Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

Кетокислоты,

субстраты

гликолиза

Карболовые

кислоты,

. NADH

Субстратное

фосфолйро-

ванне

Декарбокси-

лазы,

редуктазы

Механическая

и электричес-

кая работа,

тепло, свет

Химическая

осмотическая

работа

Химическая

осмотическая

и механичес-

кая работа

Рис.

81. Схема путей образования и расходования унифицированных форм

энергии!

Среди названных в таблице 31 представителей многие нашли

применение в биотехнологии (аэробные и анаэробные виды), а ряд

из них относится к числу перспективных для практического ис-

пользования (метанобразующие бактерии, клеточные культуры

лекарственных растений и животных).

Следует подчеркнуть, что в сравнительном плане экономически

более выгодными являются анаэробные биотёхнологические про-

цессы, когда резко сокращаются затраты, связанные с подачей

стерильного воздуха в биореакторы (он здесь не нужен), с работой

мешалок и барботеров и др. А с этим упрощаются конструкции

аппаратов и происходит их удешевление.

6.6. Управление биотехнологическими процессами. Все био-

технологические процессы относят к числу управляемых, хотя

уровень управления различен, и он изменяется. со временем.

Поэтому неуправляемые процессы могут быть в природных усло-

виях (тогда они не относятся к разряду биотехнологических) или

они осуществляются с расчетом на саморегулируемость биообъек-

та. Абсолютно неуправляемых биотехнодогических процессов не

существует. Например, микробиологические процессы характери-

зуются рядом особенностей, которые необходимо учитывать при

конструировании оборудования. К таким особенностям относятся:

275

1) необходимость обеспечения стерильности (см. раздел 6.3) в

биореакторе, включая коммуникации, датчики, все продуктовые

потоки, идущие в реактор;

2) проведение культивирования аэробов и анаэробов в системах

"газ-жидкость-твердое тело" или анаэробов в системах "жидкость-

твердое тело" при низких скоростях биохимических процессов и

многокомпонентности состава питательных сред для выращивания

биообъектов;

3) исключительная сложность механизмов регуляции биосинте-

за БАВ (или выращивания биомассы клеток) при заметных изме-

нениях физико-химических показателей культуральных жидко-

стей;

4) заметная чувствительность биообъектов к воздействию фи-

зико-механических факторов при перемешивании и других опе-

рациях.

Чистота и стерильность — важнейшие составляющие благопо-

лучно проведенного биотехнологического процесса. Это достига-

ется при осуществлении подготовительных операций перед куль-

тивированием биообъекта, в том числе — стерилизации питатель-

ных сред, пеногасителей, различных жидких добавок, оборудова-

ния и коммуникаций, фильтров для очистки воздуха, использова-

ния высококачественного посевного материала.

Нарушение гарантированного "чистого" культивирования био-

объекта согласно регламентным условиям сопровождается, как

правило, его загрязнением контаминирующей микрофлорой. При

этом выявление микробов-загрязнителей может быть трудным

из-за присутствия единичных клеток, например, бактерий — кон-

таминантов в бактериальных вакцинах, или грибов-контаминантов

при культивировании грибов-продуцентов ферментов. В равной

мере можно ожидать загрязнения на промежуточных стадиях или

в конечном продукте бактериальных или грибных токсинов. К тому

же,

обнаружение микробов-контаминантов или их токсинов, как

правило, возможно после завершения какой-то стадии биотехно-

логического процесса, либо в готовом продукте. Следует еще

подчеркнуть и тот факт, что методы выявления посторонней

микрофлоры, к сожалению, в большинстве случаев низко чувст-

вительны.

Биообъект (клетки, ткани), будучи сложной системой, не под-

дается охвату единой математической моделью, а это исключает

возможность описания процесса культивирования конечным чис-

лом уравнений химической кинетики. Даже при гомогенно-непре-

рывном процессе культивирования в околоклеточных областях

276

биосистема гетерогенна (различие в массообмене в многофазной

среде

—

"газ-жидкость-твердое тело", "жидкость-твердое

тело"

при

различии структур оболочек, клеточных стенок, мембран, их адге-

зивной способности и пр.).

