Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

логии, так как в обоих случаях принципиальные подходы к выра-

щиванию клеток во многом сходны (хотя животные клетки нежнее

и во много раз крупнее бактериальных или многих других микро-

бных клеток).

Чтобы меньше повреждать клетки, . ,

турбинные мешалки заменяют на пропел- [ |

лерные (винтовые) или на вибромешалки (>

(рис.

115). При использовании мешалок 2--

среда перемешивается, а биореактор ос- ^

тается неподвижным. В других случаях

Рвс

116

- Роллерный био-

среда остается неподвижной или мало по- Р

еакто

\ ~ вращающийся

„ "^ цилиндр, 2 — двигатель, 3 —

движнои, а перемещению подвергается

„ход и 4 — выход

газа-возду-

биореактор (рис. 116). ха.

Увеличение отношения площади по-

верхности биореактора (S) к его объему (V) (во благо возрастания

объемной плотности растущих адгезированных клеток) возможно

либо за счет увеличения числа реакторов, или за счет его конст-

рукционных модификаций. Последнее оказалось предпочтитель-

нее со всех точек зрения. Были предложены способы выращивания

клеток на гранулированных микроносителях, на губчатых полиме-

рах, на стопках тонких пластинок, на тонких нитях и пористых

трубочках.

подобных реакторах удается в

и более раз повысить

плотность клеток на 1 см

поверхности (рис. 117).

Впервые культивирование клеток животных на микроносите-

лях осуществил

А.

Ван-Везель (Голландия) в 1967 г. Гранулирован-

ные микроносители изготавливают из альгината, декстрана, син-

тетических полимеров размером, в среднем, 50—200 мкм в диамет-

ре.

Клетки прикрепляются к поверхности гранул и образующаяся

верхний

микропористый ч

фильтр \

гбочек А .« __

НИЖНИЙ

микропористый

I фильтр

проток свежей среды

Рис.

117. Проточный реактор с подушкой из пластмассовых трубочек для роста

животных клеток (а); клетки HeLa, растущие на полой нити; сканирующий элект-

ронный микроскоп; ув, х250; (6).

345

система представляет собой монослойную и суспензионную куль-

туру одновременно. В проточном реакторе с мешалкой, несущей

гибкие лопасти (перемешивание по типу движения рыбьего хвоста)

удается создавать высокую концентрацию гранул (12 г/л) без

заметного повреждения растущих на них клеток.

В компании Monsanto (США) созданы биореакторы для массо-

вого культивирования клеток млекопитающих, в том числе —

проточные. Впервые проточная система была разработана Ф.

Химмельфарбом и Ф. Тейером в 1969 г. Она и была положена в

основу биореактора, предложенного Дж. Фидером и У. Р. Толбер-

том в начале 80-х годов (рис. 118). В таком биореакторе осущест-

вляется комбинация выращивания культур с высокой плотностью

клеток и переноса их в реактор большего объема. Здесь демонст-

Рис.

118.

Проточный реактор с гибкими лопастными мешалками

(по

Дж. Фидеру

и У. Толберту, 1983).

ративен следующий пример: в 4-литровом проточном реакторе

получено 40 млрд. фибробластов человека (если их выращивать в

роллерных сосудах); после отделения фибробластов от гранул

микроносителя и переноса их в 44-литровый биореактор с 400 г

новых гранул с общей площадью их поверхности 188 м

удается

получить

340

млрд,

клеток, то есть в 8,5 раза больше (для накопления

такого числа клеток в роллерных сосудах потребовалось бы 11000

вращающихся бутылей).

Известны и другие типы биореакторов, принципы работы

которых во многом сходны. К их числу можно отнести биореактор

CellGen, предложенный фирмой New Brunswick Scientific Co., Inc.

(США). Его особенности: 1) многоцелевое назначение (для суспен-

зионного культивирования, в том числе, на микроносителях, для

проточного культивирования); 2) при малых скоростях перемеши-

346

вания достигается эффективная массопе-

редача

О2;

3) надежность контроля темпе-

ратуры с исключением возможности ло-

кального перегрева; 4) обеспечение на-

дежного контроля за рН и растворенным

кислородом (рис. 119); 5) взаимозаменяе-

мость реакторов емкостью 1,5; 2,5 и 5,0

литров;

оснащенность биореактора мик-

ропроцессором. В таком биореакторе за-

метно повышается выход конечных про-

дуктов, а жизнеспособность клеток пре-

вышает

90%.

