Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

недостаточно с точки зрения биологической технологии. К тому

же такие ассоциации складываются не только между микробами

— микробоценозы, но и другими организмами — микробами и

растениями, микробами и животными, между растениями, и т. д.;

в таких случаях говорят о биоценозах (от

греч.

bios

—

жизнь, coinos

— община). Если организмы выживают, но не размножаются в

данных конкретных условиях, то под этим подразумевают их

нахождение в состоянии анабиоза (от греч. ana — назад, обратное

действие, подобно, соответственно). Если же организмы растут,

развиваются и размножаются в среде обитания, то под этим

понимают их нахождение в состоянии метабиоза (от греч. meta —

между, посредине, изменение, следование в пространстве и вре-

мени).

Наконец, гибель организма(-ов) в ассоциации или вне ее

можно охарактеризовать понятием абиоз (от греч. an — нет, bios

— жизнь). В биотехнологии приходится постоянно встречаться с

такими явлениями как метабиоз, абиоз и анабиоз. Имеются и такие

ассоциации организмов, когда один (или более) из ассоциантов

может расцениваться хищником. Например, гриб Arthrobotrys

oligospora формирует сеть из мицелиальных петель — ловушек

нематод, в частности, относящихся к числу вредителей растений

(лука, клевера и

др.).

Такой нематодой является Ditylenchus dipsaci

— стеблевая нематода. В сельском хозяйстве заметен вред от

картофельной нематоды — Heterodera rostochiensis. Поэтому гри-

бы-хищники оказываются союзниками человека в борьбе за уро-

жаи ряда ценных культур растений, повреждающихся нематодами.

Растением-хищником является росянка (насекомоядное расте-

ние).

У нее на листьях имеются железистые волоски, выделяющие

ферментативно активную липкую жидкость, с помощью которой

схваченные насекомые прочнее адгезируются и перевариваются.

Среди микробов хищником является миксомицет Dictyostelium

discoideum, а его жертвой — кишечная палочка.

При хищничестве, присущем только эукариотическим организ-

мам, жизнь партнера-жертвы ограничена во времени, то есть здесь

ассоциация организмов кратковременная.

Таким образом, анабиоз, метабиоз, абиоз и хищничество отно-

сятся к разряду понятий об уровнях жизнедеятельности организ-

мов.

При метабиозе всегда предполагается наличие организмов-

партнеров, вступающих или вступивших во взаимоотношения.

Каковы же эти взаимоотношения? — Фактически их два —

симбиоз и антибиоз (таблица 25).

235

Таблица 25. Виды взаимоотношений при метабиозе между организмами в

природных условиях.

Взаимооотношения

Вид

Симбиоз

Антибиоз

Подвид

Комменсализм (от лат.

commensalis - сотрапезник)

Мутуализм (от лат.

mutualismus - взаимосвязь,

сожительство)

Нейтрализм (!?)

Паразитизм

Собственно антибиоз и

антагонизм

1) односторонний (моно- и

полинаправленный)

а) спонтанный (от лат.

spontaneus -

самопроизвольный, без

постороннего вмешательства)

б) направленный

(насильственный)

2) двусторонний

Аутоанти биоз

Краткая характеристика

Один вид из ассоциантов

живет за счет другого, не

причиняя ему вреда

Оба ассоцианта помогают

друг другу

Ассоцианты не влияют друг

на друга

Один из ассоциантов живет

за счет другого, нанося ему

вред

Один вид ингибирует

развитие другого (других) или

убивает его (их) своими

метаболитами

В природных условиях

В искусственных условиях

Оба ассоцианта ингибируют

или убивают друг друга за

счет своих метаболитов

Один вид или ассоциация

видов образует метаболиты,

которые ингибируют или

убивают их процудент (ы)

Симбиотические взаимоотношения типа комменсализма при-

сущи, например, рыбам прилипале и акуле, грибу пенициллу,

образующему пенициллин, и кишечной палочке, продуцирующей

фермент пенициллиназу, которая гидролизует антибиотик до пе-

нициллоевой кислоты — он становится не активным.