Биологические системы являются саморегулирующимися

(включая способность к мутациям), что может привести к непред-

виденному изменению биотехнологического процесса.

Утрата качеств биообъекта равноценна катастрофе. Здесь мож-

но указать на автоселекцию биообъекта в биореакторе, например,

какого-либо микроба-продуцента вторичного метаболита. Если в

ферментаторе объемом 50 м

при коэффициенте заполнения 0,6 и

длительности культивирования 4—5 суток будет содержаться

и более клеток, то, учитывая частоту спонтанных мутаций

• 10

—

• 10'', число мутантов может достичь величин 10

—10

за

генерацию. Поэтому не исключено, что процесс ферментации

может протекать вопреки регламентным требованиям.

Иногда автоселекция приобретает положительное значение в

том смысле, что, например, возврат к "дикому типу" в результате

спонтанных мутаций сопровождается более высокой скоростью

размножения культуры и тогда, стремясь к накоплению клеточной

белковой массы, мы получаем желанный результат.

Квалифицированное управление любым биотехнологическим

процессом основывается на глубине познания "поведенческих

реакций" биообъекта в конкретных условиях культивирования при

получении целевого продукта, когда с помощью соответствующего

приборного оснащения необходимо непрерывно или периодически

фиксировать контролируемые показатели (t°, рН, количество био-

массы клеток, скорость потребления источников питания, количе-

ство растворенного кислорода, количество образующегося мета-

болита и др.). При размножении и развитии клеток происходит

постоянное изменение отдельных параметров биотехнологическо-

го процесса, и в каждый данный момент эти клетки функциони-

руют в иных условиях.

Сложность биологических систем сказывается на необходимо-

сти многопрофильного контроля за ними, например, в биореакто-

рах (таблица 32). Указанные в таблице виды контроля в основном

характерны для культивирования биообъектов в реакторах боль-

шой емкости. На небольших биореакторах число контролируемых

параметров заметно сокращается (например, чаще регистрируют

лишь температуру, рН, подачу стерильного воздуха и количество

клеток

и/или

метаболита).

277

Т а б л и ц а 32.

Примерный перечень контролируемых параметров

при

выращивании клеток прокариот

эукариот

биореакторах

№

п/п

Гб

Параметр

Коэффициент

заполнения

Мощность

мешалки

Скорость

вращения

мешалки

Redox-

потенциал

Количество

растворенного

кислорода

Количество

растворенного

со

Обнаружение

пены

Вид

контроля

Физический

(светоопти-

ческий)

Механический

(внешний-

торсионная

динамометрия,

вйутренний-

тензодатчик)

Механический

(тахометрия)

Физический

/электропро-

водность

(определение

окислительно-

восстановит.

потенциала)/

Физико-

химический

(электрохими-

ческий

и др.)

Физико-

химический

(ИК-

спектрометрия

и др.)

Физический

(электро-

проводность)

№

п/п

Параметр.

Количество

биомассы

Температура

Скорость

потока газа

•

Скорость

добавления

питательных ••

веществ

растворах

Давление

Вязкость

рн

Отбор (слив)

культуральной

жидкости

Фермента-

тивная

активность

Антибиотичес-

кая

активность

Вид

контроля

Физический

(спектрофото-

метрия,

нефелометрия)

Физический.

(термометрия)*

Механический

(ротаметры,

расходомеры).

Механический

/расходомеры

(счетчик,

капель, •

динамомет-

рические

дат-

чики

и др.)/

Механический

(манометрия)

•

Физический

(вискози-

метрия)

Химический

(рН-метрия)

Механический

(регулиро-

вание

уровня,

динамо-

*метрический

датчик)

Еиохими- 1

ческий, 1

физико- 1

химический

Биологический,

химический,

физико-

химический

278

Продолжение табл. 32

Регулирование

пенообразо^

вания

Потребление

глюкозы

Потребление

азота

Механический

(механич.

