Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

это не может не отразиться на изменчивости организмов, включая

и те из них, которые используются в биотехнологии.

Под изменчивостью понимают возникновение организмов с

новыми свойствами (признаками) среди существующего разнооб-

разия живых организмов. Из трех типов изменчивости — моди-

фикации, длительные модификации, мутации — наибольшее зна-

чение для биотехнологии имеют мутации. Индуцированные мутан-

ты теперь широко используются в производстве антибиотиков,

аминокислот, ферментов и других продуктов.

Длительные модификации присущи только клеточным формам

из надцарств прокариот и эукариот, но не акариот. При этом

генотип клеток остается неизменным, а измененный фенотип,

проявляющийся в формировании какого-либо устойчивого мета-

болического цикла, кажущегося независимым от внешних условий,

выступает мерилом автономности внутриклеточной среды. При

многократных пересевах происходит как бы разбавление цитоп-

лазмы в ряду последующих поколений клеток и исходные метабо-

литы материнской клетки достигают ниже порогового предела,

когда указанный выше метаболический цикл исчезает. В других

случаях такой же эффект наблюдается при создании окружающих

условий, не поддерживающих один из типов метаболизма и клетки

из состояния длительной модификации возвращаются в исходное

с присущей виду комбинацией признаков (фенотип). Таким обра-

зом, при возникающих или исчезающих модификациях наблюда-

ются массовые однонаправленные изменения клеток однородного

генотипа, находящихся в среде обитания.

Особенности генотипа определяют фенотипические проявле-

ния организма в заданных условиях. Поэтому и адаптацию можно

определить как приспособление наследственно компетентной клет-

ки (культуры, организма) к конкретным условиям существования.

При мутациях изменяется генотип, или наследственная консти-

туция клетки (организма). Мутации могут быть неконтролируемы-

ми (спонтанными) и контролируемыми (индуцированными). Пер-

вые происходят с частотой

• 10 —

•

10"

на одну генерацию для

разных организмов; это значит, что за одну генерацию ненаправ-

ленно изменяется одна клетка из 100 000 или из

клеток. Частота

индуцированных мутаций возрастает в десятки-тысячи раз.

Факторы, вызывающие мутации, относят к разряду физиче-

ских, химических или биологических, и называют мутагенами.

Мутагены по действию подразделяют на два класса — прямого (на

нуклеиновые кислоты) и непрямого, или опосредованного дейст-

213

вении из клеточной воды свободных радикалов, вступающих в

реакции с кислородом клеточных структур (образование переки-

сей),

с органическими молекулами или взаимодействующих между

собой. Происходит окисление или передача энергии молекулам

ДНК (РНК). Свободно-радикальные процессы могут завершиться

дезаминированием и дегидроксилированием оснований, разрывом

N-гликозидных связей между основаниями и пентозой, деструк-

цией пиримидинов, окислением пентозы, высвобождением пиро-

фосфата. Вот почему различные излучения могут индуцировать

самые разнообразные мутации. Так, например, одновременный

разрыв сестринских хроматид у традесканции составил (по числу

разрывов на 100 клеток/г) 0,99 — для нейтронов (Li + D); 2,1 —

для а-частиц (родон) и 3,02 — для тепловых нейтронов; 0,27; 0,26

и 0,44 — для рентгеновских лучей с X 0,015нм, 0,15нм и 0,41 нм

соответственно. Соотношения УФЛ и ионизирующих излучений

приведены в таблице 22.

Т а б л и ц

а.

22.

Некоторые характеристики части электромагнитного спектра

Название диапазона

Далекая область инфракрасного

излучения

Инфракрасный диапазон

(от 770 до 4 •

нм)

Инфракрасный

Видимый свет (от 390 до 770 нм)

Ультрафиолетовый диапазон (от

13,6 до 390 нм)

Мягкие рентгеновские лучи

Средние рентгеновские лучи

Жесткие рентгеновские лучи

Жесткие рентгеновские и у-лучи

Длина волны,

нм .

3-Ю

•

3-Ю

3-10

0,3

0,03

0.003

0,0003-

0,000003

Частота,

ГЦ

Энергия

кванта, эв

—

Применительно к ультразвуковым колебаниям (акустические

колебания частотой свыше 2

•

герц, щ) считают, что под их

влиянием наблюдаются последовательные изменения вначале в

пиримидинах.а затем — в пуринах.

216

Ежегодно в мире синтезируется не менее 250 тысяч новых

химических веществ, многие из которых (особенно — при круп-

номасштабном производстве) попадают в окружающую среду.

Подсчитано, что примерно 10% человечества подвергается дейст-

вию потенциально мутагенных и токсичных химических соедине-

ний.

Становление и развитие работ по химическому мутагенезу

связано

исследованиями отечественных

генетиков:

В. В.

