Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

митомицин С

ОС О

Производные акридина (акридиновый оранжевый

—

АО,

проф-

лавин) и некоторые производные изохинолина (бромистый этидий)

вызывают удлинение нитей ДНК (растяжение) на 1-2 нуклеотида,

что приводит в итоге к выпадению или вставке мононуклеотида

(прямые мутации).

Некоторые антибиотики

—

как мутагены

обладают различными механизмами дейст-

вия. Так, например, митомицин С подобен

алкилирующим агентам. Он расщепляет

двойную спираль ДНК за счет образования

перекрестных связей. Антибиотики из груп-

пы актиномицинов (в частности, актиноми-

цин

Д,

или дактиномицин), являющиеся ди-

олигопептидилактиномицинами,

ингибируют ДНК-зависимый

синтез РНК.

Они специфически взаимо-

действуют лишь со спирализо-

ванными полидезоксирибонук-

леотидами, содержащими гуанин

(при этом существенна роль 2-

аминогруппы пуринов в образо-

вании водородной связи с хино-

идным кислородом хромофора

№М«Вап

L-Tpe

дактиномицин

он ен, V^Hlf

и« н й

i О

CHj

он

В бмомнцит А2 раднкт R прадсгаммт собой -NH-(CH,|, -

$|СНэ)>

• бмоммцит ДМЛ2 радикалом ааляатся -HH-^CHJj -S-CH). • блммицина

BZ он следующий;

•ЫНЦСН,), -NH-C-NHj. и т. я,

8 т. 8524

225

актиномицина). Они располагаются в малой бороздке нативной

ДНК, мешая функционированию РНК-полимеразе.

Гликопептидные антибиотики блеомицины ингибируют синтез

ДНК и клеточный митоз.

Аминогликозидные антибиотики (гигромицин

В,

стрептомицин)

являются непрямыми мутагенами. Они нарушают белковый синтез

благодаря взаимодействию с 30 S субъединицами бактериальных

рибосом и предотвращению связывания отдельных тРНК. При

этом неправильно считываются пиримидиновые основания.

. Ряд алкалоидов высших растений (из родов Heliotropium —

гелиотроповых, Senecio — крестовниковых и др.) и синтетических

лекарственных веществ (изониазид, хлорпромазид, нитрофураны

и др.) могут обладать мутагенным действием.

К биологическим мутагенам относят вирусы (фаги), живые

вакцины, некоторые биотоксины, образуемые грибами, протозоа

и гельминтами. Так, изменения в хромосомах вызывают цитоме-

галовирус, вирус простого герпеса, герпетиформный вирус, вирус

Сендай, вирус саркомы Роуса и др. Из грибных токсинов —

мутагенов ранее был назван афлатоксин Вь Можно назвать еще

треморген, образуемый рядом аспергиллов и др.

Фагоустойчивые мутанты актиномицетов и лактобактерий пред-

ставляют интерес для соответствующих производств, например,

антибиотиков и молочнокислых продуктов.

Мутагены различных классов (физические, химические, биоло-

гические) используют в работе с биообъектами. При этом стремят-

ся получить штаммы либо с какими-то маркерными признаками,

важными для расшифровки механизмов мутагенеза, либо штаммы

— суперпродуценты БАВ, существенно увеличивающие выход

конечного продукта в сравнении с контролем.

При целенаправленном получении мутантов необходим их от-

бор,

или селекция, значение которой исключительно велико в

выведении различных пород животных, многих сортов злаковых,

декоративных и многих других растений, в получении микробов

— суперпродуцентов БАВ (ряда антибиотиков, аминокислот, вита-

минов и других субстанций). Для сравнения можно указать на

успехи с селекцией мутантов пеницилла, исходный штамм которо-

го,

выделенный из воздуха А. Флемингом в 1928 г., продуцировал

лишь 50 единиц антибиотика пенициллина в 1 мл культуральной

жидкости.- Тяготы второй мировой войны 1939-1945 гг. вынудили

ученых вернуться к этому виду гриба и заняться генетико-селек-

ционной работой с ним. В 1951 г. путем рассева естественной

популяции клеток, выросших в глубинных условиях культивиро-

226

вания Penicillium chrysogenum, был выделен штамм № 1951 с

ативностью 100 ЕД/мл. Его колония и стала родоначальницей всех

производственных штаммов в различных странах мира. Используя

селекцию и комбинированное воздействие различными мутагена-

ми (преимущественно — УФЛ и алкилирующие агенты), уже в

начале 60-х годов удалось передать в производство штамм, обра-

зующий пенициллин в количестве 5 000 ЕД и более в 1 мл

культуральной жидкости. В настоящее время используются штам-

мы,

продуцирующие десятки тысяч единиц антибиотика в 1 мл

среды.