Применительно к гибридом-

ным клеткам показана возможность их

выращивания в так называемой проточ-

ной или перфузионной системе, состоя-

щей из биореактора и фильтрационного

устройства с тангенциальным потоком

жидкости (рис. 120). Клеточную культуру удается поддерживать до

1,5 месяцев и более

(с

числовым показателем, достигающим 1,8

клеток/мл и максимальной концентрацией моноклональных анти-

тел до 800 мкг/мл, обеспечивая их продуктивность 504 мг/день).

целях реализации крупномасштабного культивирования кле-

ток млекопитающих предложена так называемая система Micro-

Lift, функционирующая совмещение с многоканальным процессо-

ром ML-4100.

Рис.

119. Биореактор Cell

Gen (внешний вид).

Рис.

120. Схема включения биореактора Cell Gen в проточную систему с

тангенциальным потоком культуральной среды

— свежеприготовленная среда, 2

—

контроль уровня,

— культуральная система Cell Gen,

— перфузионная ячейка

с тангенциальным потоком жидкости, 5 — культуральная среда, 6 — клетки, 7 —

освобожденная от клеток среда, содержащая МкАТ, 8 — насос.

347

Во всех случаях культивирования животных "клеток в больших

реакторах технологический процесс ведут- ступенчато, начиная с

сосудов малого объема: . - . - -

поверхностная культура суспензионная культура

чистая культура клеток 1. чистая культура клеток

в жидком азоте в жидком азоте

культура во флаконах . 2. культура во флаконах

(3 •

клеток /см

)

/(5—10) • 10

клеток/мл/

культура в сосудах 3. культура в роллерных сосудах

(8 •

клеток/см

)

(7 •

клеток/см

)

культура в роллерных 4. культура в биореакторе

сосудах

(5 •

клеток/см

) на 20 л

(7,5 •

клеток/см

)

культура в аппаратах 5. культура в биореакторе

с пластинами на 500 л

(2 •

^"клеток/см

) (3,7

•

клеток/см

)

6. культура в аппарате

с микроносителем

(3,7*

10"/см

Из-за повышенной чувствительности животных клеток к раз-

личным внешним воздействиям важно исключить не только по-

вреждающее действие перемешивающих систем в биореакторах,

но и заметные колебания температуры, поскольку ниже 37°С

клетки растут очень медленно, а выше 37°С они теряют жизнеспо-

собность. Температурный контроль при этом осложняется тем, что

скорость перемешивания среды с микроносителем малая и, следо-

вательно, эффективность теплопередачи заметно снижается. Од-

нако в отличие от микробных ферментации, здесь нет проблемы

с отводом тепла, образующегося в процессе метаболизма клеточной

культуры. Определено, что теплоемкость должна быть

712»10

Дж/час/л культуры, содержащей 10

клеток.

К настоящему времени сделаны базисные разработки для

выращивания клеток млекопитающих и есть все основания наде-

яться на то, что аппаратурное оформление биотехнологических

процессов будет постоянно совершенствоваться. Как пример ска-

занному можно назвать геновый ассемблер, с помощью которого

синтезируют олигонуклеотидные последовательности ДНК длиной

около 200 оснований. Олигонуклеотиды "растут" на твердых бу-

синках, помещенных в специальные кассеты, имеющие цветовой

код (А/О Фармация, ЛКБ-приборы, Швеция). С применением

уникальной кассетной системы (объемом 0, 2, 1, 3 или 10 микро-

молей) исключается необходимость взвешивания матрицы перед

348

ее применением, равно как и работа с незакрепленными бусинка-

ми.

Перед началом синтеза соответствующую кассету вставляют в

один из реакторов колонки, а после окончания синтеза ее выни-

мают и выделяют олигонуклеотиды. При этом колоночный реактор

пригоден для повторного использования. Работа оператора состоит

лишь в передаче геновому ассемблеру желаемой информации о

синтезе олигонуклеотида с заданной последовательностью. Подо-

бные приборы обеспечивают потребности в генно-инженерных

разработках для биотехнологии в целом.

Глава 8.

ОТХОДЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ,

ИХ ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ И УТИЛИЗАЦИЯ

Общая принципиальная схема любого биотехнологического

производства включает какой-либо биообъект (или ассоциацию

их) и питательную среду (культуральную жидкость, растворы,

подлежащие обработке). Целевым продуктом оказывается либо

биомасса клеток (тканей), либо метаболит(-ы). Следовательно, в

каждом производстве отходом могут быть эти же компоненты —

клетки (ткани) и культуральные жидкости после извлечения из них

нужных метаболитов (рис. 121).

