Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

которой предполагают его выделить, а также для коагуляции

коллоидных примесей

и,

следовательно, улучшения процесса филь-

трации, для удаления или связывания в растворимые комплексы

тех побочных веществ, которые затрудняют последующий процесс

химической очистки. К тому же при коагуляции изменяется струк-

тура твердой фазы культуральной жидкости.

Применяют несколько видов коагуляции: неорганическими

солевыми электролитами, органическими и неорганическими кис-

лотами, термической обработкой, добавлением веществ, образую-

щих наполнители. Например, при добавлении к культуральной

жидкости раствора жидкого стекла (Na2Si03),H натрия моногидро-

фрсфата, в результате взаимодействия с ионами кальция, находя-

щимися в культуральной жидкости, образуется осадок наполните-

лей:

Са

+ Na2Si0

^CaSi0

4- + 2Na

Са

+ Na

HP0

->CaHP044 + 2Na

Процесс образования хлопьевидного осадка наполнителя про-

текает с большой скоростью, осадок захватывает гифы мицелия и

молекулы белка.

Процесс коагуляции улучшается при использовании комбини-

рованных методов таких, как кислотная и тепловая, электролитная

и тепловая коагуляции.

Эффективным методом коагуляции дисперсных систем явля-

ется обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами —

ф л о к к у л я н т а м и. При этом в отличие от обычной коагуляции,

образуются флоккулы или осадки рыхлой структуры, что значи-

тельно улучшает процесс фильтрации.

Для получения нативного раствора из труднофильтруемых

культуральных жидкостей после коагуляции применяют вакуум-

барабанный фильтр с намывным слоем — аппарат полунепрерыв-

ного действия. Перед работой на фильтрующую поверхность ба-

рабана намывают дренажный слой наполнителя.

качестве напол-

нителя используют суспензию порошков целлюлозы, перлита,

древесной муки. Особенность работы такого фильтра (в отличие

от вакуум-барабанного) состоит в том, что нож, предназначенный

для съема осадка с барабана, имеет специальную микрометриче-

скую подачу. С каждым оборотом барабана нож подается к центру,

срезая нафильтрованный осадок вместе с тонким слоем дренажа,

обновляя таким образом фильтрующую поверхность; поэтому

скорость фильтрации не снижается. На рис. 108 представлена

схема аппаратурного оформления процесса фильтрации культу-

335

ральной жидкости на вакуум-барабанном фильтре с намывным

слоем.

промывная года

вакуум '_

Рис.

108. Схема аппаратурного оформления процесса фильтрации на вакуум-

барабанном фильтре с намывным слоем:

Г —

аппарат для суспензии вспомогатель-

ного материала, 2, 4,7 — насосы, 3 — коагулятор, 5 — вакуум-барабанный фильтр

с намывным слоем, 6 — ресивер. .

Названный выше перлит представляет собой стекловидную

горную породу вулканического происхождения, в состав

его

входят

окислы кремния, калия и

кальция.

Для получения вспомогательного

.вещества природный перлит нагревают до начала плавления

(1000°С). Образуются небольшие бусинки неправильной формы,

состоящие из очень большого числа полых ячеек. Для получения

вспомогательного фильтрующего материала бусинки измельчают-

ся.

Получают порошок с пористостью 85—90% и объемной массой

500—1000 кг/м

Экстракционный метод выделения целевого вещества из на-

тивного раствора основан на различной растворимости разных

химических форм этого вещества в воде и органическом раство-

рителе, не смешивающимся с водой. Основной закон экстракции

закон распределения Нернста:

К =

—г-,

где К — коэффициент

Со

распределения, Со — концентрация компонента в экстрагируе-

мой жидкости, Со •—концентрация компонента в экстракте. Коэф-

336

фициент распределения — величина, определяемая опытным пу-

тем, показывает во сколько раз равновесная концентрация веще-

ства в экстракте больше, чем в обработанном растворе. Например,

в случае экстракции пенициллина из нативного раствора бутила-

цетатом при температуре

0°С

и рН

2,5

коэффициент распределения

К=35.

Это значит, что при остаточном содержании пенициллина

в нативном растворе 200 ЕД/мл, равновесная активность бугила-

цетатного экстракта составит 7000 ЕД/мл. Это позволяет одновре-

менно и концентрировать целевой продукт и очищать его от

сопутствующих примесей.