Следует различать понятия "селекция" и "интродукция" (от лат.

mtroductio — введение). При селекции используют методы выве-

дения новых форм организмов, отличающихся по свойствам от

исходных родительских организмов. При интродукции выделяют

из естественных (природных) и искусственных (производствен-

ных) условий существующие организмы, наиболее пригодные для

практических целей.

успехах селекции велика роль контролиру-

емого мутагенеза, тогда как успехи интродукции опираются на

генофонд, заведомо присущий организму. Селекция и интродукция

животных и растений возникли раньше генетики. Основные под-

ходы при этом концентрировались преимущественно на скрещи-

вании организмов и отборе возникающего потомства.

Применительно к микробам сформировалось четыре подхода,

используемых в селекционной работе:

отбор естественных штаммов, обладающих ценными призна-

ками, проявляющимися в конкретных условиях их существования

(этот подход во многом аналогичен интродукции высших эукариот);

при размножении такой культуры (с учетом частоты спонтанных

мутаций) наступает популяционное давление, когда наиболее при-

способленная форма вытесняет исходную в популяции. В анализе

таких популяций полезны флуктуационный тест (от лат. fluctuatio

—

колебание) и метод отпечатков. С помощью первого доказывают

спонтанность мутаций по маркерному признаку (от англ. mark —

знак, метка), с помощью второго отбирают нужные колонии,

вырастающие на селективной среде. Этот первый подход опира-

ется на естественный ход событий у микроорганизмов в изменен-

ных условиях (естественный отбор);

искусственный отбор клонов микроорганизмов с полезными

для человека признаками, возникшими на основе естественной

изменчивости родительских форм. К такому отбору прибегают

тогда, когда контролируемый признак биологически малоценен для

микроба и поэтому трудно создать условия выращивания культуры,

227

в которых относительно легко удавалось бы выделять нужные

варианты. При этом необходимо проверять большое число клонов

и субклонов, и если вариации между ними по контролируемому

признаку невелики, то успех выборки оказывается мало вероятным

или небольшим;

ступенчатая селекция

—

эффективный метод искусственного

отбора форм с применением мутагенов (см. ранее приведенный в

этом разделе пример с продуцентом пенициллина). С помощью

мутагенов увеличивают изменчивость тест-культур, а среди послед-

них отбирают наиболее перспективные; такой подход, как правило,

использ\ ют многократно (ступенчато), добиваясь существенного

возрастания контролируемого показателя (активность, продуктив-

ность и др.);

гибридизация — как метод выведения полезных форм мик-

роорганизмов. Здесь имеется аналогия с методом скрещивания у

высших эукариот. О гибридизации см. в этой главе ранее.

Микроорганизмы, как и высшие организмы, способны соби-

рать и перераспределять уже имеющуюся информацию между

родственными, но генотипически неоднородными клетками. Это

происходит при трансформации, трансдукции и конъюгации у

бактерий, при половой и соматической гибридизации у растений

и животных. Яркий пример здесь с гибридомами, продуцирующи-

ми моноклональные антитела (см.).

228

Часть III.

Процессы и аппараты в биотехнологии

Глава 6.

ПРОЦЕССЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Биотехнология как наука базируется на использовании биоло-

гических процессов в технике и промышленном производстве (см.

главу 1). Эти процессы (от лат. processus — продвижение) — как

совокупность последовательных действий специалистов направле-

ны на достижение соответствующих результатов при эксплуатации

биообъекта(-ов). Говоря о процессах в биологической технологии,

нельзя путать их с процессами в химической технологии. Так,

главным компонентом первых является какой-либо биообъект

(вирус, бактерия, гриб, растительные или животные клетки, био-

молекулы). Такие объекты отсутствуют в химической технологии.

Другой пример с высокими температурами, которые, как правило,

неприемлемы в биотехнологии, но часто используются в химиче-

ской технологии. Наконец, многостадийность и высокие давления

также являются атрибутами (от лат. atributio — придаю, наделяю)

химической технологии, а не биотехнологии. Однако биохимиче-

ские и химические реакции следуют принципу ле Шателье, соглас-

но которому равновесие системы смещается в направлении умень-

шения эффекта произведенного воздействия.

229

Таблица

24.

Систематизация биотехнологических процессов

По характе-

ристике

биообъекта

1) Плазми-

ды,

фаги,

вирусы

растений

млеко-

питающих

Клетки

прокариот

Клетки

эукариот

4) Биомопе-

кулы

(ферменты.