Рис.

121.

Биотехнологический процесс, в

котором клетки и супернатант являются ли-

бо целевыми продуктами, либо отходами: 1

— биообъект, 2 — питательная среда, 3 —

культивирование в соответствующих усло-

виях, 4 — диоксид углерода, отработанный

воздух, 5 — сепарирование клеток от куль-

туральной среды, 6 — клетки, 6а — отход

66 — целевой продукт, 7 — супернатант, 7а

— целевой продукт, 76 — отход.

Если условно принять скорость удвоения каждой генерации,

например, микробной клетки весом

4х10"

мг, в течение 20 минут,

то за двое суток возникло бы 2

144

клеток или, примерно, 8

•

131

г,

или 8

•

125

т. Такая величина примерно в несколько тысяч раз

превышает вес Земного

шара.

Ясно, что в процессах биологической

технологии на размножение биообъектов влияют многие факторы,

ограничивающие такой безудержный прирост биомассы клеток.

349

Однако в случаях с производством пенициллина расчеты подтвер-

ждают возможность получения 2 т сухого мицелия через ряд

генераций пеницилла в течение 10—12 дней выращивания при

первоначальном засеве 10'

г спор гриба с доведением объема

влажной культуры до 100 м

Даже при использовании биомолекул (например, ферментов)

в иммобилизованном состоянии своеобразная двухкомпонент-

ность системы сохраняется и здесь. Метаболит(-ы) будут в раство-

ре,

носитель с биомолекулами остается в твердом состоянии.

При наличии крупномасштабных биотехнологических произ-

водств возникают проблемы общего и частного характера. К ним

можно отнести: 1) необходимость решения задач по экологическо-

му выравниванию нагрузок, оказываемых производством на окру-

жающую среду: а) вследствие непомерного потребления природ-

ной воды и столь же непомерного количества выбросов во внеш-

нюю среду; только в промышленности расходуется примерно

следующее количество воды (в литрах): на

т нефти — 10, на одну

банку овощных консервов — 40, на 1 кг бумаги — 100, на 1 кг

шерстяной ткани — 600, на

т сухого цемента — 3500, на

т стали

— 20000, на 1 т сухих дрожжей — более 100000 литров воды и

более

т пара; в США ежегодно генерируется более

145

млн тонн

городских сточных вод (данные на 1990 год), из них порядка 94

млн. т (65%) легко очищаемых биодеградациёй; 23,2 млн. т (16%) —

потенциально биодеградируемых и 27,6 млн. т (19%) — не подда-

ющихся очистке с помощью биологических процессов (стекло,

металлы, пр.); б) вследствие подавления и, даже, гибели естествен-

ных экосистем вокруг биотехнологических предприятий или вы-

ражение неадекватное популяционное давление одних видов жи-

вых существ на другие (например, разрастание цианобактерии в

водохранилищах); в) вследствие стрессовых нагрузок на людей,

проживающих вблизи крупных биотехнологических предприятий

(выхлопные газы, шум, испарения, корпускулярные аллергены в

атмосфере и пр.).

необходимость сохранения воды, памятуя о том, что ее гибель

— наша гибель! К сожалению, даже океаны превращаются в

крупнейшие сточные резервуары Земли. Для сравнения можно

назвать прежнее состояние вод и теперь в озерах Ладожском,

Байкале, в крупнейших реках нашей страны; сбросы с рыболовных

кораблей, загрязненные кишечной палочкой, достигают районов

Антарктиды;

3) борьбу с мусором и грязью, не забывая о том, что при их

350

наличии восстанавливаются прерванные цепочки: мусор

(грязь)—^переносчики (крысы, мухи и др.) —^инфекционные болез-

ни (чума, кишечные заболевания и др.);

4) борьбу с загрязнением воздуха, в который от предприятий

попадает тепло (равно как и в водоемы), жидкие, газообразные,

твердые (пыль) отходы — изменяется местный климат в селитеб-

ных (от слова "селитьба" — поселение, водворение) зонах, а

накопление СО2 в атмосфере от биотехнологических производств

вносит свой вклад в "тепловую копилку" в глобальном масштабе;

5) регулирование народонаселения в различных регионах пла-

неты Земля. Биотехнологические производства прямо или косвен-

но нацелены на обеспечение здоровья людей. Тем не менее, ни с

помощью биотехнологии, ни с помощью сельскохозяйственных

наук до сих пор не удалось полностью решить проблему недоста-

точности питания (или даже голода) во многих странах мира. В то

же время на Земле каждые две секунды рождается человек и через

лет ожидается возрастание народонаселения до 6 млрд. человек.

