Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ляемые и неуправляемые опирается на глубину и

масштабность контроля, осуществляемого с применением средств

автоматики и ЭВМ. К числу неуправляемых процессов можно

отнести спонтанно протекающие компостирование плотных отхо-

дов в животноводческих комплексах и фермах. К управляемым

относятся все производственные процессы, основанные на исполь-

зовании микробных, растительных и животных клеток. При этом

уровень управления может быть двояким — операторским и

автоматическим.

первом случае поддержание заданных режимов

осуществляет оператор, во втором — соответствующие контроль-

но-измерительные приборы, автоматы, ЭВМ.

Некоторые авторы (Ф. X. Дейндорфер, 1960) подразделяют

биотехнологические процессы по типу на простые, совместные,

последовательные и ступенчатые. Под простыми понимается

трансформация питательных веществ в продукты метаболизма без

накопления интермедиатов при наличии строго определенной

стехиометрии в утилизации субстрата (или клеточном росте) и

образовании метаболита. Скорость образования метаболита можно

выразить следующим уравнением: г/

= - Y

/s, где г — скорость,

/р — контролируемый продукт метаболизма,

—

коэффициент

отношения метаболита (р) к субстрату (s). В молярном выражении

коэффициент Y составляет:

YP/

, где p/s — число молей

йп

метаболита, образующегося на

моль использованного субстрата,

—

метаболит, n

— число атомов углерода в молекуле субстрата,

а-число

молекул субстрата, л

-число атомов углерода в молекуле

продукта. Кинетика простого процесса сопряжена с ростом клеток.

Примером такого процес са является получение этанола из глюкозы

при спиртовом брожении.

Совместными процессами считаются те из них, в которых

имеет место превращение питательных веществ в продукты мета-

болизма без накопления интермедиатов, но с возможным измене-

нием стехиометрии процессов. Следовательно в таких случаях

стехиометрию можно выразить только с помощью уравнения

реакции конечного продукта. Нередко скорость образования ме-

таболита принимается пропорциональной концентрации клеток, а

не скорости их размножения. В качестве примера такого типа

процессов можно назвать молочнокислое брожение.

245

Последовательные процессы биохимической технологии

характеризуются накоплением интермедиатов в ходе трансформа-

ции питательных веществ в целевые продукты. Это имеет место,

например, при ацетоно-бутиловом брожении, когда вначале из

глюкозы образуются интермедиаты — ацетат и бутират, которые

затем (наряду с глюкозой) превращаются в конечные продукты —

ацетон и бутанол.

При ступенчатых процессах биологической технологии

питательные вещества вначале полностью трансформируются в

интермедиат (и эта трансформация протекает избирательно в

какой-либо определенной последовательности) и лишь после этого

образуется конечный продукт. Пример — биосинтез лимонной

кислоты.

6.2. Значение асептики в биотехнологических процессах. Би-

отехнологические процессы, как правило, проводят в асептичных

условиях, хотя могут быть исключения для некоторых из них.

Например, при культивировании отдельных эукариот (дрожжи) в

негерметизированных ферментаторах (нестерильный процесс)

происходит заметное снижение рН среды, где доминирующее

положение дрожжей не изменяется при попадании контаминиру-

ющих бактерий (от лат. contaminatio — загрязнение, заражение,

смешение)

—

они не могут составить конкуренции основному виду.

Асептика

(от

греч.

а—не, нет, sepsis—гниение)

—

это комплекс

мероприятий, направленных на предотвращение попадания в среду

(объект) посторонних микроорганизмов, включая болезнетворные.

Следовательно, асептика в биологической технологии

и,

например,

в хирургии — это не одно и то же понятие. В первом случае

предполагают использование какого-либо биообъекта (в том числе

— микроба) и полное исключение попадания других микроорга-

низмов, являющихся загрязнителями. Во втором случае стремятся

исключить любую возможность попадания патогенных микробов

и микробов — контаминантов на операционное поле или в рану.

Каждый из материальных потоков в биотехнологических про-

цессах — потенциальный источник микробов — контаминантов.

Асептика может включать влажную уборку помещений, обра-

ботку их ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средства-

ми,

использование стерильных инструментов, сред, технологичес-

246

кой одежды, подачу стерильного воздуха (столы с ламинарным

потоком стерильного воздуха в боксированных помещениях, по-

ступление в ферментатор стерильного воздуха через барботер —

от франц. barbotage — перемешивание) и пр. Следовательно

комплекс мер, обеспечивающих асептику биотехнологических

процессов, включает: механическую, физическую и химическую

защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости —

и конечный продукт. К механической защите относятся: удаление

механических примесей, например, из воздуха, культиваторов,

герметизация оборудования, изоляция узлов и соединений; к фи-

зической — обработка воздуха и поверхностей приборов и аппа-

ратов ультрафиолетовыми

лучами,

кипячение, стерилизация паром

под давлением, обработка ультразвуком; к химической — обработ-

ка поверхностей химическими антисептиками.