нуклеиновые

кислоты

или

их компо-

ненты

и др.)

По

общности

специ-

фичности

био-

технологи-

ческих

процессов

Общие

2) Специаль-

ные

а) Микроб-

ная

биотех-

нология

б) Фитобио-

технология

в) Зообио-

технология

По

числу

био-

объектов

Один

(например,

иммобили-

зованный

фермент,

одна чистая

культура

продуцент

Тликана

и т. д.)

2) Два и

более

(например,

иммоби-

лизованная

попифер-

ментная

система;

кефирные

зерна

ассоциация

бактерий

дрожжей

т.д.)

По услови-

ям прове-

дения

процесса

1) Нестери-

льный

2) Стериль-

ный

Аэробный

4) Анаэроб-

ный

Поверх-

ностный

6) Глубин-

ный

7) Перио-

дический

8) Полуне-

прерывный

9) Непре^

рывный

10) Твердо-

фазный

11) Газофаз-

ный

12) Одно-

ступенчатый

13)

Двухсту-

пенчатый

14) Много-

ступенчатый

По

стадиям

реализации

технологии

производства

1) Подготов-

ка обор'удо-'

вания

и пита-

тельных

сред

2) Стерили-

зация

обо-

рудования.

питательных

сред,возду-

ха

Посев

выращива-

ние (культи-

вирование)

биообъекта

Выделение,

очистка,

сушка,

стерилиза-

ция (при

необходи-

мости)

продукта

Упаковка

продукта

По

целевым

продуктам

1) Клеточ-

ная

биомасса

2) Первич-

ные

метаболиты

3) Вторич-

ные метабо-

литы

По механиз-

му

образования

конечного

продукта

Биосинтез

2) Биотранс-

формация

По

управлению

процессом

1) Управляе-

мые

2) Неуправ-

ляемые

По

типу

биотехноло-

гического

процесса

Простой

Совмест-

ный

3)Последо-

вательный

4) Ступенча-

тый

Ингредиенты

питательной среды

Приготовление

питательной среды

Вода

Побочные

продукты

Упаковка, хранение

Опевании

выделения целевого

продукта

Отходы

производства

Обезвреживание,

утилизация

Рис.

75. Примерная обобщенная схема процессов в биотехнологии.

Исходя из обобщенной схемы, нельзя учесть все виды и разно-

видности биотехнологических процессов (сравнить данные на рис.

75 и в таблице 24). В основу подразделения биотехнологических

процессов могут быть положены различные принципы, например,

оценка: принадлежности биообъектов к надцарствам живых су-

ществ (процессы на основе использования акариот, прокариот,

эукариот), функциональной активности биообъекта (биосинтез,

биотрансформация), возможности вычленения отдельных этапов

из биотехнологических схем производства в виде самостоятельных

процессов (подготовка питательных сред и оборудования; стери-

лизация питательных сред оборудования, воздуха, ферментация

(культивирование) биообъекта; выделение, очистка и упаковка

готового продукта и т. д.

Классификационные схемы подобного рода оправданы и ими

можно пользоваться как равноправными.

Биотехнологические процессы условно можно подразделить на

биологические, биохимические и биоаналогичные. К первым от-

носят те из них, которые основываются на использовании акариот,

прокариот и эукариот, вторые — на использовании ферментов, и

третьи (биоаналогичные) — на химическом синтезе или полусин-

тезе веществ, функционально близких или эквивалентных первич-

ным или вторичным метаболитам живых организмов (получение

производных пенициллина и цефалоспорина, тетрациклина, нук-

леиновых оснований и др.).

231

Л /

СН

R-CO-NH-CH-CH-R

I I

-CH,-CO-NH-CH-CH С_

Г|

65 2

. i | | ^"з

R X.—N—СН-СООН ^

—N—S0

о °

бензилпенициппин монобактам

полусинтетических ампициллине, метициллине, оксациллине

R представлены соответственно: а - D - (-) - аминобензилом

СбН5—СН—NH2,2,6

диметоксифенилом СбНз(ОСНз)2—,

5 -

метил

- 3 - фенил - 4 - изоксиазолилом

5-ц—[г

'О'

сн

0=C-NH-CH-CH СН

\ III

(СНА С—N С-СН,-0-СО-СН,

1Ъ

II ^ч**

CH-NH,

° '

СООН

соон

цефалоспорин

В полусинтетическом цефалоглицине радикал R представлен

аминобензилом СбН5—СН—NH2, в цепорине (цефалоридине) при-

соединены два радикала в позициях 3 и 7

•ч

0=C-NH-CH-CH CH

-СН

С—N^C-CH

^tt

О '

соон

цепорин

В полусинтетических производных тетрациклина - доксицик-

лине и метациклине (рондомицине) Ri—R4 представлены соответ-

ственно: —ОН, —СНз, —Н, —Ни —OH(Ri), —СН2—(R2 и Rj),

—H(R4).