Следовательно, эффективность фитобиотехнологических произ-

водств, включая другие предприятия агропромышленных комплек-

сов,

должна существенно возрасти. При этом уже невозможно

увеличить нагрузку на почву пестицидами в целях борьбы за

урожайность сельскохозяйственных культур. По общему обороту

химической промышленности все государства бывшего СССР

занимали второе место после США. В настоящее время в мире

вырабатывается около 300 млн. т органических веществ, в том

числе 1,2 млн. т. пестицидов, которые вместе с другими реактоген-

ными химическими веществами, попадающими в среду обитания

человека, могут проявлять канцерогенное, мутагенное и токсиче-

ское действие.

Так называемые "кислотные дожди", выпадающие в различных

географических регионах, пагубно сказываются на всем живом,

включая и "микробный пейзаж".

Качество и количество отходов биотехнологических произ-

водств зависит от ряда причин, среди которых можно назвать:

характер производства по номенклатуре выпускаемой продукции

(например, производство микробного белка, антибиотиков, вита-

минов, аминокислот, полисахаридов, ферментов и др.); особенно-

сти технологии производства — аэробное или анаэробное культи-

вирование биообъекта, в герметизированных или негерметизиро-

ванных биореакторах, в периодическом, полунепрерывном или

непрерывном режимах; объемы производства — малотоннажные

351

(некоторые ферменты) и крупнотонажные (кормовые дрожжи);

уровень профессиональной подготовки кадров, занятых в биотех-

нологических производствах; культуру производства. ;

К сожалению, нет информации о количестве отходов всех \

биопроизводств в мире, но, несомненно, они ошеломляюще огром-

ны.

Подсчитано, например, что на одну тонну лимонной кислоты j

образуется 150—200 кг сухого мицелия Aspergillus niger и 7 м

фильтрата. При выработке в мире порядка 30000 тонн в год

антибиотиков плотные и жидкие отходы составляют исключитель-

но большие величины. Так, с одного пятидесятикубового аппарата \

при производстве пенициллина может быть получено около 1 т ]

мицелия в расчете на сухую массу. Применительно к комплексной

биотехнологии (микробной на базе зоопредприятий), в связи с

микробной переработкой стоков свинооткормочных комплексов

показано, что каждый животноводческий комплекс (54—108—216

тыс.

голов скота) ежегодно производит соответственно

0,5—1—2

млн. м

навозосодержащих стоков. Из 1,5 млрд. т отходов живо-

тноводства, получаемых каждый год в нашей стране, большая часть

попадает в открытые водоемы, загрязняя окружающую среду

(И.

А.

Архипченко, 1991). Вот почему бесспорным является утверждение

о том, что от состояния окружающей среды во многом зависит

выживание человечества. Наука о биологии окружающей среды

называется экологией (от греч. oikos — дом, жилище, logos —

учение). Она посвящается изучению биологических систем надор-

ганизменного уровня; другими словами, экология — это совокуп- '

ность или структура связей между организмами и их средой. Ее ;

подразделяют на аутоэкологию и синэкологию. Первая изучает <

отдельные виды или организмы и их среду обитания, вторая —

группы организмов в ассоциациях, составляющих определенные

единства во внешней среде.

При общей взаимосвязи всего живого на земле биотехнолог

обязан обеспечивать безотходность биотехнологических произ-

водств во имя поддержания нормальной экологической ситуации

(в месте производства и на расстоянии). Неограниченное истоще- 1

ние ресурсов земли и ее непрекращающееся загрязнение могут 1

привести человечество к трагическому концу. Поэтому в любом

производстве, в том числе — биотехнологическом, должны исполь-

зоваться экосистемные (целостные) подходы, девиз которых: "По-

лучай, бери, но не вреди Природе, частью которой ты являешься!".

Неоправданно большие количества отходов в производстве —

это значит большая потеря ресурсов, так как отходы нередко

352

представляют собой ресурсы, оказавшиеся не на своем месте; это

значит возрастание стоимости ликвидации отходов и.контроля за

ними; это значит ухудшение состояния здоровья людей (особенно

— в крупных промышленных центрах).

На

рис.

122

представлены ориентиро-

вочные расходы на отработку различных

отходов к 2000 году. Из рисунка видно,

что в структуре расходов наибольшие

затраты ожидаются на обезвреживание

отходов от автотранспорта; от 600 млн.