Классическим примером применения экстракционного метода

в системе "жидкость-жидкость" для выделения й очистки продук-

тов микробного синеза являемся схема получения пенициллина,

представленная на рис. 96.

Нативный раствор, содержащий бензилпенициллин, из сборни-

ка

(1)

поступает на первую экстракцию бутилацетатом. Экстракция

—массообменный процесс, и он протекает тем быстрее, чем ин*-

тенсивнее входят в соприкосновение друг с другом несмешиваю-

щиеся жидкости. Поэтому очень важно провести эмульгирование

(3),

но при этом эмульсия должна хорошо разделяться^ сепараторе

"(6).

В связи с тем, что нативный раствор содержит большое

количество поверхностно-активных веществ белковой природы, в

процессе экстракции образуются весьма стойкие» трудноразделя-

емые эмульсии. Это требует применения специальных дезэмуль-

гаторов, например, поверхностно-активное вещество — авироль.

Действие "авироля основано на том, что он вытесняет белковые

вещества из межфазовой поверхности, образуя пленку на границе

раздела фаз (между водой и бутилацетатом). Пленки, образованные-

ПАВ',

обладают незначительной прочностью по сравнению с плен-

ками из белка, поэтому эмульсии легко разрушаются под влиянием

центробежных сил, развиваемых в сепараторах. Для разделения

эмульсий достаточно добавить к нативному раствору 0,05—0,1%

ПАВ.

Экстракцию проводят при рН 2,8±3,0 и температуре 10°С.

Подкислением нативного раствора серной кислотой (2) подавляют

диссоциацию карбоксильной группы молекулы пенициллина, в

недиссоциированном состоянии он переходит вг органическую

фазу (бутилацетат). Высокая селективность экстракции достигает-

ся благодаря тому, что в области рН 2,8± 3,0 более сильные кислоты,

чем пенициллин, находятся в диссоциированном состоянии й

поэтому не растворяются в бугилацетате; в водной фазе остаются

337 - '

минеральные компоненты (загрязнения), большая часть азотистых

соединений

других органических веществ,

так что

результате

экстракции чистота продукта увеличивается

4—5

раз.

Первый бутилацетатныи экстракт пенициллина промывают

обессоленной водой

эмульгаторе

(7) и

сепараторе

(9),

затем

подают

на

бикарбонатную экстракцию-двухступенчатую.

На

пер-

вой ступени экстракцию проводят

эмульгаторе (11)

экстракторе

— сепараторе

(12)

обедненным бикарбонатным экстрактом

со

второй ступени бикарбонатной экстракции. Обедненный бикар-

бонатный экстракт пенициллина поступает

на

новую ступень

бикарбонатной экстракции

эмульгатор (13)

экстрактор-сепара-

тор

(14).

Экстракцию бикарбонатом натрия проводят

при рН

7,3-5-7,8.

При

этих условиях пенициллин находится

диссоцииро-

ванном состоянии

поэтому хорошо растворяется

водной фазе,

но не растворяется

органической фазе. На данной стадии удается

освободиться от примесей, являющихся более слабыми кислотами,

чем бензилпенициллин,

сконцентрировать раствор

раза.

Из бикарбонатного экстракта антибиотик вторично экстраги-

руют бутилацетатом

при

рН

2,2

2,5

эмульгаторах (15,16)

экстракторе-сепараторе

(17).

Второй бутилацетатныи экстракт бензилпенициллина поступает

на осветление углем

на

вымораживание

(19).

помощью угля

освобождаются

от

оставшихся пигментов.

При

вымораживании

(—5°С)

вместе

замерзающей водой удаляются сульфаты.

Освобождение

от

угля

льда осуществляют

помощью филь-

трации

(20),

затем второй бутилацетатныи экстракт поступает

реактор

(21) для

получения калиевой соли бензилпенициллина.

реактор добавляют насыщенный раствор калия уксуснокислого

раствор калия углекислого (донор ионов калия).

/Ч

CH.-CK-CO-NH-CH-CH

C(CHJ,

^ || | +

СН

СООК

—>

ОС

CH-GOOK

—>•

-CH

-CO-NH-CH-CH

с(сн

)

ОС

СН-СООК.

