода в апокональ-

бумине больше, чем в комплексе белка с металлом, Улмер [51]

предположил, что белок, насыщенный металлом, имеет более ком-

пактную конформацию.

Трансферрины (сидерофилины)

339

4.4. Субъединичная структура

Можно ожидать, что белок с двумя специфическими центрами

и двумя идентичными углеводными цепями построен из двух субъ-

единиц. Для выяснения этого было поставлено множество экспе-

риментов в ряде лабораторий. Джеппсон [52] сообщил, что вос-

становленный алкилированный трансферрин после высушивания

и повторного растворения диссоциирует на субъединицы с молеку-

лярной массой 39 000—42 000, как было определено методом рав-

новесного центрифугирования. Исследование восстановленного

алкилированного трансферрина независимо в лабораториях

Безкоровайного [53] и Финн [54] не подтвердили диссоциацию на

субъединицы. Впоследствии Безкоровайный [55] при изучении

восстановленного алкилированного и сульфитолизированного

трансферрина и кональбумина вновь не получил данных, свиде-

тельствующих о субъединичной структуре этих соединений. Дейст-

вительно, измерения вязкости обработанного трансферрина

в присутствии 8 M раствора мочевины показали только тенденцию

к образованию агрегатов [55]. Недавно проведенное тщательное

исследование вопроса о субъединичной структуре трансферрина

с использованием методов седиментационного равновесного цент-

рифугирования, измерения внутренней вязкости и гель-фильтрации

в 6 M гидрохлориде гуанидина подтвердило одноцепочечную при-

роду сывороточного трансферрина человека [27]. Если бы субъ-

единицы действительно существовали, они должны были бы соеди-

няться необычными и еще неизвестными связями. В свете имею-

щихся данных заманчивым выглядит предположение о том, что

структурный ген для трансферрина в ходе эволюции подвергся

дубликации и последующему делению [27, 54].

5. МЕТАЛЛСВЯЗЫВАЮЩИЕ ЦЕНТРЫ

5.1. Существует ли взаимодействие

между связывающими центрами?

После выделения относительно чистого трансферрина и кональ-

бумина удалось установить, что каждый белок способен специфи-

чески и прочно связывать два атома железа [1]. Было также по-

казано, что для развития характерной красной окраски требуется

двуокись углерода или одна из ее ионизированных форм [5]. Шэйд

и сотр. [5] смогли показать, что для полного развития окраски на

каждый связанный атом железа требуется один бикарбонатный

ион. При этом два или три протона выделяются в раствор.

Количественное изучение механизма комплексообразования

железа с кональбумином было предпринято Вернером и Вебером

22*

340

i лава 2

[42], которые установили, что связывание каждого атома железа

при рН от 7,5 до 9,5 сопровождается освобождением в раствор

трех протонов, а связывание с медью вызывает выделение двух

протонов. Хотя трудно определить, не освобождаются ли эти про-

тоны в результате гидролиза иона металла, претерпевающего свя-

зывание, представляется довольно вероятным, что они действитель-

но вытесняются из белка в процессе связывания, в частности

изучение равновесия связывания при несколько различающихся

значениях рН согласуется с этой точкой зрения [56]. Так как при

связывании двухвалентного катиона освобождаются два протона,

а при связывании трехвалентного иона — три, общий заряд белка

не изменялся бы, если бы никакие другие заряженные частицы не

участвовали в связывании. Однако измерение свободной электро-

форетической подвижности обнаружило повышение анионной

подвижности, соответствующее увеличению общего отрицательного

заряда белка на единицу на каждый связанный атом железа [42].

На основании этого факта, а также опытов Шэйда с сотрудника-

ми, пришли к заключению, что бикарбонатный ион является той

формой, в которой двуокись углерода принимает участие в металл-

связывающей функции трансферрина и кональбумина. Впослед-

ствии Массой и Хереманс [43] показали, что аналогичные явления

происходят при связывании железа и меди лактоферрином.

Таким образом, связывание первого и второго атомов железа

сидерофилинами можно представить следующими уравнениями:

+ + H

Tfn + HCO

<—^ [Fe

Tfn

-HCO

+ ЗН+ (1)

+ + [Fe

Tfn-HCO

]" + HCOjT "<—* [(Fe

)

Tfh-(HCO

)

]=-

-f

ЗН

(2)

Такая формулировка послужила поводом к одному из наиболее

интересных и горячих споров в химии и физиологии сидерофили-

нов. Используя цитрат в качестве агента, конкурирующего за же-

лезо с сидерофилинами, и измеряя окраску растворов кональбуми-

на, в которых термодинамическая активность железа изменялась

при изменении концентрации цитрата, Вернер и Вебер [42] при-

шли к заключению, что связывание железа кональбумином осу-

ществляется в две стадии, причем вторая константа устойчивости

гораздо больше, чем первая. Шэйд [57], исходя из нетермодина-

мических наблюдений за скоростью поглощения железа из белка

клетками печени, предложил такой же способ освобождения желе-

за из трансферрина. И, наконец, Вудворт [58] на основе измере-

ния кинетики связывания железа получил новые аргументы в поль-

зу двухступенчатого механизма связывания железа кональбуми-

ном. Следовательно, до последнего времени преобладало мнение,

что все время два атома железа входят и выходят из молекулы

сидерофилина, так что стабильные частицы в растворе должны

Трансферрины.