Сахарова

(1933),

М. Е. Лобашова (1934), И. А. Рапопорта (1938), а также

зарубежных ученых:

Ш.

Ауэрбах (1940), Вестергаард

(1959),

Мандел

и Гринберг (1960) и

др.

В 1966 г. И. А. Рапопорт предложил термин

"супермутагены" для веществ, обладающих исключительно высо-

кой мутагенностью и заметно не влияющих при этом на жизне-

способность клеток и организмов.

К химическим мутагенам относят: ингибиторы синтеза нукле-

иновых кислот (НК), аналоги азотистых оснований, алкилирующие

соединения, окислители, восстановители, свободные радикалы,

акридиновые красители, некоторые антибиотики (таблица 23).

Таблица 23. Некоторые химические мутагены и супермутагены

Группа

Ингибиторы

синтеза

предшественников

НК

Мутаген

Азасерин

Азогуанидин

2-Амино-6-гидроксила-

минопурин (АГАП)

Бензимидазол

5-Бромурацил

2,6-Диаминопурин

Гидразиноурацил

N-6-Гидроксилами-

нопурин (ГАП)

Кофеин

6-Меркаптопурин

Параксантин

Тетраметилмочевая

кислота

Уретан

5-Фтордезоксиуридин

Этил-уретан

8-Этоксикофеин

Супер-

мутаген

—

По химическому

устроению

Диазосоединение

Пурин

Бензимидазол

Пиримидин

Пурин

Пиримидин

Пурин

Карбаминовая к-та

Пиримидин

Карбаминовая к-та

Пурин

217

(Продолжение таблицы

23)

Алкилиру-

ющие

соединения

Окислители

Удлинители

нитей

ДНК

Ингибиторы

синтеза

РНК

Комплексное

действие

на

(дик.

Азасерин

Афлатоксин

1,4-Бис-диазоцетилбутан

(ДАБ)

Бутилхлорэтилсульфид

Глицидол

Диметилсульфат

Диэтилнитрозамин

Диэпоксибутан

Диэтилоксибутан

Диэтилсульфат

Иприт

N-Метил-бис

/хлорэтил-

амин (аналог иприта)

Метилметансульфонат

N-MeraA-N*-HHTpo-N-

нитрозогуанидин

Митомицин

М-Нитрозо-№метилуретан

N-Hmpo30-N-3THA-

мочевина

Нитрозометилоксаимид

Пропиленоксид

Р-Пропиолактон

Фенол (карболовая

кислота)

Формальдегид

Эпихлоргидрин

Азотистая кислота

Гидроксиламин

Диоксид водорода

Акридиновый оранжевый

Бромистый этидий

Профлавин

Актиномицины

Н, ОН

Стрептомицин.гигро-

мицин

В и др.

III

+ + +1+ 1+ +I +

1+III+

Диазосоединение

Производное фурана

Диазоалкан

Хлорзтилсульфид

Эпоксид

Диалкилсульфат

N-Нитрозозамещенное

соединение

Эпоксид

Алкан

Диалкилсульфат

Хлорзтилсульфид

Алкилалкансульфонат

Нитрозозамещенное

соединение

Антибиотик

Диазосоединение

N-Нитрозозамещенное

соединение

N-Нитрозозамещенное

соединение

Эпоксид

Лактон

Фенол

Альдегид

Эпоксид

Кислота

Амин

Перекись

Акридиновый

краситель

Производное

изохинолина

Акридиновый

краситель

Антибиотики

Свободные радикалы

Антибиотики

218

HNM

Как видно из таблицы 23 среди ингибиторов синтеза предше-

ственников НК имеются антиметаболиты (азогуанидин, 5-аминоу-

рацил, 6-меркаптопурин, 5-фтордезоксиуридин). Нуклеозиды, со-

держащиеся в клетках или добавляемые извне, играют роль анти-

мутагенов, снижающих мутагенный эффект названных веществ.

На примере 5-аминоурацила —

аналога урацила можно показать

путь возникновения 50% потомков

после двух циклов репликации му-

тировавшей клетки под действием

мутагена. 5-Аминоурацил по хими-

ческому строению близок к тимину

и поэтому легко комплексируется

с аденином. Кето-форма 5-аминоу-

рацила более стабильна, чем его

энольная форма, однако последняя

образуется и существует какое-то

время, в течение которого он мо-

жет спариваться с гуанином — это

так называемая ошибка включе-

ния.

Тогда очевидно, что вместо пары Г-Ц появится пара АгТ или

5-аминоурацил

(кето-форма)

ОН--

2Jw

аденин

ОХ

•НИМ

5-аминоурацил

(енольная ферма)

гуанин

III"

«Si»., „ )|

•мУ Ц

время это, как прави-

ло,

небольшое).

