Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

Объемная продуктивность про-

цесса (Рср) — это количество целе-

вого продукта в ЕД активности или

в кг, получаемое с

питательной

среды в час. Расчет ведут следую-

щим образом:

периодический процесс

|В«да

Рср

—

~ср-

УсМс/Ю

, ЕД

Vnm-Xc м час

VcfC .кг

L,3 J

VnmXc м

час

непрерывный процесс

Рср

—

"ср

Mcf

, ЕД

Vnm

мучас

кг

пт м час

где

Рис.

93.

Ферментатор непрерывного

действия с эжекционной системой аэра-.

ции (Б-50): 1 — кольцевой Канал, 2 —

воздуховод, 3 — пеногаситель, 4 — се-

паратор, 5 — цилиндр, 6 — привод, 7 —

теплообменник, 8 — диффузор, 9 —

цилиндрический стакан, 10 — эжекци-

онное устройство.

Vnm(M

) — объем питательной среды.

Выход продукта от субстрата (ocs) — это количество целевого

продукта в ЕД активности или в кг, полученное из

кг компонента

ферментационной среды, являющегося энергоносителем. Тогда для

периодического процесса:

УсМс/Ю

Д4,

—

Н-Ч или

ms кг'

исходное содержание энергоносителя в субстрате; для непрерыв-

ного процесса:

Vcf-C .кг, . .

"• ~^Г~-Ы'

где ms

(

кг

) ~

n\s кг

Ас/Ю

ЕД

~ ,5b

кг

]

или a

= -£- [—], где So (кг/м

) — исходная

концентрация энергоносителя в субстрате. Степень использования

субстрата (U) выражается формулой:

U = —^—- , где So (кг/м

) — исходная концентрация энергоно-

оо

сителя в субстрате, Sk (кг/м

) — конечная крнцентрация энерго-

емкого компонента в субстрате. #

305

7.2.

Некоторые особенности культивирования биообъектов.

При периодическом культивировании целесообразно создать ис-

кусственно такое установившееся состояние, при котором концен-

трация клеток, удельная скорость роста и окружающая клетки

среда не изменялись бы со временем. Такие условия возможны

при непрерывном культивировании, когда клетки продуцента раз-

множаются со скоростью, зависящей от притока питательных

веществ и некоторых других условий. Часть объема культуральной

жидкости постоянно вытекает с той же скоростью,

какой подается

среда в аппарат. Метод проточного культивирования может быть

организован как процесс полного вытеснения и как процесс

полного смешения. Осуществление первого возможно для культи-

вирования анаэробных микроорганизмов в ферментаторе, пред-

ставляющем собой трубу, в которую с одного конца непрерывно

подают питательную среду и посевной материал, а из другого конца

отбирают культуральную жидкость. Процесс происходит без пе-

ремешивания и аэрации. Когда среда и посевной материал попа-

дают в ферментатор, популяция находится в лаг-фазе, а на выходе

из ферментатора культура может находиться в любой фазе в

зависимости от скорости подачи среды. В ферментаторе воспро-

изводится полная кривая размножения, но не во времени, а в

пространстве.

процессе полного смешения размножение культуры происхо-

дит в ферментаторе при интенсивном перемешивании и аэрации.

Во всем объеме культуральной жидкости условия должны быть

одинаковыми. При этом в ферментаторе могут быть созданы

условия, соответствующие любой точке кривой размножения куль-

туры, выращиваемой периодическим способом. Процесс полного

смешения может быть организован по типу системы "турбидостат"

и "хемостат".

В системе "турбидостат" в ферментаторе поддерживают плот-

ность популяции постоянной, и при быстром протоке среды созда-

ются условия, близкие к тем, которые соответствуют логарифми-

ческой фазе, при медленном — приближаются к условиям, соот-

ветствующим стационарной фазе. В установившемся режиме ра-

боты ферментатора удельная скорость протока среды равна удель-

ной скорости размножения культуры. Повышение скорости про-

тока или воздействие, замедляющее рост, приводят к тому, что

скорость размножения оказывается меньше скорости протока и

клетки культуры будут "вымыты" из ферментатора.

В системе "хемостат" величину клеточной популяции контроли-

руют с помощью отдельных компонентов питательной среды.

306

Среду составляют так, чтобы один из компонентов, необходимый

для роста биомассы клеток, был в недостатке или лимитировал

рост, поддерживая тем самым культуру в нужном состоянии.

Используя батарею ферментаторов, можно в каждом аппарате

постоянно поддерживать продуцент в определенной фазе размно-

жения.

В настоящее время непрерывное культивирование применяют

для получения белково-витаминных концентратов

(БВК),

кормовых

дрожжей, лимонной кислоты, лизина.