В производственных условиях источниками микробов-конта-

минантов могут быть почва, вода, окружающий воздух, люди. Из

почвы в сферу биотехнологических процессов попадают спорооб-

разующие палочки-бациллы, конидии грибов, актиномицеты; эти

же микроорганизмы с пылью могут попасть в воздух, через по-

средство которого они способны проникнуть в среду выращивания

биообъекта или в конечный продукт производства.

Качественный состав и размеры частиц в воздушной пыли

колеблются в широких пределах.

производственных помещениях

это зависит от конструкционных особенностей здания, розы вет-

ров,

географической зоны расположения города и предприятия,

наличия или отсутствия потоков автомобильного и другого транс-

порта, количества непосредственно занятых в технологическом

процессе людей, характера и локализации складских помещений

и т. д.

Образующиеся пыль или/и капельки влаги в воздухе, как

правило, содержат на своей поверхности слой адсорбированного

воздуха и большее или меньшее количество микроорганизмов.

Газовая оболочка предохраняет частицы от смачивания. Такие

частицы представляют собой дисперсную фазу аэрозоля, устойчи-

вость которой зависит от размеров (величины) частиц, их элект-

рического заряда и поверхностной энергии. Необходимо помнить,

что в случае нахождения на частицах аэрозоля микробных клеток,

то их отрицательный электрический заряд будет привносить свою

247

долю в общий заряд частицы. Опираясьлишь на величину аэрозоля,

содержащего микроорганизмы, можно выделить три фазы его:

крупноядерную (диаметр частиц более 100 мкм), мелкоядерную

(диаметр частиц менее 100 мкм) и фазу бактериальной пыли

(диаметр частиц от 1 мкм до 100 мкм). Частицы крупноядерной

фазы в течение нескольких секунд оседают из воздуха, тогда как

частицы двух других фаз могут длительно находиться в воздухе,

образуя устойчивую коллоидную систему. В таблице 26 представ-

лены данные о скорости седиментации частиц в воздухе и, для

сравнения, в воде.

Т а б л и ц а 26. Седиментационная скорость (мкм/с) для сферических частиц в

воздухе при нормальных температуре и давлении

(18°с,

1,01*10

Па)

и в воде при 2ГС

Диаметр частиц, мкм

0,1

1,0

5,0

10,0

В воздухе

1,0

42,0

960,0

3650,0

В воде

0,001

0,11

2,8

11,1

Бактериальная пыль может формироваться из первых двух фаз

после их высыхания и повторного попадания в воздух. В разряд

частиц с диаметром от 0,001 мкм до 1 мкм подпадают вирусы и

некоторые бактерии. Аэрозоли могут быть вредными и для чело-

века не только из-за микробов, находящихся на частицах пыли или

капельках жидкости, но и сами по себе вследствие проникновения

в альвеолы дыхательной системы с последующим расстройством

ее функций. В таком понимании вредными являются следующие

аэрозольные частицы: асбеста, алебастра, абразивного порошка,

графита, гипса, диоксида титана, дорожной

пыли,

извести, каолина,

корунда, карбида кремния, мрамора, оксида олова, стекловолокна

и др. В альвеолы проникают частицы размером менее 3 мкм при

скорости потока вдыхаемого воздуха уже около 1 см/с.

По степени загрязненности воздуха микробами и механически-

ми частицами в расчете на 1м

производственные помещения, в

которых асептично изготавливают лекарственные средства, клас-

сифицируют по классности следующим образом:

1-й класс чистоты с ламинарным потоком стерильного воздуха

— для изготовления стерильных лекарств — не должно быть

микробов, а механических частиц размером до 0,5 мкм — не более

3500;

248

2-й класс чистоты — до 50 микробных клеток, до 2500 частиц

размером 5 мкм и до 350000 частиц размером 0,5 мкм;

3-й класс чистоты — до 100 микробных клеток (ЗА класс — до

200 и ЗБ класс — до 500 клеток), до 25000 частиц размером 5 мкм

и до 3500000 частиц размером 0,5 мкм;

4-й класс чистоты — по ГОСТ 12.1.005 — 86.