устройство),

физико-

химический

(например,

силиконовый

эмульсионный

пеногаситель)

Химический

физико-

химический

Химический,

физико-

химический

Определение

ДНК, РНК

Определение

АТФ

Химический,

физико-

химический

Химический,

физико-

химический

В случаях накопления биомассы клеток в качестве антигенного

вещества можно воспользоваться серологическими методами,

включая иммуноферментные. Меченые радиоактивными изотопа-

ми антитела рекомендуют применять для определения антигенных

детерминант на поверхности клеток.

Контроль и управление биотехнологическими процессами, ре-

ализуемыми в периодическом или непрерывном режимах (даже

при использовании одних и тех же биообъектов), будут не одина-

ковыми. Например, одноклеточные культуры в глубинных услови-

ях в периодическом режиме проходят все фазы своего развития

(скрытую — lag, экспоненциальную

—

log, стационарную — const.,

отмирания— let). Поэтому продукция какого-либо вторичного

метаболита будет далеко неравнозначной в ту или иную фазу

развития продуцента. В непрерывном режиме клетки находятся,

как правило, в одной определенной фазе.

Нитчатые грибы растут верхушками гиф, поэтому у них со

временем изменяется не только масса грибницы, но и морфология

клеток. Если у прокариот количество клеточной массы возрастает

в течение log-фазы экспоненциально (в геометрической прогрес-

сии) , то грибы растут медленнее и не экспоненциально, биомасса

их клеток приблизительно пропорциональна третьей степени вре-

мени. Так, в глубинных условиях продуцент антибиотика цефаЛос-

порина С — Cephalosporium acremonium имеет три морфологиче-

ские формы: артроспоральную, фрагментарно-гифальную (набух-

шую) и гифальную, способных превращаться друг в друга при

изменении среды культивирования. Однако, антибиотик образу-

ется главным образом второй формой. Поэтому контроль и управ-

ление таким биотехнологическим процессом должен проводиться

с учетом указанных морфо-функциональных изменений продуцен-

та.

Уровень управления различается также в зависимости от ре-

жима проведения биотехнологического процесса: периодический,

полунепрерывный и непрерывный. Периодические процессы чаще

используются в случаях получения метаболитов (аминокислоты,

этанол, уксусная кислота и

др.),

полунепрерывные и непрерывные

— при наработке клеточной биомассы, например, дрожжей. Пол-

унепрерывные процессы отличаются от непрерывных тем, что при

их реализации периодически отбирают 25—75% культуральной

жидкости и добавляют равный объем свежей питательной среды.

Непрерывные процессы ведут в проточных реакторах-хемостатах

или турбидостатах (по лат. turbidus — мутный), в которые непре-

рывно дозированно поступает свежая питательная среда и непре-

рывно в таких же количествах отводится культуральная жидкость.

Таким образом, содержимое биореактора тождественно содержи-

мому отбираемой культуральной жидкости в каждый данный

момент. Такие хемостаты или турбидостаты используют в лабора-

торных условиях для изучения кинетики клеточного роста и мета-

болизма с последующей экстраполяцией результатов при масшта-

бировании процессов в крупногабаритных реакторах.

Различие хемостатов и турбидостатов заключается лишь в том,

что контроль за процессом включает фотоэлектрические элементы

за регуляцией подачи свежей питательной среды и отвода культу-

ральной жидкости.