Культивирование м'акромицетов в специально подобранных

условиях характеризуется некоторыми особенностями. Во-первых,

в стационарных условиях базидиомицеты формируют плотные

пленки на поверхности жидких питательных сред; во-вторых, в

глубинных культурах они образуют агломераты. Поэтому, напри-

мер,

при выращивании вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus)

соблюдают следующую очередность этапов: культивирование

грибного мицелия в колбах на качалке, дезинтеграция мицелиаль-

ных агрегатов да частиц размером 100—200 мкм (инокулят), засев

ферментационной среды (0,4—0,5 г/л по сухой массе гриба) и

выращивание гриба в течение 5 суток на специальной синтетиче-

ской питательной среде до получения примерно 6 г/л биомассы

клеток

по.

сухой массе (рис. 94).

•Л

5Э

12 3 4 6

Рис.

94. Схема получения мицелия вешенки обыкновенной для пищевых целей

(периодическое культивирование):

1 —

семисуточная культура P.ostreatus в пробир-

ке на сусло-агаре, 2 — шестисуточная стационарная культура на жидкой среде в

колбе с отбойниками и периодическим встряхиванием в течение 5 мин., 3 —

четырехсуточная культура в колбах на качалке, 4 — дезинтеграция грибных

агломератов до частиц размером 100—200 мкм, 5 — инокулят

0,4—0,5

г/л, 6 —

культивирование в ферментаторе в течение 5 сут.,

— отделение конечного продукта

(мицелия).

В производстве антибиотиков, наряду с периодическим куль-

тивированием, все чаще начинают использовать методы, занима-

ющие промежуточное положение между периодическим и непре-

рывным культивированием, то есть полунепрерывный отъемно-до-

ливной метод. Таким способом удается в 2-3 раза увеличить время

307

пребывания продуцента в активной фазе. Недостаток состоит в

том, что доливы осуществляют питательной средой полного соста-

ва. Этого недостатка лишен метод полунепрерывной регулируемой

ферментации. Суть этого метода состоит в том, что в определенное

время, начиная с логарифмической фазы размножения, по специ-

ально разработанной программе, в культуральную жидкость до-

бавляют отдельные компоненты питательной среды (раствор Саха-

ров,

аммония сульфат, жир и т. д.), поддерживая их концентрацию

на постоянном благоприятном уровне — вначале для роста био-

массы клеток, а затем — для синтеза целевого продукта.

Периодически из ферментатора отбирают определенные объ-

емы культуральной жидкости со все возрастающей концентрацией

целевого продукта. Ферментацию прекращают после того как

активность продукта достигла максимума. Этим способом удается

не только продлить активную фазу, в которой находится продуцент,

но и повысить степень использования им субстрата, а в конечном

итоге — продуктивность процесса, то есть увеличить выход конеч-

ного продукта в расчете на потребленный субстрат.

Из всего разнообразия способов проведения процессов био-

технологии наиболее сложными являются регулируемые фермен-

тации с соблюдением условий асептики. Реализация таких процес-

сов рассчитана на использование ЭВМ при соответствующем

программном обеспечении. Кроме того для проведения процесса

в асептичных условиях необходимо введение дополнительных

стадий, обеспечивающих стерилизацию питательных сред и пода-

ваемого в ферментаторы воздуха.

Стерильную питательную среду в инокуляторе — посевном

аппарате первой ступени (рис. 95) засевают с соблюдением правил

асептики через специальное устройство посевным материалом,

который предварительно был выращен в колбах (в лаборатории)..

Технологи создают и поддерживают необходимые режимы в

аппарате для размножения клеток продуцента (температуру, аэра-

цию и перемешивание), а микробиологи контролируют и оцени-

вают развитие культуры. При достижении требуемых стадий раз-

вития и количества биомассы посевной материал передавливают

стерильным сжатым воздухом по посевному коллектору

посевной

аппарат большей вместимости. На этой второй ступени выращи-

вания посевного материала стремятся получить больше биомассы

клеток, чтобы в ферментаторе можно было создать необходимую

для данного штамма продуцента исходную плотность популяции.

jso , да

Рис.

95. Инокулятор: 1 — кор-

пус,

2.— лаз, 3 — смотровое окно,

4 — аэратор, 5 — труба для пере-

пуска посевной культуры в фер-

ментатор, 6 — диффузор, 7 — ру-

башка, 8 —.гильза для термометра,

9 — розетка аэратора, 10—12 —

штуцера для манометра, гильзы

•термометра и трубы для передав-

ливания, 13—17 — штуцера для

загрузки среды, аэратора, выхода

воздуха, отбора проб и выхода во-

ды,

18 — штуцер для спуска жид-

кости.

Если это требование выполнимо без второй ступени, то фермен-

тационную среду засевают непосредственно из инокулятора.