Для помещений 2-го и 3-го классов чистоты, в которых изго-

тавливают нестерильные лекарственные средства, нормирование

воздуха по содержанию механических частиц не предусматрива-

ется.

Лекарственные средства по "микробной чистоте" разделяют на

4 категории: 1) стерильные препараты для инъекций, приготовлен-

ные на апирогенной воде;

2) глазные лекарства, препараты для введения в закрытые

полости тела, средства для лечения обширных ожогов и открытых

ран не должны содержать живых микроорганизмов — они также

относятся к разряду стерильных;

3) лекарственные средства для наружного применения и для

введения в открытые полости не должны содержать более 100

живых микробных клеток в 1 г(мл) препарата и при безусловном

отсутствии в них бактерий, относящихся к семейству

Enterobacteriaceae, а также Pseudomonas aeruginosa и

Staphylococcus aureus;

4) все прочие лекарственные средства должны содержать в 1

г (1мл) не более 1000 жизнеспособных бактериальных клеток сап-

рофитов и не более 100 клеток непатогенных грибов при отсутст-

вии болезнетворных и условно патогенных микроорганизмов,

включая энтеробактерии, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus

aureus, аспорогенные дрожжи рода Candida.

Работающие в помещениях различной степени чистоты должны

одевать рекомендуемую и пригодную для таких целей технологи-

ческую одежду (согласно требованиям системы GMP — см.). Так,

в помещениях первого класса, где кратность обмена воздуха в час

600—200, одевают стерильный костюм, головной убор должен

полностью закрывать волосы, включая бороду, и заворачиваться

под ворот костюма; на лицо одевается маска во избежание попа-

дания частиц и капель в окружающую среду; на руки одевают

стерилизованные без сыпучих материалов перчатки из каучука

или пластичных материалов, на ступни - стерилизованную или

продезинфицированную обувь, включая бахилы. Низ брюк подво-

249

рачивают в обувь (как и рукава костюма — в перчатки). От

защитной одежды не должны попадать в воздух частицы и волокна,

а сама она должна задерживать частицы, исходящие с тела опера-

тора. Указанная одежда должна быть разового использования или

использоваться в течение одного дня, если результаты проверки

подтверждают такую возможность. Перчатки рекомендуется по-

стоянно дезинфицировать во время операций, маски и перчатки

необходимо менять перед каждой рабочей процедурой. Стериль-

ную зону желательно проектировать таким образом, чтобы все

операции можно было наблюдать извне. В рабочих зонах таких

помещений все открытые поверхности должны быть гладкими,

непроницаемыми, неразбитыми, удобными для очистки и дезин-

фекции, где и когда это необходимо, без труднодоступных высту-

пов и углублений, полок, шкафов, излишнего оборудования, раз-

движные двери здесь нежелательны из-за возможности скопления

пыли в пазах; сточные и канализационные трубы не должны

проходить в стерильных зонах. Комнаты для смены одежды необ-

ходимо проектировать и строить с воздушными шлюзами, снабжа-

ющимися стерильным воздухом. Двери с воздушными шлюзами

не должны открываться одновременно; между шлюзами должна

быть система для визуального или аудиоконтроля (от лат. visus —

зрение, auditus

—

слух, слышание). Мытье рук и средства для этого

должны быть только в комнате для' смены одежды.

В рабочие помещения должен подаваться стерильный воздух

под положительным давлением.

В помещениях второго класса чистоты с кратностью обмена

воздуха 20—60 следует одевать гладкий (без складок), не отделяю-

щий ворса, комбинезон, стянутый на поясе, с манжетами, плотно

облегающими щиколотки ног; на голову необходимо одевать шлем-

капюшон, полностью закрывающий волосы, нос и подбородок; на

лицо — маску, не отделяющую ворса; на руки — резиновые (или

из эластичных полимеров) перчатки, на ноги — стерильную или

продезинфицированную обувь, поверх которой рекомендуется

одевать бахилы, полностью закрывающие ступню. Нижняя часть

брюк должна заправляться в бахилы, а рукава комбинезона — в

перчатки. Ни одна часть тела или разрешенного для использования

нижнего белья не должна быть открыта.

В помещениях третьего класса чистоты с кратностью обмена

воздуха 1—15 рекомендуется одевать не отделяющий ворса ком-

бинезон или куртку с собранными рукавами на запястьях и

250

воротником-стойкой, шапочку или косынку, брюки, бахилы и

маску.

В помещениях четвертого класса чистоты рекомендуется оде-

вать комбинезон, или куртку и брюки, или халат, шапочку или

косынку из хлопчатобумажных или льняных тканей.