Если бы рост (Н) ограничился вследствие истощения питатель-

ного вещества, то Н =

КС,

где К — константа, а С — начальная

концентрация лимитирующегося питательного вещества. Следова-

тельно, между

и Н существует прямая зависимость. Если какое-то

питательное вещество изначально содержится в довольно низкой

концентрации, то промежуточные метаболиты будут образовы-

ваться с ограниченной скоростью, и общая скорость роста будет

функцией концентрации названного выше вещества. Эксперимен-

тально установлено, что в соответствии с уравнением

Hv=H

]c~,——

получается кривая типа гиперболы. В этом уравнении

Ну—скорость роста, H

k—максимальная скорость роста, достигае-

мая при повышении концентрации питательного вещества; С—

концентрация лимитируемого питательного вещества;

i—величи-

280

на С, при которой Hv=l/2H

\a- Общий рост (Н) и скорость роста

(Hv) являются существенными критериями во многих биотехНоло-

гических процессах. Ими часто пользуются при выборе контроля,

например, за ходом накопления клеточной биомассы в качестве

целевого продукта. При периодических процессах с помощью

контрольно-измерительных приборов и автоматики (таймеры, ре-

ле,

датчики и др.) управляли биотехнологическими процессами.

Теперь пытаются заменять их ЭВМ, или компьютерами.

При непрерывных биотехнологических процессах управление

ими не усложняется, так как биосистемы здесь работают в опре-

деленных стационарных состояниях и на определенном этапе

сходны с системами, функционирующими в периодических режи-

мах. Однако биосистема изменяется на пути от начального (стар-

тового) периода к стационарному, и чем этот путь,короче, тем

лучше: Таким образом, в подобных случаях цель управления

фокусируется на поддержании заданного стационарного состоя-

ния, используя, например, микро-ЭВМ. На рис. 82 показана прин-

ципиальная схема работы ЭВМ.

Рис.

82. Архитектура и

принцип работы ЭВМ (по Л.

В.

Зудину,

В.

М. Каптере,

Г.

А.

Угодчикову, 1987): 1 — уст-

ройство управления, 2 —

ввод, 3

—

вывод, 4

—

арифме-

тическое устройство, 5 — ис-

ходные числа, 6 — промежу-

точный результат,

7 —

очеред-

ная команда, 8 — адресная

команда, 9 — код операции,

а—программа, в—запомина-

ющее устройство, б—данные,

г—результаты.

Некоторые микро-ЭВМ с количеством операций от 1000 до

500000 операций в секунду используются главным образом как

вычислительные (управляющие) блоки в системе управления и

регистрации.

Упомянутые ранее РО-статы (см. раздел 6.4), применяемые для

контроля и поддержания необходимого уровня растворенного

кислорода в питательных средах, обычно включают микрокомпь-

ютер,

интерфейс, расходомеры для воздуха и кислорода, и сенсоры

для растворенного О2.

281

Микрокомпьютеры используют также в комплексном контроле

за ферментацией при получении некоторых вторичных метаболи-

тов (например, этанола).

ЭВМ удобны в случаях одновременного контроля и учета

многих параметров. Функционально-законченный программно-уп-

равляемый малоразрядный блок, выполненный в виде одной или

нескольких больших интегральных схем, называют микро-

процессором (выполняет до нескольких миллионов операций

в секунду). Его используют для управления ферментационными

процессами. Микропроцессоры можно устанавливать непосредст-

венно на обслуживаемых аппаратах.

Оптимизацию процессов биологической технологии можно

расчленить на три уровня сложности. Первый — низший, решае-

мый обычно с помощью микро-ЭВМ, связан с регулированием

параметров биотехнологического процесса с помощью системы

обратной связи (рис. 83).

возмущение

заданное значение

регулируемого

параметра

измеряемый

параметр

регулируемого

параметра*

Рис.

83. Главные элементы системы управления с обратной связью: (1 —

регулятор, 2 — исполнительный механизм, 3 — процесс, 4 — измерительный

прибор).

Второй (средний) уровень рассчитан на более подробный ана-

лиз данных с последующим диалогом оператора с ЭВМ через

терминал. Здесь допустима работа с мини-ЭВМ с числом операций

от 100—300 тыс. до 1 млн. в секунду.