Смещение в комп-

лементарное™ пар,

или ошибка реплика-

ции может происхо-

дить по другой схеме:

А-5аминоУ (А-амУ). Аналогичная ситуация мо-

жет складываться при использовании 5-брому-

рацила (5-БУ) и прибавка в числе мутантов

будет однократной. Мишень действия этого

мутагена — фермент рибонуклеотидредукта-

за. Мутации подобного рода происходят с не-

большой частотой^ поскольку они всецело за-

висят от времени существования аналога нук-

леинового основания в энольной форме (а

219

2-аминопурмн

Мутация здесь сохраняется до конца репликации ДНК, содер-

жащей 5амУ (или БУ) и общее число мутаций возрастает с ростом

числа циклов репликаций.

Подобный мутагенный эффект оказыва-

ют и другие аналоги НК, например 6-мер-

капто- или 6-аминопурин. Мутагенное дей-

ствие 2-аминопурина проявляется на бакте-

риях и бактериофагах, хотя в норме он

имеется в цианофагах. Будучи аналогом азо-

тистых оснований нуклеиновых кислот, 2-

аминопурин

(АЛ)

индуцирует ошибку вклю-

чения. В обоих случаях произош-

ли мутации типа транзиций (см.).

ошиб

.Р

включения

\^ ошибка репликации

Ал может вызывать также и му- ^ -^- ====

тации типа трансверзий

(см.),

хо-

тя и редко. Для всех аналогов

азотистых оснований характер-

ны прямые и обратные мутации

типа простых замен, например

А=Т на Г

Ц или Ц

Г на Т=А

(обратные мутации здесь Г

з=

заменяется на А=Т и А=Т — на

Г-Ц).

Азасерин относится к двум подгруппам (см. таблицу 23). Его

мутагенный эффект связывают с нарушением биосинтеза пуринов

de novo и с радиомиметическими свойствами (от греч. mimicos

имитирующий).

Афлатоксин Bi вызывает сдвиг рамки считывания ДНК. Это

можно показать на следующем примере:

ТГГГГАТГЦ

АЦЦЦЦТАЦГ

ТГГГАТГу

АЦЦЦТАЦГ

ТГГГГГАТГЦ

2 *• i

' i • • i !*•

АЦ ЦЦЦТАЦГ

•

выпадение одного Г

•

добавление одного Г

Супермутагены часто приводят к мутациям, возникающих на

пути 2. Кофеин в больших дозах оказывает прямой мутагенный

эффект, вызывая разрывы хромосом, например в клетках дрозо-

220

филы, человека и других эукариот. В меньших концентрациях он

действует как синергист с радиацией, ингибируя репарирующие

ферменты.

В основе алкилирования НК лежат такие реакции как депури-

низация с разрывом сахарно-фосфатной цепи в ДНК; взаимодей-

ствие алкилирующих агентов с адениловой, цитидиловой и тими-

диловой кислотами с последующей утратой способности алкили-

рованных

А,

Ц и Т спариваться с комплементарными основаниями;

взаимодействие с фосфатными группами

НК;

взаимодействие двух

функциональных групп алкилирующего агента с нуклеофильными

группами НК. Так, например, в случае удаления .гуанина из ДНК

под влиянием какого-либо алкилирующего агента могут обнару-

житься различные варианты изменений: восстановление исходной

пары Г з Ц, ее выпадение, перекрестная замена Г

Ц на Т = А

или на Ц

Г, простая замена Г = Ц на А = Т.

Супермутагены, вызывающие до 24% летальных мутаций, в

основном относят к группе алкилирующих агентов. Эту группу

подразделяют на следующие подгруппы:

Металлорганические соединения R-Me, где R— органический

радикал; например метилированная ртуть;

Галоидные алкилы (Алк) — (nH2n+i)R, где R — фтор, хлор,

бром, йод; например,

1,2-дихлорэтан,

1,2-дибромэтан,

1,3-дихлорп-

ропан;

Производные этилена (CH2=CH-R, где R — двуокись азота,

двуокись серы и др.); например, акрилоилэтиленимин;

Альдегиды (R-COH, где R=H, СН2-СН- и др.); например,

формальдегид, акролеин;

Уретаны (H2NCOOAAK); например, этил-уретан;

6. Диазоалканы (Алк = N

N-);

например, диазоуксусный эфир,

диазометан, 1,4-бисдиазоацетилбутан;

Нитрозозамещенные соединения ( /

где Ri-H, Алк, a R2-AAK, остаток уретана, мочевины, гуанидина);

например, нитрозометилуретан, нитрозогуанидин, нитрозоалкил-

мочевины; Алк—О. л°

8. Диалкилсульфаты л^

Аяк—О О

например, диметил- и диэтилсульфаты;

221

9. Алкилалкансульфонаты (эфиры сульфоно- ___ с

вых кислот с общей формулой, например, метил- ^s:

метансульфонат и этилмеметансульфонат); . Л^^,

Алк

10.