Биосинтез целевого продукта в ферментаторе происходит при

заданных температурном режиме, аэрации, перемешивании и рН

культуральной жидкости; величину рН обычно регулируют пери-

одической подачей аммиачной воды через барботер ферментатора.

В случае пенообразования подают стерильный пеногаситель из

специального аппарата по сигналу датчика уровнягпены.

Для поддержания постоянства концентраций отдельных ком-

309

понентов питательной среды их подают в виде стерильных раство-

ров по команде ЭВМ с определенной скоростью и периодичностью

в ферментатор из специальных аппаратов.

Все ферментаторы цеха соединены между собой несколькими

коллекторами:

— посевным, благодаря которому можно засевать

среду в любом ферментаторе из любого посевного аппарата; 2 —

коллектором подачи стерильной питательной среды; 3 — коллек-

тором подвода стерильного сжатого воздуха к индивидуальным

фильтрам; 4 — коллектором отработанного воздуха, выходящего

из ферментатора; 5 — коллектором перекачивания культуральной

жидкости из ферментатора (рис. 96).

Рис.

96. Аппаратурно-технологическое оформление процесса ферментации в

производстве пенициллина:

— сборник нативного раствора, 2, 3, 7, 11, 13, 15, 16

— эмульгаторы, 4 — сборник серной кислоты, 5 — сборник бутилацетата, б, 9, 12,'

14,

17 —

экстракторы-сепараторы, 8

—

сборник обессоленной воды,

10 —

сборник

I бутилацетатного экстракта,

— сборник бикарбонатного раствора,

— аппарат

для вымораживания и обработки углем, 20, 24, 25, 28 — фильтры, 21 — реактор

для получения калиевой соли бензилпенициллина, 22 — сборник раствора калия

карбоната, 23

—

сборник раствора калия ацетата, 26

—

вакуум-выпарной аппарат,

27 — теплообменник, 29 — сборник бутанола.

В случаях проведения ферментации заведомо в нестерильных

условиях питательную среду и воздух для аэрации не стерилизуют,

но посевной материал всегда выращивают на стерильных пита-

тельных средах в асептических условиях.

7.2.1.

Приготовление и стерилизаций питательных сред. В

статьях расходов в производстве продуктов микробного синтеза

одно из первых мест занимает сырье. При производстве

• 10

ЕД

310

пенициллина, например, необходимо израсходовать 6,7 кг сырья.

Для проведения ферментационных процессов, наряду с очень

дорогим пищевым сырьем, таким как мука кукурузная, соевая,

пшеничная, крахмал, пищевой сахар, глюкоза, лактоза, раститель-

ные масла, лярд, применяют и значительно более дешевые, явля-

ющиеся отходами пищевой промышленности — гидрол, меласса,

зеленая патока, молочная сыворотка, кукурузный экстракт, рыб-

но-костная мука, гидролизаты кукурузных кочерыжек, соломы,

подсолнечной мезги, а также специально получаемые продукты —

гидролизаты древесины и торфа, парафины нефти, метан, этанол

и др.

Жидкие компоненты питательных сред (кукурузный экстракт,

зеленую патоку, мелассу, гидрол, растительные масла, рыбий жир)

доставляют в железнодорожных цистернах

хранят в специальных

сборниках на складах заводов и транспортируют по коммуника-

циям с помощью вакуума, сжатого воздуха или перекачивают

насосами. Дозировку жидких компонентов осуществляют по массе

или по объему в соответствии с прописью среды и контрольными

показателями каждой партии этого нестандартного вида сырья.

Сыпучие компоненты сред из транспортной тары забирают или

в специальные бункеры или хранят на складах в исходной упаков-

ке.

Для транспортировки сыпучих компонентов используют лен-

точные и винтовые конвейры, элеваторы, пневматический транс-

порт.

Процесс приготовления питательных сред, независимо от того,

сложен он технологически или прост, всегда очень ответственен,

так как от качества питательной среды во многом зависит результат

проведения ферментации.

Жидкие питательные среды приготовляют в аппаратах-смеси-

телях с мешалкой, куда загружают отдельные компоненты в опре-

деленной последовательности, установленной по регламенту

(рис.

97).

Приготовление сложных комплексных сред, в состав которых,

кроме минеральных компонентов и Сахаров, входит мука, крахмал,

кукурузный экстракт, проводят в нескольких смесителях. Куку-

рузный экстракт обычно кипятят с мелом для нейтрализации

содержащихся в нем аминокислот и органических кислот. Муку,

крахмал предварительно заваривают и тщательно перемешивают,

чтобы не допустить образования крупных комков, которые могут

быть причиной нестерильных операций, поэтому реакторы должны

быть снабжены барботерами для подачи пара.

