Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

зуются аггломераты, или комочки клеток, и, напротив, при малой

или совсем не проявляющейся адгезии клетки находятся в изоли-

рованном состоянии друг от друга; в первом случае потребление

кислорода уменьшается в сравнении с вторым, когда клетки обла-

дают большей площадью своей поверхности;

3) от быстроты динамических изменений в среде выращивания

биообъекта (например, в производстве экзополисахаридов, проду-

цируемых аэробными микроорганизмами, заметно возрастающая

вязкость среды снижает поступление О2 к клеткам);

4) скорость накопления биомассы клеток — чем больше био-

масса, тем скорость поглощения кислорода быстрее снижается, то

есть зависимость здесь обратно пропорциональная;

5) качество источников питания, подлежащих окислению. Для

сравнения можно назвать такие источники углерода, как глюкоза

и предельные углеводороды из нефти. Молекулы глюкозы в пита-

тельной среде и в клетках одинаковы, так как степень восстанов-

ленное™ атомов углерода в данных молекулах одинаковы. Поэтому

и отношение потребленного кислорода к количеству превращен-

ной глюкозы меньше, чем это имеет место в случае использования

углеводородов;

6) пеногасители, добавляемые к вспенивающимся культураль-

ным жидкостям в процессе выращивания некоторых биообъектов.

Так, например, натрия лаурилсульфат в концентрации 10 млн "'

снижает коэффициент массопередачи Ог на 56% (в сравнении с

водой);

7) продукты метаболизма, например, секретируемые белки,

также снижают массопередачу кислорода.

Действие всех перечисленных факторов проявляется во време-

ни и сказывается не только на показателях массообмена, но и

теплообмена — ферментации протекают в растворах неньютонов-

ских псевдопластических жидкостей. В биотехнологических про-

цессах теплообмен — постоянно учитываемый и контролируемый

фактор — либо требуется подача тепла, например, в случаях

стерилизации питательных сред или при культивировании анаэро-

бов при 55—56°С (биологическая обработка отходов в бескисло-

родных условиях), либо, напротив, необходим отвод тепла, обра-

зующегося в биореакторах, в которых выращивают аэробные

клетки. В этих целях пользуются рубашками аппаратов, в которые

подается горячая или холодная вода, змеевиками, вмонтированны-

ми внутри аппаратов, "выносными" теплообменниками и др. Вза-

имосвязь скоростей отвода и образования теплоты описывается

265

уравнением Q =

UAAT,

где Q—теплота, U—общий коэффициент

теплообмена, А—площадь поверхности теплообмена, AT—харак-

терная межфазная разность температур между культуральной

жидкостью и нагревающей (охлаждающей) жидкостью. Под общим

коэффициентом теплообмена (U) понимают количество теплоты,

передаваемое в единицу времени через единичную поверхность

при разности температур в ГС. Поэтому и теплообмен в общем

виде можно определить как перераспределение тепловой энергии

между взаимодействующими фазами в биореакторе. Теплообмен

зависит от ряда факторов:

1) ламинарного или турбулентного движения теплоносителя,

2) толщины и качества материала стенок биореактора,

3) вязкости среды,

4) скорости потока при полунепрерывном и непрерывном

способах культивирования биообъектов,

5) характера охлаждения биореактора.

Познание этих факторов является необходимым для констру-

ирования оптимальных биореакторов и наиболее выгодного про-

ведения биотехнологических процессов.

Массообмен в биологических системах связан не только с

доставкой кислорода к клеткам аэробных видов и теплообменом,

но и с выделением диоксида углерода как конечного продукта

различных катализируемых реакций, транспортом других веществ

через клеточные мембраны (в том числе — анаэробных организ-

мов).

Диоксид углерода может находиться в четырех различных

формах, с различной степенью растворяясь в воде: СО§", НСОз,

Н2СО3 и COi. Растворимость СОг зависит от рН жидкости и он

переносится через границу раздела фаз "газ-жидкость" лишь в

растворенном виде.

Для оценки газообмена при культивировании отдельных био-

объектов, а также в целях контроля за микробами — загрязните-

лями зерна, пищевых продуктов, других жидких и плотных мате-

риалов используют специальное оборудование типа "О2/СО2 ре-

спирометров", в том числе — с компьютерным контролем (напри-

мер,

"Микро-оксимакс О2/СО2 респирометр" фирмы Columbus

Instruments, США).