Эфиры фосфорной и фосфористой кислот

АПК О^

Алк

—

0-^Р=0

Апк—О

АЛК—О^

АЛК—О

-О—АШ

11.

р -Хлорэтилсульфиды (иприты) с общей формулой и их

азотистые аналоги, где R=H, Алк и др.;

CI—Апк.

CI—Алк

N—R R=H,AnK

12.

Эпоксиды,

У°\

где R = H

- А^

АР--:

Сн

—СН—R R=H.Anit например, этиленок-

13.

Лактоны

<СН

)п--С=0

14.

Этиленимины

А .

сн

—c"-

сид,

или окись этилена;

например,

Р-пропиолактон;

где R-Алк, Н и др.;

афпатоксин В,

15.

Производные фурана, например аф-

латоксин В1, хлорбензфуран и др.

16.

Прочие.

Указанные соединения относят к разря-

ду реактогенных, способных передавать

свои радикалы азотистым основаниям в НК

и взаимодействовать с остатками фосфор-

ной кислоты.

По числу активных групп алкилирующие

соединения делят на моно- , би- и полифункциональные. Моно-

функциональными, например, являются диметилсульфат, этилени-

мин, этилметансульфонат и др., бифункциональными — Р-хлорэ-

тилсульфиды и их азотистые аналоги, полифункциональными —

222

дихлордизтил-, метилдихлордиэтиламины, эфиры фосфорной и

фосфористой кислот.

Нитросоединения (нитраты, нитриты, нитрозосоединения,

окислы азота и др.) проявляют мутагенную активность на про- и

эукариотах. Нитрозосоединения могут образоваться из аминосое-

динений и нитритов в кислой среде желудка млекопитающих.

Под действием алкилирующих агентов возникают аддукты (от

лат. adductus — приведенный, притянутый): 7-алкилгуанин (наи-

более часто), 3-метиладенин, 0-6-метилгуанин, 0-4-алкилтимин и

др.

Малые дозы алкилирующих агентов индуцируют фермент

метилтрансферазу, "принимающую на себя" алкильные группы.

Клетки в этих случаях выживают. Данный фермент отсутствует у

дрожжей, но есть у людей.

Еще в 50-е годы был изучен механизм мутагенного действия

азотистой кислоты, проявляющийся в окислительном дезаминиро-

вании нуклеиновых оснований, то есть в замене аминогрупп на

гидроксил или кислород. Тогда аденин трансформируется в гипо-

ксантин (Гкс), гуанин в ксантин (Кс), цитозин в урацил. Первый

спаривается с цитозином, что приводит к замене А = Т'на

= Ц,

ксантин сохраняет способность спариваться (как и гуанин) с

цитозином, что сопровождается заменой Г = Ц на А=Т.

Кс

,; ш°^

Кс

' III

замени пс происходит

223

Ошибки при спаривании оснований происходят путем транзи-

ции или трансверсии. В первом случае один пурин заменяется

другим пурином, один пиримидин — другим пиримидином. Во

втором случае пурин замещается пиримидином или наоборот —

пиримидин замещается пурином. Под влиянием М-метил-Ы-нитро-

N-нитрозогуанидина больше возникает транзиций, чем трансвер-

сий.

Мутагенный эффект гидроксиламина обусловлен его взаимо-

действием с цитозином, тогда как гидразин разрывает кольца

урацила и цитозина.

Метаболическая активность различных организмов может со-

провождаться образованием перекисей, которые в определенных

случаях могут быть мутагенами. Более того, перекиси выступают

как бы связующим звеном между химическим и физическим

мутагенезом (в частности,

лучевым),

учитывая факт их образования

во время облучения клеток или тканей. При этом перекиси оказы-

ваются мутагенами первого порядка, а например, калия цианид

—

мутагеном второго

порядка.

Это связано с тем, что KCN блокирует

фермент каталазу (антимутаген) и, как следствие, клетка лишается

защиты против мутагенного действия Н2О2.

2Н

каталаза

• 2НгО + 0

блокада реакции

калия цианидом

П 1 I I I Г

А Т Ц А Г Т

Т А АОТ Ц А

J I I 1 1 L

1—1—1—1—г

Т Ins А Г Т

А АО Т Ц

I I 1_

I 1 1 1 1

А Т Ц А Г

III

II III

Т А Г Т Ц

I I I I

Выпадение ЦТ

1 1 111

А Т

А Г Т

II II

1М!

Т А Т Ц А

I I I i

I III I

А Т Ins А Г

III

II III

Т A Ins' Т Ц

I I I I

Вставка Ins

sins'

I 1 1 1 1

А Т А Г Т

II II III II

Т А Т Ц А

Выпадение Ins

—

АО

224