232

•ji(CH3)2 Полусинтетическим аналогом

он урацила является противораковый

препарат 5 - фторурацил и т. д.

CONH

Многие процессы биологиче-

ской технологии являются общими,

например на стадии ферментации,

поэтому можно выделять общие основы

биологической технологии. Это особен-

но показательно на аппаратурном офор-

млении отдельных стадий биопроиз- ,

водств и, в частности, на выборе биоре-

акторов, сепарирующего оборудования;

, г,,

УРвЦип 5-фторурвцил

сушилок и т. д. (см. главу 7). - -»"*»»"•*•

Специальные биотехнологические процессы связаны в большей

степени с особенностями биообъектов. Достаточно сравнить здесь

культивирование вирусов гриппа на куриных эмбрионах для при-

готовления вакцин и выращивание пеницилла — продуцента ан-

тибиотика бензилпенициллина в биореакторах емкостью до 100 м

и более; другой пример с гибридомными клетками млекопитаю-

щих, продуцирующих моноклональные антитела, и с лейконосто-

ком — продуцентом полисахарида декстрана.

В каждом из этих процессов имеются свои специфические

особенности, благодаря которым выделяют биотехнологический

процесс в самостоятельный. С учетом сказанного мы группируем

все специальные биотехнологические процессы на микробиологи-

ческие, фито- и зообиотехнологические. Другими словами, мы

выделяем микробную биотехнологию, фитобиотехнологию и зоо-

биотехнологию.

Общие процессы изложены в первой части учеб-

ника, специальные - во второй.

6.1.

Взаимосвязь процессов и биообъектов. Биообъекты харак-

теризуются такими показателями, как уровень структурной орга-

низации, способность к размножению (или репродукции), наличие

или отсутствие собственного метаболизма при культивировании в

подходящих условиях. Что касается характера биообъектов, то под

этим следует понимать их структурную организацию. В таком

случае биообъекты могут быть представлены молекулами (фермен-

ты,

иммуномодуляторы, нуклеозиды, олиго- и полипептиды, и т.

д.),

организованными частицами (вирусы, фаги, вироиды), одно-

клеточными (бактерии,' дрожжи) и многоклеточными особями

(нитчатые высшие грибы, растительные каллусы, однослойные

233

культуры клеток млекопитающих), целыми организмами растений

и животных.

Молекулярные биообъекты накладывают свой отпечаток на

организацию и аппаратурное оформление соответствующих био-

технологических процессов.

Вирусы и фаги как облигатные паразиты могут культивиро-

ваться только на живых клетках и тканях, то есть фактически

биотехнологические процессы здесь основываются на использова-

нии клеток, зараженных вирусами или несущих вирус(-ы),

Одноклеточные виды прокариот и эукариот могут использо-

ваться в биотехнологических процессах в виде монокультур или в

ассоциациях. Для сравнения можно назвать производство какого-

либо антибиотика (пенициллина, рифамицина и др.) с помощью

чистой культуры соответствующего продуцента, а также производ-

ство кефира с помощью кефирных "зерен" ("грибков"), в состав

которых входят лактобактерии и дрожжи. Следовательно, в по-

следнем случае применяют природную ассоциацию микроорганиз-

мов,

и кефир является продуктом смешанного брожения — молоч-

нокислого и спиртового. Пировиноградная кислота как ключевой

продукт, возникающий из моносахаридов (моноз) после гидролиза

лактозы, трансформируется лактобактериями до молочной кисло-

ты,

а дрожжи "доводят" тот же пируват до этанола.

лактобактерии

и дрожжи

> 6СН СОСООН пируват

Q,H,„Q

ир

12 22 11

лактоза

-»2С«Н

глюкоза и

галактоза -6СО

-И2Н

jg-галактозидата

дрожжи

лактобактерии

6СН

СН(ОН)СООН

+12Н

6СН

СОН-

->бсн

сн

он

лактат

природных условиях микроорганизмы, как правило, находят-

ся в ассоциативных взаимоотношениях, часть из которых несом-

ненно может быть привнесена в производство в виде самостоя-

тельных биотехнологических процессов. Сегодня такие процессы

немногочисленны, так как природные ассоциации изучены крайне

234