236

^Sv ,

3 пенициппиназа с СН»

R-CO—NH-CH—CH Ъ^-СНз •R-CO—NH-CH—Л Ъ^-СНз

0=C N—CH—COOH

—<l Л,_сн—СООН

I I

пенициллин ОН н

пенициллоевая кислота

Оба вида могут расти на мясо-пептонном агаре, но кишечная

палочка в этом случае использует вторичный метаболит пеницилла.

Третий пример — ассоциация аэробных и анаэробных микроор-

ганизмов. Представители второй группы начинают расти на среде

лишь тогда, когда аэробы снизят концентрацию кислорода до

необходимой им величины. Следовательно, вторые живут за счет

функциональной активности первых, не принося им вреда.

Яркими природными симбиотическими ассоциациями типа

J мутуализма являются лишайники, где партнерами выступают ци-

анобактерии (или зеленые водоросли) и грибы; муравьи-термиты

и некоторые грибы; микробы рубца жвачных животных; грибы-

микоризообразователи и соответствующие растения; нитрифици-

рующие бактерии-симбионты в клубеньках бобовых растений;

отдельные представители нормальной микрофлоры кишечника

человека; некоторые бактерии — эндосимбионты внутри клеток

простейших, и т. д.

При редком явлении — нейтрализме партнеры —

ассоцианты ведут себя так же, как если бы их культивировали по

отдельности — скорости роста одинаковы в обоих случаях. Напри-

мер,

молочнокислые бактерии и молочнокислые стрептококки в

закваске для кисломолочного продукта (йогурта) не проявляют

отклонений в скоростях роста в сравнении с таковыми для культур

в изолированном состоянии. По другим показателям (кроме ско-

рости роста) данные не накоплены, поэтому возможно "голый"

нейтрализм в природных ассоциациях отсутствует.

В случаях паразитизма один из ассоциантов всегда

наносит вред другому. Среди микробов хорошо известно пораже-

ние прокариотических видов фагами; растений, теплокровных

животных и человека -— вирусами, патогенными бактериями и

грибами; комнатных мух

—

энтомофторовыми грибами (например,

Empusa muscae), некоторых холоднокровных животных (лягушек,

рыб) грибами из родов Basidiobolus и Saprolegnia, и т. д. В случае

использования таких видов (паразитов) в биотехнологии требуются

особые подходы и условия работы с ними.

237

Антибиоз присущ многим видам микро- и макроорганизмов.

Ведущую роль в подавлении партнера(-ов) в' ассоциации могут

играть собственно антибиоз и конкуренция

за источники питания. Собственно антибиоз обеспечивается пре-

имущественно за счет первичных (ферменты) или/и вторичных

метаболитов, например, токсинов, антибиотиков (или фитонцидов

растений — по Б. П. Токину); он может быть односторонним и

двусторонним. Пример одностороннего — Streptomyces

kanamyceticus образует аминогликозидный антибиотик канами-

цин, который губительно действует на партнера

—

Salmonella typhi;

пример второго

—

разные виды стрептомицетов, угнетающих друг

друга при росте на питательной среде, например взаимно антаго-

нистичны Streptomyces globivulgaris и Streptomyces griseus, S.

globivulgaris и S. levoris, и др.

В случае конкурентного антибиоза проявляется антаго-

низм (от

греч.

antagonisma

—

спор, борьба) между видами прежде

всего из-за потребностей в питательных веществах; преимущество

получает здесь наиболее приспособленный вид, менее приспособ-

ленный угнетается или погибает (при наличии в среде Е. coli и

Staph, aureus преимущество остается за Е. coli).

Антибиоз может быть моно- и полинаправленным, или одно- и

многонаправленным, то есть антибиотически или антагонистиче-

ски активный вид проявляет свое ингибирующее (губительное)

действие лишь в отношении одного

вида или более, чем одного вида.

Такой эффект зависит от сложив-

шейся ситуации в природных усло-

виях (спонтанно) или в искусствен-

ных условиях — производственных

или лабораторных (направленно). В

соответствующих экспериментах не-

редко определяют активность каких-

либо продуцентов антибиотиков в от-

ношении многих бактерий и грибов,

подсевая их, например, к "штрихово-

му росту" такого продуцента (рис.

76).

Здесь гриб естественно или вы-

нужденно (насильственно) продуци-

рует пенициллин, который тормозит

рост чувствительных бактерий. По-

добные ситуации вынужденного (на-

238

Рис.

76.