На третьем (наивысшем) уровне сложности применяют боль-

шие и супер-ЭВМ с числом операций от десятков-сотен тысяч до

млн.

операций в секунду. Информация, поступающая от первого

и второго уровней, используется для решения сложных модельных

уравнений в целях совершенствования режимов биотехнологиче-

ского процесса в

целом.

Указанные три уровня сложности расчетов

оптимизации условно представлены на рис. 84.

282

База данных

TEh^

Последующее моделирование

Графическое изучение -*&

Автономная

обработка

данных (ана-

лиза и

.т.

д.)

.•? а.

Документирование |—^¾

•[Помощь оператору г~*"<^

Изучение в реальном масштабе

времени

Обработка

данных в реаль-

ном масштабе

времени

—Q

-8

Усложнение системы

управления (в соответ-

ствии с программой

или алгоритмом)

Обычные системы

Измерение, ^¾¾¾¾^ управления

отображение

и хранение

данных

—<э

Запись данных в

аналоговой системе

Микробиологический процесс

Рис.

84. Три уровня сложности расчетов оптимизации микробиологического

процесса в биотехнологии (Л. Валентини, Ф. Андреони, М. Буволи, П. Пенелла,

1982).

В последнее десятилетие все больше расширяется применение

различных ЭВМ и микропроцессоров для управления биотехноло-

гическими процессами. Их конструкции постоянно совершенству-

ются, цены снижаются, а программное обеспечение заметно убы-

стряется. Тем не менее, многие существующие биотехнологиче-

ские производства частично или полностью еще нельзя отнести к

автоматизированным системам управления (АСУТП).

6. 7. Системы GLP и GMP в связи с качеством биотехнологи-

ческих продуктов.

целях организации качественного проведения

283

доклинических испытаний лекарственных и других биологически

активных веществ (пищевых добавок, агрохимикатов и др.) в

промышленно развитых странах (Англия, Германия, США, Фран-

ция, Япония и

др.)

утверждены единые правила системы GLP (Good

Laboratory

Practice).

Существует группа

GLP

в Европейском Центре

по экологии и токсикологии химической промышленности; в США

система GLP действует с июня 1979 г. Главными в такой системе

являются следующие основные действия:

1) заблаговременная разработка стандартной методики прове-

дения испытаний, или SOP (Standard Operating Procedure) приме-

нительно ко всем ее этапам;

2) назначение руководителя и ответственных за каждый вид

испытаний;

. 3) каждому ответственному исполнителю поручается строго

выполнять все операции в отведенных ему пределах;

4) результаты выполнения операций должны быть внесены в

специальный протокол, датированы и подписаны;

5) в, случае выполнения сложных операций, во избежание

ошибок, рекомендуется прибегать к двойной проверке;

6) в установленном порядке исполнитель докладывает руково-

дителю о ходе испытаний. Руководитель должен быть компетент-

ным во всех делах, связанных с испытанием;

7) фактические данные, записи и препараты (вещества) должны

храниться в полном порядке таким образом, чтобы всегда можно

было отыскать требуемое (необходимое);

8) окончательный отчет по своему содержанию должен отра-

жать свежие и еще не обработанные данные, а также сопровож-

даться обсуждением, составленным ответственным исполнителем;

на отчете прос:швляю^гсядата и подписи (отве^сттШШото-ясполни-

теля[^в^л1щТг1одтверждающих содержание отчета); ^

должна быть служба качественной оценки испытаний —QAU

(Quality Assuarance Unit). Лица, занятые в этой службе, обязаны

стремиться к тому, чтобы свою внутреннюю инспекцию проводить

в установленном порядке и по необходимости выдавать рекомен-

дации,гйсшравленные на совершенствование процессов проведе-

ния испытаний. . ~ ~

На систему GLP опираются в случаях испытания веществ: на

микробную обсемененность, на пирогенность; острую, пОдострую

и хроническую токсичность, на специфическую токсичность (кан-

церогенность, антигенность, лекарственную зависимость, повреж-

284