Транспорт питательных веществ через мембраны клетки осу-

ществляется различными путями в системах "жидкость-твердое

тело":

простой (пассивной) диффузией, облег-

266

ченной диффузией иблагодаря активному

тран сп о р т у, а у ряда эукариотических организмов — с

помощью эндоцитоза. В нормальном состоянии мембрана непро-

ницаема для большинства полярных молекул, но некоторые газы

(С02,

N2) и водные растворы многих веществ свободно диффун-

дируют через мембрану благодаря соответствующим концент-

рационному и электохимическом у гради-

ентам. Градиент концентраций - это разность концентраций, а

диффузия — суммарное перемещение вещества, зависимое от

градиента концентраций. Электрохимический потенциал склады-

вается из суммы зарядов диффундируемых веществ. Электроны

медленно проходят через мембрану, и чем больше их заряд, тем

меньше транспорт.

• При пассивной диффузии молекула растворенного вещества

не изменяет свою первоначальную молекулярную форму. Значе-

ние свободной энергии (AG) при этом всегда отрицательно.

•'-'• С\ - - '

AG= RTLn-fr , где О — область пониженной концентрации

вещества, С2 —- область повышенной концентрации вещества.

Ионизированные и. полярные молекулы, плохо растворимые в.

полярных растворителях, обычно не транспортируются через мем-

брану пассивной диффузией- Для этого существует механизм

облегченной диффузии, или сопряженного транспорта, когда ве-

щество связывается с молекулой-переносчиком, локализованной

на наружной поверхности мембраны. Образующийся комплекс

достигает внутренней поверхности мембраны,

где

и разъединяется,

перенеся молекулу вовнутрь клетки.

Облегченная диффузия осуществляется при участии мембран-

ных пор, генерирующих ион-проводящие пути; ионофоров-пепти-

дов,

формирующих ионные каналы (например, декапептиды—

антаманид у базидиомицетов, грамицидин С у некоторых бацилл

и др.); интегральных и периферических мембранных белков, дей-

ствующих взаимосвязанно (например, пермеазы и др.).

Транспорт веществ при облегченной диффузии протекает не

линейно (как при пассивной диффузии), а

определенным уровнем

насыщения (maximum), после которого возрастание разности кон-

центраций вещества не сказывается на скорости его переноса.

Этот вид транспорта кинетически сходен с ферментативным ката-

лизом.

Система активного транспорта через мембрану является энер-

гозависимой. Она включает фермент АТФ-азу, белки-переносчики

267

различных веществ, фосфолипиды. АТФ-аза проявляет активность

в присутствии фосфолипидов. Активный транспорт подразделяют

на первичный и вторичный. Энергия для первого поставляется

одним их двух способов:

1) когда транспорт сопряжен с одновременным прохождением

через мембрану второго вещества, движущегося по градиенту

концентраций и в том же направлении, что и первое вещество —

симпорт, или в обратном направлении — антипорт; свободная

энергия (AG) этого процесса большая и отрицательная величина;

2) когда энергия поставляется за счет сопряженного гидролиза

АТФ или какого-либо другого высокоэнергетического соединения

(фосфоенолпируват, карбомоилфосфат, 1,3-дифосфоглицерат и

др.).

Этот способ называют насосом (AG) здесь положительная

величина) (рис. 79).

За счет работы систем первичного активного транспорта на

мембране создается градиент ионов, прежде всего — протонный

потенциал

AjIFf,

который индуцирует

вторичный активный транспорт

—

пе-

ренос с помощью белков-переносчи-

ков (в частности, пермеаз) аминов,

аминокислот, Сахаров и других ве-

ществ (например, М-белок у Е. coli

является компонентом трансфераз-

ной системы, и он переносит Р-галак-

тозиды, и т. д.).

Функции системы активного

транспорта: поддержание постоянст-

ва концентраций метаболитов незави-

симо от колебаний содержания их во

внешней среде; стабильное поддержа-

ние оптимальных концентраций неор-

ганических ионов как кофакторов

ферментативных реакций и для акти-

вирования других процессов; извлечение из окружающей среды

необходимых веществ даже при низкой их концентрации; регуля-

ция метаболизма.