Полинаправленный ан-

тагонизм пеницилла (а) в отноше-

нии бактерий: Staphylococcus

aureus (б), Streptococcus

haemolyticus (в), Escherichia coli

(г),

Neisseria meningitidis (д),

Streptococcus pneumoniae (e),

Candida albicans (ж).

сильственного) антибиоза или антагонизма могут возникать не

только в природных условиях, но и в макроорганизме (И. Г.

Шиллер, 1952).

Под аутоантибиозом следует понимать ингибирование

или гибель организма(-ов) от действия собственных метаболитов.

Например, молочнокислые кокки и бактерии, накапливающие

молочную кислоту в среде обитания, погибают в результате дей-

ствия этого метаболита. Другой пример с дрожжами — сахароми-

цетами, использующимися в производстве этилового спирта. В

процессе брожения лишь отдельные расы их могут накапливать до

15%

этанола. Более высокие концентрации губительно действуют

* на Saccharomyces cerevisiae.

Аутоантибиоз во многом зависит от возраста культуры, и он

проявляется, как правило, в конце стационарной фазы роста и

начале фазы отмирания. Все другие виды ассоциативных взаимо-

отношений складываются преимущественно раньше.

Следует иметь в виду и адаптивные возможности видов в

ассоциациях. Если чистые культуры, используемые в соответству-

ющих производствах, не проявляют, например, какой-либо фер-

ментативной активности, то это не значит, что в ассоциациях с

другими видами они поведут себя аналогичным образом по данно-

му признаку. При наличии соответствующего субстрата в среде

может индуцироваться выработка адаптивных ферментов, не вы-

рабатывавшихся ранее без индуктора. И в результате этого ассо-

циант может подвергнуться, например, лизису (растворению).

По условиям проведения процесса различают нестериль-

ные (крупнотоннажное производство кормовых дрожжей) и

стерильные производства (получение антибиотиков,

витаминов, моноклональных антител и др.); аэробные, или с

подачей воздуха и анаэробные (без подачи воздуха) —

соответственно производства лимонной кислоты и полисахарида

декстрана.

Многие каллусные культуры растений выращивают поверхно-

стно,

то есть используя подложку из питательных сред (чаще —

агаризованную), тогда как микробная биотехнология рассчитана

преимущественно на глубинные процессы (погружение биообъек-

тов в жидкие питательные среды).

При реализации процессов их стремятся вести в одном из трех

режимов: п е р и одическом, по л у непрерывном

и непрерывном. В первом случае биотехнологический

процесс проводят от начала до конца согласно регламенту, и после

239

завершения всех операций его повторяют. Во втором случае

осуществляют так называемый отливно-доливной процесс, когда,

например, на "пике" биосинтеза какого-либо антибиотика отбира-

ют 25—75% культуральной жидкости и однократно добавляют

столько же свежей питательной среды. Непрерывные процессы

рассчитаны на непрерывный отбор культуральной жидкости и

непрерывное поступление равного количества свежей питательной

среды. Непрерывный режим используется в производстве дрож-

жей на гидролизатах древесины, в производстве пива, бутанола и

ацетона, и др.

Выход микробных клеток при непрерывном процессе в срав-

нении с периодическим будет выражаться следующими соотноше-

ниями (с учетом времени удвоения массы — в. у.); 11,9 (в. у. 0,5);

7,6 (в. у. 1,0); 5,3 (в. у. 2,0); 4,3 (в. у. 4,0). Из этого следует, что с

возрастанием времени генерации выходы биомассы в обоих про-

цессах уравниваются.

. Согласно Д. Герберту, Р. Элсуорту и Р. Теллингу при непре-

рывном процессе максимальное образование продукта происходит

при

maxX

= UmaxySoW^-^)

, где

Dmax — максимальная скорость разбавления,

— концентрация

микроорганизмов в биореакторе при установившемся режиме,

Ц max

— максимальная удельная скорость роста,

— выход клеток

в расчете на использованный субстрат, So — концентрация суб-

страта в подаваемой свежей среде, K

— константа насыщения.