2CH

COOH+K

COj->2CH

COOK-l-H

0+C02

CHjCOOH

338

Образовавшаяся калиевая соль бензилпенициллина переходит

снова в водную фазу. Водный слой и бутилацетат разделяют при

отстаивании (контроль за разделением проводят визуально через

смотровое стекло, установленное на трубопроводе).

Водный концентрат калиевой соли бензилпенициллина после

фильтрации (24) передают на вакуум-упаривание (26) и кристал-

лизацию. Этот процесс является процессом кристаллизации со

сменой растворителя. Калиевая соль бензилпенициллина кристал-

лизуется в бутаноле после выпаривания воды,

случае проведения

процесса при пониженной температуре к водному раствору добав-

ляют

бутанол.

Образовавшуюся азеотропную смесь "бутанол-вода"

отгоняют при

20°С.

Кристаллы отфильтровывают от маточника

(28),

промывают безводным бутанолом и высушивают.

Выделение и очистка канамицина из нативных растворов ос-

нована на ионообменных методах. Канамицин — антибиотик

основного характера, его выделяют из нативных растворов сорб-

ционным методом. Для удаления ионов кальция культуральную

жидкость обрабатывают щавелевой кислотой. После отделения

осадка нативный раствор,(рН 6,8-*-7,2), содержащий канамицин

поступает на ионообменные колонны (рис.

109).

При этих условиях

канамицин представляет собой шестивалентный катион.

Антибиотик сорбируется на карбоксильном катионите КБ-2 в

натриевой форме, так как активные центры этого сорбента заняты

ионом натрия. Процесс сорбции идет по схеме:

6RCOONa+KaH.

-* (RCOO)

Кан.Ч- 6Na

Нативный раствор канамицина проходит через батарею после-

довательно соединенных колонн (5—7). Раствор подают снизу, так

как сорбция протекает во взвешенном слое сорбента. Здесь важ-

ным является выбор рабочей скорости (W

6.), которая должна

быть больше критической скорости (W

pirr.), определяющей про-

цесс псевдоожижения, и меньше скорости уноса

(WyH.) —

скорость,

при которой сорбент уносится с раствором из колонны,

Сорбцию ведут до тех пор, пока в отработанном растворе не

останется порядка 5—6% концентрации антибиотика от исходной.

Каждую колонну в батарее отключают после полного насыще-

ния, промывают обессоленной водой (1) и подвергают десорбции.

Десорбцию канамицина проводят IN раствором аммиака (2) или

элюатом третьей фракции (10), укрепленным 25% раствором ам-

миака. Процесс проводят в соответствии с реакцией (при подаче

раствора сверху):

339

на очисту стопи |

Рис.

10М1ринципйальная схема

получения.

канамицинЬ:

1 *- сборник обессо-

ленной воды, 2 — сборник Гн, р-ра Nl-kOH , 3 -- сборник 1 н. р-на HCL, 4 —

сборник 1 н. р-на NaOH, 5, 6, 7 — колонны с катионитом КБ-2, 8, 9, 10 — сборник

элюата, I,

и III фракций соответственно ,11,12

—

кОлонны-о анионитом АВ-1-7

-2П,

13:—сборник осветленного элюата,

14'—

вакуум-выпарной аппарат,

15 —

реактор

для подкисления и обработки углем,

16,

— фильтры,

17 —

сборник осветленного

концентрата, 18, 19 — колонны с катионитом КУ-2--20, 20 — реактор для подщела-

чивания,-22 — аппарат для кристаллизации, 23

•—

центрифуга.

(RCOO)e Кан + 6ЫЩ-> 6RCOONH4 + Кан

Ионы NH5 в растворе аммиака не вытесняют катионы со

смолы, поэтому элюаты содержат незначительные количества при-

месей минеральных солей. При этом образуются 3 фракции, из

"которых первая с небольшим содержанием канамицина (8) посту-

пает на очистку стоков; вторую фракцию — основную собирают

в сборнике (9); третью фракцию из сборника (10) возвращают для

десорбции канамицина с сорбента.

Сорбент КБ-2 в колонне после трехкратного использования

, подвергают регенерации, которую последовательно проводят IN

340

раствором HCL (3), обессоленной водой, IN раствором NaOH(4) и

повторно — обессоленной водой. Все отработанные растворы

сливают в специальную "кислотно-щелочную канализацию".

Таким образом, на каждой колонне с сорбентом КБ-2 много-

кратно повторяются процессы сорбции, десорбции, регенерации.