до

млрд. долларов будут расходоваться

на обработку всех прочих отходов, вклю-

чая жидкие и твердые от биотехнологи-

ческих производств.

Что касается инфекционных заболе-

ваний, связанных с экологической обста-

новкой, то их распределение неравноз-

начно в различных регионах земного

шара и, даже, на территории одной стра-

ны.

Если общая тенденция к снижению

туберкулеза и кишечных заболевании

прослеживается в странах Западной Ев-

1980

1990

2000

Рис.

122. Примерные рас-

ходы на обработку различных

отходов (1 — сточных вод, 2

—

твердых отходов, 3 — отхо-

дов от автотранспорта, 4 —

отходов от всех видов про-

мышленности, 5 — отходов от

производства электроэнер-

гии);

$ — затраты в млн. дол-

ларов, t — время в годах.

ропы, Северной Америки и некоторых других, то применительно

к независимым государствам бывшего СССР этого сказать нельзя

— ежегодные вспышки сальмонеллезов, дизентерии, диарреи ста-

новятся все более беспокойнее на фоне острой нехватки химио-

терапевтических средств; растет заболеваемость туберкулезом ма-

териально плохо обеспеченных слоев населения.

8.1.

Обезвреживание отходов биотехнологических произ-

водств. Отходы биотехнологических производств относятся, как

правило, к типу разлагающихся в природных условиях под дейст-

вием различных факторов (биологических — минерализация с

участием микроорганизмов, химических — окисление, физико-хи-

мических благодаря комплексному воздействию, например, лучи-

стой энергии и химических веществ).

Плотные отходыв биотехнологических производствах

представляют

собой:

микробную массу, отделяемую от культураль-

ного фильтрата, поступающего на последующие стадии выделения

целевого продукта; шламы (от нем. Schlamm — грязь); раститель-

ную биомассу после экстракции из нее действующих веществ (а

в случае суспензионной культуры, продуцирующей метаболит в

12 т. 8524 353

питательную среду, отходом являются клетки); остатки куриных

эмбрионов при культивировании, например, вируса гриппа; неко-

торые тканевые культуры млекопитающих; осадки из сточных вод

(ил).

Подсчитано, что в коммунальных очистных сооружениях

сточные воды от одного горожанина образуют за год около 500

литров ила со средней влажностью 5%. Если городское население

в стране составляет 100 млн. человек, то за год накопится 47,5 млн.

такого ила. Если сюда приплюсовать почти такое же количество

промышленных осадков, включая плотные отходы биотехнологи-

ческих производств, то необходимо приложить большие усилия и

средства для обезвреживания их или утилизации.

Давно освоенными биотехнологическими производствами во

многих странах мира являются промышленные способы получения

пива, дрожжей, вин и др. (см. специальную часть). На примере

лишь пивоварения можно указать, что плотными отходами здесь

являются дрожжевые клетки (0,25—0,40 кг на

гл. пива), солодовая

и хмелевая дробины, белковый осадок из сепараторов. Остатки

хмеля (хмелевая дробина) и белка содержат горечи, из-за которых

они не употребляются в качестве добавок к рационам кормов для

животных. Поэтому такие остатки либо сжигаются (что нерента-

бельно), либо передаются на биологическое обезвреживание.

При оптимальных средах и аэрации биомасса клеток нитчатых

грибов и дрожжей может составить 2,5% в пересчете на сухую

массу, причем, около 50% в ней приходится на белки.

В спиртовом производстве отходом является барда, состав

которой зависит от качества используемого сырья (зерно, карто-

фель).

Сугубо усредненные данные по основному составу зерно-

картофельной барды представляются следующими: вода — 91—

93%,

сухой остаток — 7—9%, в составе которого зольность состав-

ляет от 6 до 12%, общий азот

21—23%,

липиды —

2—8%,

целлюлоза

— 9—10%, безазотистые экстрактивные вещества — 50—59%.

Отжатая или высушенная барда используется в качестве добавок

к корму для сельскохозяйственных животных.

производстве этанола, пива, хлебного кваса используют солод

— пророщенное зерно (ячмень, овес, просо, пшеница, рожь — на

спиртовых заводах; ячмень — на пивоваренных заводах; рожь и

ячмень — в производстве кваса). В процессах получения солода

образуются отходы в форме очисток, сплава, солодовых ростков,

которые с успехом используются в животноводстве, а также в

целях получения ряда биологически активных веществ (прежде

всего — ферментов из солодовых ростков).

354