Массообмен для многих веществ в различных системах еще

далеко не изучен полностью и здесь биологическая технология

имеет резерв совершенствования биотехнологических процессов

в целях достижения более высокого выхода конечных продуктов.

268

3Na

№*-К

-АТФ-аза

АТФ

г«-

АДФ + Фн

Рис.

79. Мембранная NaH

К+ —АТФ-аза (Na-t—К + — на-

сос),

участвующая в активном

транспорте катионов (1—олиго-

сахариды, 2—периферические

белки, 3—трансмембранные бел-

ки,

4—периплазматическое про-

странство или внеклеточная сре-

да, 5—мембрана, 6—цитоплазма).

6.5. Биотехнологические процессы в связи с особенностями

метаболизма клеток. Процессы в биохимической технологии в

большинстве своем базируются на использовании продуктов вто-

ричного метаболизма. Даже в тех случаях, когда преследуют цель

промышленного производства биомасс"и клеток или тканей, опти-

мизация условий ее выращивания также основывается на знаниях

особенностей метаболизма

тест-культур.

Эффективность накопле-

ния такой биомассы по-прежнему оценивается экономическим

коэффициентом

(ЭК),

то есть отношением веса сухой массы клеток

(ткани)-У к весу потребленного углевода (Сп). Величину экономи-

ческого коэффициента выражают в процентах, и она, как правило,

обратно пропорциональна концентрации сахара:

ЭК%

= У/Сп100.

Известно, что метаболизм различных организмов включает

реакции анаболизма, амфиболизма и катаболизма. , Анабо-

лизм (от греч. anabole — подъем) — это синтез веществ клетки;

амфиболизм (от греч. amfi—оба) объединяет реакции

промежуточного обмена; катаболизм (от греч. catabole

—сбрасывание, разрушение) — расщепление веществ. В связи с

энергетикой процессов первый и второй из них протекают с

потреблением энергии, третий — с выделением энергии. Поэтому

метаболизм в целом можно подразделить на энергетический и

конструктивный. Энергия выделяется при брожении и дыхании,

а потребляется в реакциях синтеза нуклеиновых кислот, белков,

углеводов, липидов, их конъюгатов, при активном транспорте

различных веществ через клеточные мембраны, и т. д.

Все организмы, использующие энергию солнечного света, на-

зывают фототрофными; организмы, использующие энергию

при окислении химических веществ, называют х е м о т р о ф-

н ы м и.

Реакции обмена веществ у прокариот и эукариот (акариоты не

обладают собственным обменом веществ) катализируются фер-

ментами, число которых в клетке может достигать 1,5—2 тысяч.

Скоординированные биохимические и биофизические процес-

сы размножения, роста и развития клеток в конкретных условиях

среды обитания и составляют сущность обмена веществ, или

метаболизма. Наличие большого количества ферментов в клетках

различных организмов обеспечивает им широкий диапазон адап-

тивных, или приспособительных возможностей (хотя и не безгра-

ничный). Среди различных групп организмов наиболее лабильны-

ми являются одноклеточные виды и, прежде всего, бактерии и

дрожжи. Высшие животные и растения имеют собственные меха-

269

низмы для поддержания

своего,

гомеостаза (от греч. omoios—подо-

бный, одинаковый, stasis—неподвижность, состояние), то есть

динамического постоянства состава и свойств внутренней среды,

а это значит, что при заметных отклонениях в среде обитания

наступают отклонения от нормы либо в их структуре, либо в

функциях (признаки патологии, или болезни).

Следовательно, кроме обеспечения тест-организмов питатель-

ными веществами им необходимы более или менее постоянные

условия функционирования в заданном направлении (накопление

биомассы или метаболитов), в частности, стабильность температу-

ры,

снабжение или, напротив, исключение О2, поддержание рН на

определенном уровне.

Все биохимические реакции, катализируемые ферментами, не

выходят за пределы классических законов термодинамики, и к ним

(как и к чисто химическим системам) приложим принцип ле

Шателье — равновесная точка системы смещается в направлении

. уменьшения эффекта произведенного воздействия.. Очевидно, что

"метаболическое разнообразие- определяется не столько механиз-

мами реакций, а сколько ферментным набором в клетках различ-

ных организмов и подходящими условиями для их проявления, то

есть первичными здесь являются ферменты, а вторичными —

катализируемые ими реакции. •

Метаболизйрующие клетки ограничены сроком выживания в

конкретной среде обитания, а после отмирания в природе они

подвергаются разложению и минерализации. Если проследить за

круговоротом веществ, входящих в состав клеток, то можно выде-

лить определенную цикличность процессов для азота, углерода и

других биоэлементов. Метаболизм детально рассматривается в

курсах биологической химии и химической микробиологии.