Дальнейшей очистке подвергают вторую фракцию элюата кана-

мицина. Эта фракция поступает на осветление на колонны с

анионитом АВ—'17—2П в ОН" форме (11, 12). Данный анионит

избирательно поглощает пигментные вещества и не сорбирует

антибиотик. Раствор подают сверху; он проходит через две после-

довательно соединенные колонны. Осветленный раствор канами-

цина собирают в сборнике (13), а сорбент регенерируют последо-

вательным пропусканием растворов -HCL, обессоленной воды,

NaOH и вновь — обессоленной воды.

-Из"

сборника (13) раствор

подают для концентрирования в вакуум-выпарной" аппарат (14),

представляющий собой вертикальный кожухотрубчатый испари-

тель пленочного

типа.

Испарение протекает при

80°С

под вакуумом.

Концентрат направляют в реактор (15) для обработки углем. Про-'

цесс осуществляют при рН

4,2

—

5,2.

В качестве подкисляющего

агента используют 25% раствор H2SO4. После фильтрации (16)

прозрачный, осветленный концентрат канамицина (17) поступает

. на обеззоливание, которое проводят на колоннах с катионитом

КУ-2-20 в Н

форме.

' .--'--

После пропускания раствора канамицина сорбент регенериру-

ют с- помощью IN .раствора HGL s последующей промывкой

обессоленной водой. - ". . - ,

Обессоленный концентрат канамицина (20) после фильтрации

(21) поступает на кристаллизацию (22). Кристаллизацию моносуль-

фата канамицина проводят при добавлении двойного объема 98%

метанола при рН 9,3

—

9,7.

Кристаллы отделяют на центрифуге (23)

и передают на высушивание. * ' \ •

7.5. Аппаратурное оснащение фитобиотехнологических про-

изводств. Особенностями растительных клеток. являются; их

склонность к

б&ьедйнению в тканевые' структуры, которые ,в

целостном организме -"омываются" жидкостями определенного

состава, содержащими многие регуляторные вещества, оказываю-

щие заметное влияние на функцию тканей; малые скорости роста

и развития растительных клеток, а некоторые из них вообще не

культивируются в глубинных условиях на жидких питательных

средах; хемогетеротрофизм (а не фотоавтотрофизм) растущих

клеток в культуре; синтез целевого продукта лишь агломератами

341

о о

А О А

м~—

?и

клеток в одних случаях (не отдельными клетками) — здесь сказы-

вается позитивная роль дифференциации в клеточных агломера-

тах, и, напротив, недифференцирован-

ное состояние клеток в культуре может

быть более предпочтительным — в дру-

гих случаях.

В зависимости от вида и потребно-

стей клеток их культивируют в разных

биореакторах

(с

механическим переме-

шиванием, колонного типа с переме-

шиванием (рис. ПО)). Фирма "Sigma"

(США) выпускает мембранные наборы p„

. Биореакторы

для

вы-

(Rafts) для растительных культур тка- ращивания растительных клеток:

ней, что помогает исключить ингибито- а — ферментатор с подачей сте-

ры,

нередко присутствующие В агар- Рильного воздуха снизу, б-фер-

ментатор с продувкой стериль-

агаре и других желирующих агентах.

„^^J^J^

отводной трубой.

Мембранные наборы (Rafts) предназна-

чены для выращивания протопласти-

рованных и других культур, которые

могут поддерживаться длительное

время без смены культурального кон-

тейнера.

Мембранные наборы (Rafts) име-

ют квадратную (60x60 мм и др.) или

^1ШЗ£ШНШИ круглую (73 мм в диаметре и др.)

форму. Их изготавливают из поли-

Рис.

ш. Мембрана, используе- пропилена

размером

пор,

в среднем,

мая при выращивании раститель-

0,075x0,25

мкм (площадывсех пор за-

ных клеток, х 10000.

_„, ' .

нимает порядка 45% мембраны), тол-

щиной 25 мкм; они пригодны для про-

тока воды 288 л/м

/час. Мембраны ус-

тойчивы к действию сильных кислот,

оснований и к органическим раствори-

телям (за исключением галогенизиро-

ванных углеводородов). На

рис.

111,112

представлены мембрана и мембранный

контейнер.