Вот почему важно глубоко продумывать размещение помеще-

ний в производственных зданиях (особенно — для стерильных

лекарств).

С водой в сферу технологического процесса могут попасть

грамотрицательные бактерии из групп энтеробактерий, псевдомо-

насов и некоторых других. В природных открытых водоемах

обнаруживаются целлюлозоразрушающие, нитрифицирующие и

денитрифицирующие бактерии, цианобактерии, аммонификато-

ры,

железобактерии и многие другие. Лишь вода артезианских

колодцев, глубоких скважин и родников отличается высокой чис-

тотой. Следует помнить, что чем больше вода загрязнена органи-

ческими веществами, тем больше в ней содержится микробов.

По степени загрязненности открытых водоемов различают 3

зоны сапробности (от лат. saprotes — гниль, гниение): полиса-

пробная — сильно загрязненная, содержащая в

мл несколько

миллионов микробных клеток, включая гнилостные и кишечные

бактерии; мезосапробная — умеренно загрязненная,

содержащая в 1 мл до 100000 микробных клеток с преобладанием

аэробных видов; олигосапробная — зона чистой воды,

содержащей в 1 мл не более 1000 микробных клеток из предста-

вителей железо-, серобактерий и некоторых других видов. Поли-

сапробные зоны характерны для рек, протекающих по населенным

пунктам или вблизи них, и где в воду попадают жидкие отходы из

крупных свиноводческих ферм, канализационные стоки и стоки

промышленных предприятий. В такой воде могут быть санитарно-

показательные (Е. coli, Streptococcus faecalis), условно патогенные

псевдомонасы, протей и другие виды, а также болезнетворные

микроорганизмы из группы энтеробактерий.

Седиментационная устойчивость бактерий в воде достаточно

выраженная (см. таблицу 26). Следует также иметь в виду и

минимальные значения активной воды (a

) для различных микро-

организмов, под которой понимают отношение давления паров

раствора (V

) к давлению паров чистой воды (V

aw =

^j—

(таблица 27).

251

Т а б л и ц а 27. Минимальные значения a

для микроорганизмов

Группа микробов-сапрофитов

Мезофилъные бактерии

Галофильные бактерии

Психрофильные бактерии

Дрожжи

Нитчатые грибы

Осмофильные дрожжи

Нитчатые грибы — ксерофиты

Минимальные значения aw

0,91

0,75

0,88

0,62

0,93

0,60

0,65

Для сырья опасным уровнем влажности

при

длительном хра-

нении является показатель

превышающий 0,6, реже — 0,7.

С учетом всех характеристик необходимо осуществлять подго-

товку воды для использования

ее в

биологической технологии.

Люди, занятые

биотехнологическом производстве, также

могут быть источником контаминирующей микрофлоры

— гра-

мотрицательных бактерий, кокков, микоплазм, вирусов и

др.

Толь-

ко

на

поверхности кожи может сосредоточиваться

до

микро-

бных клеток. Наиболее загрязненными являются кисти рук, ступ-

ни,

локти, шея, грудь, промежность, паховые области. Разнообраз-

на

многочисленна микрофлора ротовой полости: бактериальные

и кокковые формы, вибрионы, спириллы

спирохеты, нокардии,

дифтероиды, протозоиные организмы, аспорогенные дрожжи рода

Candida, микоплазмы, вирусы и

др.

При разговоре, кашле, чихании

микробы

большом числе попадают

воздух. Установлено,

что

здоровый человек

за

одно чихание выделяет

до

20000 микробных

клеток, способных распространяться

по

горизонтали,

среднем,

до

1,5 м.

Капельки носовой слизи, слюны

мокроты, подсыхая,

образуют частицы, покрытые белковой

или

гликопротеиновой

оболочкой,

содержащие микробные клетки.

таких частицах

микроорганизмы длительно сохраняются

могут являться причи-

ной нестерильности материалов (объектов)

на

каких-либо техно-

логических операциях.

Источником микробов-загрязнителей могут быть некоторые

компоненты питательных сред, например, кукурузный экстракт

(фаги, дрожжи

др.).

Растительные вирусы часто выявляются в культурах каллусных

тканей; высокую озабоченность

этом смысле вызывают также

культуры клеток животных тканей

клеток человека, будучи

исключительно благоприятными средами

для

контаминирующей

микрофлоры.

252

Микробы-контаминанты не только могут подавить развитие и

функции биообъекта в силу конкуренции и антибиоза, но и

дезорганизовать какую-либо ткань — среду выращивания; более

того,

некоторые из них способны продуцировать токсические

вещества, которые могут попасть в целевой продукт (равно как и

сами микробы-загрязнители).