(сидерофилины)

341

либо вовсе не содержать, либо содержать 2 атома железа на мо-

лекулу сидерофилина.

В 1963 г. Мальмстрём с сотр. [56] опубликовал серию работ,

в которых изложил результаты тщательно выполненных экспери-

ментов с использовании классического термодинамического метода

равновесного диализа, дополненного методом электронного пара-

магнитного резонанса. Уделяя особое внимание тому, чтобы пока-

зать, что равновесие действительно достигается, и обрабатывая

свои данные новым методом графического анализа, эти исследова-

тели заключили, что связывание железа трансферрином можно

описать, предположив участие в связывании двух эквивалентных

невзаимодействующих центров. Если это так, то напрашивается

вывод, что трансферрин в растворах не полностью насыщен желе-

зом и должны сосуществовать три типа белковых частиц: частицы

с двумя связанными атомами железа, частицы только с одним свя-

занным атомом и частицы, не содержащие металла [59]. Вернер

и Вебер [21] на основании электрофоретических диаграмм, скорее

интуитивно, различили три типа молекул в неполностью насыщен-

ных железом растворах кональбумина. Однако они не сопоставили

это наблюдение со своими заключениями, сделанными на основа-

нии исследования равновесия. Позднее это предположение было

детально подтверждено для трансферрина с помощью фронтально-

го электрофореза методом движущейся границы [59], а оконча-

тельно для кональбумина методом изоэлектрического фокусирова-

ния [60]. Было высказано предположение, что частицы, обладаю-

щие промежуточной подвижностью при электрофорезе и в опытах

по изоэлектрическому фокусированию, могут представлять собой

димер апопротеина и белка, насыщенного железом [61]. Однако

позднее было доказано, что это предположение несостоятельно

[41].

Вся сумма имеющихся в настоящее время данных подтвержда-

ет мнение о том, что термодинамические константы, описывающие

связывание железа с трансферрином, внутренне идентичны. По-

вторное изучение методом равновесного диализа связывания желе-

за кональбумином также показало большое сходство в связыва-

нии металла этим белком и трансферрином [62]. По-видимому,

более ранние данные Вернера и Вебера были получены до дости-

жения равновесия, так как в этих опытах проходило только 18 ч

между добавлением железа к раствору апокональбумина и време-

нем наблюдения; проведенное позднее исследование зависимости

от времени показало, что для достижения истинного равновесия

требуется по крайней мере несколько дней [56]. Физиологическое

исследование Шэйда не содержало термодинамических измерений

и поэтому не противоречит предшествующим результатам. Коли-

чественных данных о связывании железа с лактоферрином в на-

стоящее время не имеется.

342

i лава 2

5.2. Значение констант связывания

Существуют некоторые разногласия по поводу значения чисел,

полученных при измерении связывания металла с сидерофилинами

методом равновесного диализа. Константы связывания Ki и K

характеризуют химические реакции, представленные выше уравне-

ниями (1) и (2), и записываются в следующем виде [55]:

[Fe

Tfn - НСОз

]

Ai - [Fe

+] [H

Tfn] [НСОз]

„ [(Fe^)

Tfn(HCO

)I-] [Н+р

Л2 _

[Fe

Tfn•

НСО3]

[НСОз]

Так как на каждый атом связанного железа освобождаются три

протона, а связывается один бикарбонатный ион, каждая из истин-

ных термодинамических констант прямо пропорциональна третьей

степени концентрации ионов водорода и обратно пропорциональна

концентрации бикарбонат-иона в растворах, в которых выполняют-

ся измерения. Статистическое рассмотрение показывает, что, если

два специфических связывающих центра эквивалентны и независи-

мы, отношение Ki к K

должно быть равно четырем.

При фиксированных значениях рН и активности бикарбонат-

иона вклады этих составляющих в уравнения связывания можно

учесть в выражении для кажущихся констант равновесия следую-

щим образом [56]:

[НСО3] ^iPCO

ZCco

Ki (const. рН, рС0

) = •—jj^+p— = jjpji (5)

где Kco

— соответствующая константа гидратации CO

или иони-

зации карбоновой кислоты. Так как активность бикарбонат-иона

находится в обратной зависимости от рН, в этом выражении

должна быть отражена зависимость кажущейся константы от чет-

вертой степени концентрации ионов водорода, при которой иссле-

довалось равновесие, и прямая зависимость от парциального

давления двуокиси углерода в атмосфере, в равновесии с которой

они находятся. При относительно фиксированных значениях рН и

рС0

, которые преобладают в кровеносной системе человека, ка-

жущееся значение Ki составляет примерно IO

-1

. Учитывая все

изложенное, можно показать, что атому железа потребуется при-

близительно 10 000 лет, чтобы самопроизвольно отделиться от мо-

лекулы трансферрина в крови [63]. Из величин, которые исполь-

зуются для количественного описания связывания металлов

с трансферрином, по-видимому, наиболее важны с точки зрения

физиологии кажущиеся константы устойчивости.