Та же фирма "Sigma" предлагает так

называемый фитатрей (от англ. tray —

. Рис. 112. Мембранный кон-

поднос) для растительных клеточных

тейнер

выращ

вания расти

культур (рис. 113); размеры

342

его тельных культур тканей.

Рис.

113. Фитатрей.

92x114x89 мм. Каждый фитатрей упако-

вывают в ящики по 100 кювет и крышек

на ящик. Составные части фитатрея сте-

ри\изуют гамма-облучением, после чего

они готовы к применению по назначе-

нию.

Для культивирования растительных

* клеток разработаны специальные био-

-реакторы различной емкости. Принци-

пиальная схема одного из них показана

на рис. 85. Здесь также можно исполь-

зовать ферментатор Био-Фло III

(см.

раз-

дел 7.1.).

7.6. Аппаратурное оснащение зообиотехнологических произ-

водств. К зообиотехнологжческим относятся производства: вакцин,

моноклональных антител, лимфокинов (медиаторов иммунокомпе-

тентных клеток), других белков (в том числе — ферментов),

гормонов и пр. Ряд биологически активных веществ образуется

эукариотическими клетками лишь в результате посттрансляцион-

ной модификации. К этому неспособны прокариотические клетки.

Клетки млекопитающих не имеют клеточной стенки и их

протоплазматическое содержимое защищено лишь тонкой клеточ-

ной мембраной. Они всегда представляют собой часть какой-то

специализированной ткани и, следовательно, зависят от жизнеде-

ятельности других клеток. Поэтому существование животных кле-

ток в изолированном состоянии весьма ограничено и, порой,

исключительно трудно воспроизводимо в

ла-

щ.

бораторных и, тем более, в производствен-

ных условиях. К тому же и растут они срав-

нительно медленно (см. рис. 89). Тем не

менее, успехи в зообиотехнологии весьма

ощутимы и этому способствовали приемле-

мые методы культивирования их в подходя-

щих условиях (рис. 114).

Выращивание животных клеток условно

можно подразделить на следующие этапы: I

— механическая и ферментативная дезин-

теграция ткани животного до получения сме-

си клеток или их агломератов;

II — перенос клеток или их агломератов стиковом культуральном

в питательную среду во флаконах; сосуде (увеличение

х40).

343

Рис.

114. Раковые клет-

ки человека (HeLa) в пла-

III — отделение клеток от дна флакона с помощью фермента и

перенос их в другой флакон со свежей питательной средой для

размножения;

IV — перенос клеток в биореактор и накопление целевого

продукта;

V — выделение целевого продукта.

Первый этап исключают в случае использования клеток крови,

лимфы, опухолей и некоторых других трансформированных кле-

ток, поскольку они растут в виде суспензионных культур. Все

другие животные клетки прикрепляются к какой-то поверхности.

Поэтому ткани, из которых получают такие клетки, дезинтегриру-

ют в тканевых-гомогенизаторах и обрабатывают протеазой, цент-

рифугируют при небольших скоростях ротора во избежание трав-

. мирования клеток.

На втором и третьем этапах осуществляют выращивание и

наращивание клеток ро флаконах или в горизонтально располо-

женных и медленно вращающихся (порядка одного оборота в мин.)

бутылях. Самые большие бутыли имеют

пло-

щадь около 1600 см-

. Отделение клеток от

доньев флаконов после И-го этапа также

осуществляют с помощью протеолитиче-

ских ферментов.

Используемые при этом питательные

среды весьма сложные и дорогие (см. спе-

циальную часть книги), обычно содержащие

антибиотик и сыворотку животных (от 5 до

20%).

К сожалению, сыворотки могут высту-

пать источником заражения (загрязнения)

культуры животных клеток бактериями, ви-

русами, микоплазмами, или какими-либо

ингибиторами. Поэтому синтетические сре-

ды представляются более удобными и вы-

годными с экономической точки зрения.

На IV этапе клетки переносят в биоре-

актор большого объема. Биореакторы для

культур животных клеток считают больши-

ми,

начиная с объема 10 литров, а если

имеются 100—200тлитровые биореакторы,

то это исключительно большие аппараты.

Они отчасти напоминают биореакторы,

применяемые в промышленной микробио-

344

,-£3

Рис.

115.

Мешалки в би-

ореакторах для выращива-

ния клеток: микроорганиз-

мов

(1 —

турбинная) и жи-

вотных- (2 — пропеллер-

ная,

3 — вибромешалка).