6.3.

Борьба с микробами-контаминантами в биотехнологиче-

ских производствах. Защита биотехнологических процессов от

микробов-контаминантов эффективно осуществляется с помощью

различных фильтров. В последнее десятилетие широкое распрост-

ранение приобрела мембранная фильтрация в целях получения

стерильных воздуха и различных жидкостей (разновидность хо-

лодной стерилизации). Более того, мембраны нашли применение

в рДНК-биотехнологиии, в дисперсионном и других анализах

биомолекул. Многие термолабильные вещества стерилизуют таки-

ми же способами. Следовательно, мембранная фильтрация может

рассматриваться как самостоятельный (лабораторный или про-

мышленный) процесс.

В биологической технологии, независимо от условий проведе-

ния процессов (поверхностно и глубинно, в периодическом, полу-

непрерывном и непрерывном режимах, в виде твердофазных или

газофазных процессов, одно-, двух- и полиступенчато), широко

используют стерильный воздух, подаваемый: в ферментаторы для

аэробных организмов (клеток, клеточных систем); в специальные

помещения в виде ламинарных потоков для асептичного приготов-

ления лекарственных средств, в боксы и операционные виварии,

в распылительные сушилки для высушивания некоторых веществ,

в шлюзы между (перед) асептическими блоками. Стерилизующая

мембранная фильтрация здесь оказывается наиболее приемлемой.

Промышленный выпуск мембранных фильтров был начат с

конца 40-х годов текущего столетия. Согласно Р. Е. Кестингу (1971)

наиболее распространенными процессами фильтрации являются

обычная фильтрация (ее можно назвать макрофильтрацией, Н. Е.),

микрофильтрация, ультрафильтрация, диализ (и обратный осмос).

Для макрофильтрации применяют обычно бумажные или стеклян-

ные фильтры. При этом отделяют частицы, размеры которых

находятся в пределах от

до

мкм.

Для других типов фильтрации

используют нитроцеллюлозные, ацетилцеллюлозные, поливиниль-

ные,

полиамидные, фторуглеводородные мембраны толщиной ме-

нее 0,1 мкм с высокой степенью пористости и с диаметром пор в

253

пределах от 10'

до 10 мкм. В случаях микрофильтрации отделяют

частицы размерами 2« 10"

—10 мкм, в случаях ультрафильтрации

размеры отделяющихся при этом макромолекул находятся в при-

мерных пределах от 0,001 до 0,02 мкм, а их молекулярные массы

соответствуют

1—1000

кДа.

При диализе через мембраны отделяют небольшие молекулы,

сопоставимые по размеру с молекулами растворителя (10"

мкм и

менее, или до 1 нм). Здесь вещества разделяются вследствие

различных скоростей диффузии через мембрану.

Осмос относится к разряду молекулярно-диффузионных про-

цессов, когда через мембрану переносится не вещество (из области

высокой концентрации в область низкой концентрации), а раство-

ритель. Если заставить двигаться растворитель в обратном направ-

лении через мембрану, то это и будет обратный осмос. Превысить

осмотическое давление в подобных случаях удается с помощью

внешнего повышенного давления. Обратный осмос рекомендуют

обычно для понижения концентрации молекул или ионов в водных

растворах (таблица 28).

случаях стерилизации растворов фильтрованием они должны

содержаться перед розливом и при последующем розливе в асеп-

тичных условиях. При этом необходимо помнить и следить за тем,

чтобы время между началом приготовления раствора и его стери-

лизацией фильтрованием должно быть возможно кратким.

Для очистки растворов от бактерий-контаминантов в США,

например, выпускают в продажу так называемый Criti Сар-капсу-

лы,

содержащие двойной слой гидрофильной полисульфоновой

микропористой (диаметр пор 0,2 мкм) мембраны, обеспечивающей

задерживание бактерий при высоком потоке жидкости.

Если применяют какой-либо газ для очистки раствора, то он

перед использованием должен подвергаться фильтрующей стери-

лизации.

случаях, когда целевой продукт в виде раствора или жидкости

нельзя стерилизовать упакованным в контейнеры, то его фильтру-

ют через стерильный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм.

При обнаружении вирусов и/или микоплазм в растворе (жидко-

сти),

стерилизуемом (-ой) фильтрованием необходимо предусмот-

реть возможность использования дополнительного метода стери-

лизации (физического или химического).

Нельзя применять асбестовые фильтры для стерилизации инъ-

екционных лекарственных форм.

254