Микроорганизмы, например, из рода Bacillus, продуцирующие

активную фосфатазу, превращают мало растворимые фосфаты в

растворимые и легко доступные другим организмам, у которых он

включается в состав нуклеиновых кислот, некоторых макроэрги-

ческих соединений (например, АТФ) и др.

Выдающаяся роль серы в живых организмах обусловлена ти-

ольными группами, которые в составе серусодержащих аминокис-

лот участвуют в формировании и стабилизации третичных струк-

тур белковых молекул.

Зная пути и механизмы превращения различных веществ, мож-

но использовать отдельные процессы в практических целях либо

для получения метаболитов, либо клеточной массы.

Трансформация различных веществ в природных или искусст-

270

венных условиях сопряжена с расходованием и накоплением

энергии. Основными источниками энергии для живых существ

является солнечная радиация, углеводы; только для прокариот —

Нг, СОг, NHs, N2 и его неорганические производные (¾¾

Na2S203, SO\), а также

К первичным генераторам энергии, в

которых происходит преобразование световой и химической энер-

гии в доступную клеткам форму, относятся бактериородопсин,

редокс-цепь фототрофов и дыхательная цепь. Все эти генераторы

локализованы в мембранах (в пурпурных мембранах у галобакте-

рий, в хроматофорах фотосинтезирующих бактерий, в тилакоидах

у цианобактерий, в хлоропластах у водорослей и растений, цитоп-

лазматической мембране у прокариот, и внутренней мембране

митохондрий у эукариот). Под "редокс-цепью" понимают последо-

вательность переносчиков восстановительных эквивалентов с лю-

бым акцептором этих эквивалентов, кроме О2; "дыхательная цепь"

— это последовательность переносчиков восстановительных экви-

валентов с кислородом в качестве их конечного акцептора. Функ-

ционирование "дыхательной цепи" всегда сопряжено с генерацией

энергии, доступной для клетки, тогда как у "редокс-цепи" эта

функция может отсутствовать. У фототрофных, или фотосинтези-

рующих организмов возможны следующие окислительно-восста-

новительные системы (рис. 80 а, б)

свет (hv) свет (hv)

Г Т

Д хлорофилл ff) Д хлорофилл ffi.

/ растения,

" РЖ' Дитохром кофактор I цитохром

Tep

™/V

T АД5^С@>

кофактор ^* Л НАДФ*-5НАДФ растения,

(АТФ)»АДФ+Р+Э восст. водоросли,

, „ бактерии

(а) (б)

Рис. 80. Схемы окислительно-восстановительных процессов при цикличном (а) и

нецикличном (б) фосфорилировании; HjA соответствует НгО — у растений и водорослей,

Нг, Н гв или разные органические вещества — у других фотосинтезирующих аноксиген-

ных бактерий.

хемотрофных, или хемосинтезирующих видов набор окисли-

тельно-восстановительных систем шире:

1) доноры водорода — неорганические вещества (литотрофия);

акцепторы водорода:

а) кислород (аэробное дыхание)

271

+ 40

H2S — • S • SO|" (Beggiatoa, Thiobacillus)

+ 20 ' -

NH3 • NO2 (Nitrosomonas)

+ 0

NO"2 * NO3 (Nitrobacter)

• Fe

(Leptothrix)

+ 0

H2 • H2O (Hydrogenomonas)

+ 0

CO . CO2 (Carboxydomonas)

б) неорганические вещества (анаэробное дыхание):

SOl", CO3-

• НгО

} некоторые водородные бактерии

N05 • N2

• Н

} некоторые виды Desulfovibrio

SOl" •Н2О

• Н

} некоторые метайогенные бактерии

со|-

^сн

" '

4Н2.+ С02 • СНз СООН + 2H20 Clostridium aceticum

S • SOl"

} Thiobacillus nitrificans

NO3 *N

2) доноры водорода — органические вещества (органотрофия);

акцепторы водорода:

а) кислород (аэробное дыхание); в эту группу относят все

гетеротрофные организмы, которые могут использовать органиче-

ские вещества в качестве доноров водорода;

б) неорганические вещества (анаэробное дыхание):

SOt, СО3-

272

ЫОз • N2 денитрификаторы

NO3 • ИНз нитратредуцирующие бактерии

SOi — • H2S Desulfovibrio

СОз"

»СН4 метаногенные бактерии

в) органические вещества (брожение); сюда относят все виды

бродильных процессов (молочнокислое, маслянокислое, спиртовое

и др.). ..