311

приготовление концентрата

питательной среды

перемешивание

нагрев до температуры

стерилизации

нагретый

(нестерильный}

концентрат

среды

выдержка

охлаждение

Рис.

97. Принципиальная схема процесса приготовления и тепловой

стерилизации питательной среды.

312

Часто для снижения вязкости питательной среды, содержащей

достаточно большую концентрацию кукурузной муки или крахма-

ла, проводят их частичный гидролиз амилолитическим ферментом

— оризином (продуцент — Aspergillus oryzae) с последующей его

инактивацией нагреванием. Иногда необходимость проведения

такой операции обусловлена физиологией продуцента, для кото-

рого предназначается среда.

В связи с тем, что в большинстве своем питательные среды

имеют жидкую и твердую фазы, возникает необходимость тонкого

измельчения твердых компонентов — отрубей, муки грубого по-

мола, рыбно-костной муки, соевого жмыха.

этих целях с большой

эффективностью используют роторно-пульсационный аппарат,

или РПА, через который пропускают суспензию компонента перед

завариванием или после него. Благодаря этой процедуре не только

избавляются от комков, образовавшихся при заваривании, но и

повышают степень использования сырья, равно как и получают

возможность применять отдельные виды сырья (например, среды

с рыбно-костной мукой, плохо подд

аю

Щиеся стерилизации из-за

большого количества рыбьих глаз).

Растворы Сахаров, нуждающиеся в более щадящих режимах

стерилизации, рекомендуют готовить и стерилизовать отдельно,

смешивая с основной средой только в ферментаторе.

Некоторые виды сырья, например, соевая мука, вызывают

повышенное вспенивание среды, поэтому для снижения пенооб-

разования при стерилизации в такие среды добавляют жир в

качестве пеногасителя. Подобная мера вызвана технологической

необходимостью, в принципе, добавление жира в среду повышает

устойчивость спор к тепловому воздействию и поэтому крайне

нежелательно. Все жировые компоненты сред необходимо стери-

лизовать

отдельно.

Для этого, как правило, предварительно готовят

водно-масляную или водно-.жировую эмульсию с хозяйственным

мылом, повышающим ее стойкость.

Качество используемой воды зависит от назначения питатель-

ной среды. Чаще всего применяют артезианскую, реже — водо-

проводную воду. В крупнотоннажных производствах кормовых

дрожжей и белкововитаминных концентратов (БВК) используют

воду, полученную по замкнутому циклу этого производства, то есть

прошедшую очистные сооружения. В производстве кровезамени-

телей используют только апирогенную воду (бидистиллят).

Под стерилизацией сред обычно понимают любой метод воз-

действия, обеспечивающий удаление из них микробов — конта-

313

минантов или разрушение последних. Наиболее распространен-

ным и универсальным среди возможных методов, вызывающих

деструкцию микроорганизмов, является метод основанный на

использовании влажного тепла. Характерной особенностью, отли-

чающей действие влажного тепла на микроорганизмы и химиче-

ские вещества, является высокая энергия активации ц, которая

характерна для микробов (таблица 35).

Таблица 35. Значение энергии активации бактериальных спор и некоторых

витаминов

Объект

Baccillus subtilis

-" - stearothennophilus

Clostridium botulinum

Тиамин гидрохлорид

Фолиевая кислота

Энергия активизации ц , Дж/моль

318440

266903

343580

92180

70392

По разнице значений энергии активации можно говорить о

том, что одинаковое приращение температуры оказывает разное

влияние на гибель спор и термическую деструкцию химических

соединений. Как видно из таблицы 35, споры палочки ботулизма

наиболее чувствительны к воздействию влажного тепла, а фолие-

вая кислота меньше подвержена деструкции по сравнению с

тиамином. На практике главная цель стерилизации — достижение

стерильности, но сохранение качества питательной среды также

имеет важное значение, так как непосредственно от этого будет

зависеть результат процесса ферментации. Благодаря различиям

в энергии активации отмирание термостойких спор при высоких

температурах происходит значительно быстрее, чем скорость хи-

мической реакции. Длительность экспозиции, или время вы-

держки— это тот временной интервал, в пределах которого

погибают микроорганизмы. Гибель последних спор в среде явля-

ется случайным процессом, поэтому введено понятие "критерий

стерильности" (N) — отношение числа операций стерилизации, в

результате которых выжили по одной термостойкой споре, к

общему числу проведенных операций. Для стерилизации сред

принимают критерий стерильности, равный 0,01 ±

0,001.

Если

исходное количество спор в среде принять

No,

то получим соотно-

шение N/N

— уровень стерильности или коэффициент выжива-

ния, который означает, что для достижения заданного критерия

314