Применительно к фазовому состоянию ингредиентов в биотех-

нологических производствах различают твердофазные

процессы, например, при флуидизаций (от англ. fluid — жидкость,

жидкий) или протеинизации грубых кормов на основе соломы

злаковых растений с участием некоторых грибов, получение тка-

невых культур лекарственных растений на уплотненных средах,

из которых затем экстрагируют действующие вещества, производ-

ство сыра из белков молока и др.; газофазные процессы

основаны на использовании газа (например, метана) для получения

микробного белка с помощью ассоциаций метилотрофных бакте-

рий.

Наконец, по условиям проведения процессов выделяют од-

ноступенчатые, двухступенчатые и много-

ступенчатые. Одноступенчатые проводятся, например, при

240

получении

6-АПК

из бензилпенициллина с помощью пеницилли-

нацилазы, или пенициллинамидазы на колоннах, содержащих им-

мобилизованный фермент.

/ место действия фермента

—СН

—COT-NH—СН—СН Ct-CHj •» NH

—СН—СН С«-СН, ^

0=С W—СН—СООН 0=С N—СН—СООН

6-аминопемицилиллаповая

кислота (6-АПК)

+ C

— СН

-СООН

фепилуксусиая кислота

Двухступенчатые процессы базируются на использовании кле-

ток, находящихся в разном фазовом состоянии (в трофофазе и

идиофазе, см. 4.4). Так, например, двухступенчатый процесс воз-

можен при получении полисахарида курдлана

—

на первой ступени

выращивают продуцент (Alcaligenes faecalis var. myxogenes) на

питательной среде, поддерживая его в трофофазе; на второй

ступени культуру переносят в другой биореактор, где нет пита-

тельной среды, но имеется глюкоза, из которой синтезируется

курдлан.

Многоступенчатые процессы присущи генетической инжене-

рии и рДНК-биотехнологии (см.).

Процессы биохимической технологии подразделяют по ста-

диям реализаци и технологической схемы производства:

подготовка оборудования и питательных сред, их стерилизация,

посев биообъекта и ферментация, выделение, очистка, сушка,

упаковка. В зависимости от целевого продукта число стадий про-

цесса может быть то больше, то меньше. Для сравнения можно

назвать производство кормовых дрожжей и антибиотика стрепто-

мицина. В первом случае целевым продуктом являются

дрожжевые клетки, во втором — вторичный метаболит, предназ-

наченный для парентерального введения больным людям и живо-

тным. При получении антибиотика имеется больше стадий, чем в

случае получения дрожжевых клеток.

Целевыми продуктами могут быть и -первичные метаболиты —

ферментные белки. Очевидно, что, например, экзогидролазы тех-

нологически получать легче, нежели какие-нибудь зндоферменты,

локализующиеся внутри клеток, и число стадий в этом последнем

случае может возрастать.

Очевидно, что подготовка оборудования, питательных сред, и

все другие этапы регламентированной схемы производства како-

241

го-либо целевого продукта различны по многим показателям, если

это будут, например, процессы получения экзотоксинов и органи-

ческих кислот. С биотехнологических позиций работа с токсиген-

ными культурами должна проводиться на таком уровне, чтобы

исключить возможность попадания ее за пределы биореактора в

живом состоянии. Строгий контроль осуществляется также за

внутрипроизводственной обработкой и транспортировкой культу-

ральной жидкости, содержащей экзотоксин. Эксплуатация воз-

можностей, например Aspergillus niger продуцировать лимонную

кислоту не сопряжена с подобной опасностью. Тем не менее, во

избежание рассеивания грибных спор во внешней среде желатель-

но и в этом случае ферментацию осуществлять в герметизирован-

ных биореакторах.

После завершения ферментации отделяют либо клетки (кле-

точную массу), содержащие необходимое нам вещество, либо

жидкость, в которой накопился конечный

продукт.

первом случае

отходом является жидкая часть культурального "бульона", во вто-

ром — плотная часть (клетки). Культуральная жидкость содержит

биообъект, недоиспользованные компоненты питательной среды,

продукты метаболизма, включая ожидаемый конечный (целевой)

продукт. От качества целевого продукта зависит выбираемый

метод сепарирования клеток. Например, при производстве экзо-

полисахаридов, или экзогликанов культуральные жидкости стано-

вятся вязкими и, даже, гелеобразными, из которых выделить

клетки продуцента удается лишь после разбавления их водой в

10—20 раз с последующим нагреванием, например, до 80°С, и

сепарированием в подогретом виде на мощных сепараторах типа

"Альфа Лаваль" (Швеция). Полученный разбавленный раствор

полисахарида подвергается концентрированию путем мембранной

фильтрации и вакуум-упаривания. Если минорные компоненты в

полидисперсном полисахариде количественно

малы,

то такой поли-

сахарид может быть использован в качестве готового продукта,

например, как вспомогательное вещество при изготовлении раз-

личных лекарственных средств.