Уравнение, с помощью которого описывают взаимоотношение

энергетических компонентов, включает общую энергию системы,

или энталпию (Н, в Джоулях), меру разупорядоченности системы,

или энтропию (S, в Джоулях/градусы) и свободную энергию

системы (G, в кДж/моль), представляется в следующем виде:

G =

АН

— TAS (Т— абсолютная температура),

G АТФ = —30,56.4 кДж/моль.

большинстве случаев изучение энергетического метаболизма

сводится к оценке продукции АТФ и трансмембранного потенциала

(Дц^Г),

пороговая величина которого, необходимая для окислитель-

ного фосфорилирования, составляет 180—270 мВ; Auff формиру-

ется на клеточных мембранах у различных организмов (кроме

облигатных анаэробов).

Клетки, как правило, метаболизируют при изотермических

условиях и значительная часть энергии ими не используется (в

противном случае мог бы возникнуть перегрев системы) — она

теряется. При этом возрастает энтропия, и клетки могут погибнуть.

Смерть — это большая положительная величина энтропии, тогда

как негативная величина ее и упорядоченность — это жизнь.

Суммируя дыхательные процессы, сопряженные с получением

энергии, приводим таблицу

31,

в которой отражены основные типы

дыхания и указаны представители, "ведущие" эти процессы, а на

рис.

81 представлена схема путей образования и расходования

унифицированных форм энергии [по В. П. Скулачеву (1984) в

некоторо'м видоизменении В. К. Акименко (1989)]. На рис. 81

обобщена сущность хемиосмотического принципа П. Митчелла о

сопряжении процессов генерации и потребления энергий, доступ-

ной для клетки. Здесь речь идет'о трансмембранном потенциале

HQHOB водорода —

uff , который представляет собой унифици-

рованную форму энергии, обеспечивающей (наряду с АТФ при

гликолизе у анаэробов, и у некоторых видов -

A\iNa

)

все энерго-

потребности клеток.

273

Таблица 31. Механизм дыхательных процессов у различных организмов

Доноры водорода

(электронов)

Акцепторы водорода

(электронов)

Образующийся

конечный продукт

Название типа дыхания

Организмы,

участвующие в

дыхательном процессе

Тривиальное название

дыхания

Название дыхательного

процесса с учетом

потребностей в

кислороде

I Название дыхательной

1 цепи с учетом

| акцепторов

| восстановительных

I эквивалентов (е~, Н")

Неорганические или органические вещества (Hj, НгО, H2S, глюкоза и др.)

N05

NC5

нитратное

факульта-

тивные

анаэроб-

ные и

аэробные

бактерии

sof

сульфат-

ное

облигат-

ные

анаэробы

S°

серное

облигат-

ные и

факуль-

тативные

анаэробы

СОг,НСОъ

, о

СЩ

карбонатное

анаэроб-

ные аце-

тогенные

бактерии

анаэроб-

ные ме-

танобра-

зующие

бактерии

Fe*

"железное'

анаэроб-

ные желе-

зобакте-

рии

органические вещества

фумарат

сукцинат

фума-

ратное

анаэроб-

ные

сукцино-

генные

бактерии

анаэробное дыхание

ацеталь-

Дегид,

пируват и

др.

этанол,

лактат и

др.

продукты

брожения

брожение

анаэроб-

ные

дрожжи,

пекто-

бактерии

брожение

анаэробные процессы

редокс-цепь

(О2 здесь не выступает акцептором е", Н~)

Ог

НгО

окисли-

тельное

фосфо-

рилиро-

вание

аэробные |

прокариоты

эукариоты 1

аэробное I

дыхание

аэробные

процессы

дыха-

тельная

цепь(02 -

акцептор

е", rf)