В других случаях необходимо спиртовое осаждение гликана с

последующим удалением надосадочнои жидкости и высушивание

полисахарида, поступающего на хранение и на реализацию.

В производстве некоторых антибиотиков используют ротаци-

онные вакуум-барабанные фильтры непрерывного действия. Если

биообъектами оказываются бактерии или дрожжи, то можно

применить центрифугирование в целях концентрирования суспен-

242

зий и отделения клеточной биомассы. Применяют центрифуги

непрерывного или осадительного

действия.

первом случае клетки

выгружаются через сопла, во втором — с помощью шнеков.

Клеточную массу можно отделять методом осаждения (седи-

ментации), используя коагулянты (например, поликатионные ве-

щества). Некоторые штаммы дрожжей, использующиеся в пиво-

варении, обладают выраженной флокулирующей способностью, и

поэтому они легко могут быть отделены таким способом.

В целях концентрирования клеток может быть полезной фло-

тация (от франц. flottation — плавание), когда на границе раздела

фаз "воздух — жидкость" собираются, например, клетки бактерий

(Acinetobacter sp.), рекомендованные в качестве продуцентов бел-

ка.

В целях выделения конечных продуктов из культуральных

жидкостей после сепарирования клеток прибегают к осаждению,

экстракции, сорбции, ультрафильтрации (см. 7.4) или их сочета-

нию.

Применительно к механизму образования конечных продуктов

можно говорить о процессах биосинтеза и биотран-

сформации. При биосинтезе имеет место конститутивное или

адаптивное образование метаболи-

тов,

относящихся к числу преметабо-

литов, первичных или вторичных ме-

таболитов. Так, нуклеозид инозин

синтезируется некоторыми бактери-

ями (Вас. subtilis, Вас. pumilis,

Brevibacterium ammoniagenes и др.).

НОНоС о / Пентоза в структуре инозина образу-

* "" ется в гексозомонофосфатном шунте

(путь окисления

глюкозы по Вар-

бургу-Дикенсу С,

-Хорекеру), any- N4

инозин

(рибоксин) риновое ядро '

(гипоксантин, **(3

или 6-оксипурин) в общем виде синтезируется

из глицина (атомы в позициях 4, 5, 7), форми-

ата (позиции 2 и 8), диоксида углерода (пози-

ция 6), аспарагиновой кислоты (позиция 1) и

глутамина (позиции 3 и 9).

243

«С

пуриновое ядро

Из первичных метаболитов можно назвать производство фер-

ментов амилаз для хлебопекарной и текстильной промышленности,

L-аспарагиназы — для здравоохранения и др. Из вторичных мета-

болитов хорошо известны поликетидные антибиотики

—

тетрацик-

лины, продуцируемые некоторыми стрептомицетами. Они образу-

ются путем конденсации молекул малонилКоА. Донором метиль-

ной группы для некоторых

Ri ОН

)

CONH,

тетрациклинов является

метионин, донором ами-

ногруппы — глутамин.

В процессах биотранс-

формации имеет место ви-

доизменение какой-либо

молекулы — предшествен-

ника конечного продукта

или превращение одного

продукта в другой. Напри-

мер,

почвенные грибы и некоторые другие микроорганизмы пре-

вращают фенолкарбоновые кислоты в другие формы фенолов с

помощью реакций окисления, гидроксилирования и декарбокси-

лирования.

тетрациклин(ы)

соон

он у он

он

шикимовая кислота

он т он

он

галловая кислота

он

пирогаллол

.Биотрансформация имеет место при компостировании отходов,

при получении биогаза, силосовании кормов и др.

Тем не менее, подразделение процессов в биохимической

технологии на биосинтез и биотрансформацию связано в основном

с результирующим эффектом, а не с механизмом протекающих

при этом биохимических реакций.

Подразделение биотехнологических процессов на управ-

244