Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия

Подождите немного. Документ загружается.

3. Под действием протеолитических ферментов (протеиназ) белки рас-

щепляются на строго определенные фрагменты, называемые пептидами,

с концевыми аминокислотами, соответствующими избирательности дейст-

вия протеиназ. Структура некоторых таких фрагментов неполного гидроли-

за доказана последующим химическим их синтезом.

4. Биуретовую реакцию (сине-фиолетовое окрашивание в присутствии

раствора сульфата меди в щелочной среде) дают как биурет, содержащий

пептидную связь, так и белки, что также является доказательством наличия

в белках аналогичных связей.

5. Анализ рентгенограмм кристаллов белков подтверждает полипептид-

ную структуру белков. Таким образом, рентгеноструктурный анализ при

разрешении 0,15–0,2 нм позволяет не только вычислить межатомные рас-

стояния и размеры валентных углов между атомами С, Н, О и N, но

и «увидеть» картину общего расположения аминокислотных остатков

в полипептидной цепи и пространственную ее ориентацию (конформацию).

6. Существенным подтверждением полипептидной теории строения бел-

ка является возможность синтеза чисто химическими методами полипеп-

тидов и белков с уже известным строением: инсулина – 51 аминокислотный

остаток, лизоцима – 129 аминокислотных остатков, рибонуклеазы – 124

аминокислотных остатка *. Синтезированные белки обладали аналогичны-

ми природным белкам физико-химическими свойствами и биологической

активностью.

Полипептидная теория строения не отрицает существования в молекуле

белка и других связей, включая ковалентные (например, дисульфидные

—S—S-связи) и нековалентные (например, водородные связи и др.). Они

будут рассмотрены далее.

Пептидные связи играют исключительную роль как в «архитектуре», так

и в функции белков. Поэтому следует указать на некоторые особенности

строения полипептидной цепи. Во-первых, это своеобразие расположения

атомов углерода и азота, находящихся примерно в одной плоскости,

и атомов водорода и радикалов, направленных к этой плоскости под углом

109°28'. Во-вторых, это своеобразие петидной связи. Расстояние между

атомами С и N в пептидной связи (равное 0,132 нм) является промежу-

точным между простой (ординарной) связью (связь —С—N—, равная

0,147

нм) и

двойной связью (связь

—C=N—,

равная 0,125 нм).

Это

создает

предпосылки для осуществления по месту двойной связи таутомерных

перегруппировок и для образования енольной (лактимной) формы. Послед-

няя в свою очередь дает молекуле белка ряд преимуществ (повышение

реакционной способности, возникновение дополнительных возможностей

вращения и др.):

* Полный синтез рибонуклеазы осуществлен одновременно и независимо друг от друга

Б. Меррифилдом и Р. Хиршманом. Этот метод реализован в автоматическом синтезаторе

пептидов.

Лактамная (кетонная) форма

Лактимная (енольная) форма

Наконец, следует указать на своеобразие радикалов, которые являются

полифункциональными, несущими свободные NH

-, СООН-, ОН-, SH-

группы и, как было указано, определяют структуру (пространственную)

и многообразие функций молекул белка. Взаимодействуя с окружающими

молекулами растворителя (Н

О), функциональные группы (в частности,

- и СООН-группы) ионизируются, что приводит к образованию анион-

ных и катионных центров белковой молекулы. В зависимости от соотноше-

ния ионов молекулы белка получают суммарный положительный (+) или

отрицательный (–) заряд с определенным значением изоэлектрической

точки.

Получены доказательства предположения К. Линдерстрёма-Ланга о су-

ществовании 4 уровней структурной организации белковой молекулы:

первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры. Техника совре-

менной белковой химии разработана настолько хорошо, что позволяет

в принципе расшифровать структурную организацию любого белка.

Первичная структура белка

К настоящему времени расшифрована первичная структура десятков тысяч

разных белков, что является несомненным достижением биохимии. Однако

это число ничтожно мало, если учесть, что в природе около 10

разно-

образных белков. Под первичной структурой подразумевают порядок,

последовательность расположения аминокислотных остатков в полипеп-

тидной цепи. Зная первичную структуру, местоположение каждого остатка

аминокислоты, можно точно написать структурную формулу белковой

молекулы, если она представлена одной полипептидной цепью. Если

в состав белка входит несколько полипептидных цепей, объединенных

в одну белковую молекулу посредством дисульфидных связей и нековалент-

ных взаимодействий, или если одна полипептидная цепь содержит внутрен-

ние дисульфидные связи, то задача определения первичной структуры

несколько осложняется, так как необходимо предварительное разъединение

этих цепей и связей. Разъединение таких полипептидных цепей производят

с помощью денатурирующих агентов (растворы 8М мочевины или 6М

гуанидингидрохлорида), разрывающих нековалентные связи. Дисульфид-

ные связи разрушают путем окисления или восстановления (надмуравьиной

кислотой или β-меркаптоэтанолом соответственно), при этом образуются

свободные полипептиды, содержащие или остатки цистеиновой кислоты,

или цистеина:

Для определения первичной структуры отдельной, химически гомоген-

ной полипептидной цепи в первую очередь методами гидролиза выясняют

аминокислотный состав, точнее, соотношение каждой из 20 аминокислот

в образце гомогенного полипептида. Затем приступают к определению

химической природы концевых аминокислот полипептидной цепи, содержа-

щей одну свободную NH

-группу и одну свободную СООН-группу.

Методы определения N-концевой аминокислоты

Для определения природы N-концевой аминокислоты предложен ряд мето-

дов, в частности метод Сэнджера (F. Sanger), основанный на реакции

арилирования полипептида 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ), что при-

водит к образованию окрашенного в желтый цвет 2,4-динитрофенильного

производного N-концевой аминокислоты *. Раствор полипептида обраба-

тывают ДНФБ, который взаимодействует со свободной NH

-группой

N-концевой аминокислоты пептида.

После кислотного гидролиза продукта реакции – динитрофенилпептида

только одна N-концевая аминокислота оказывается связанной с реактивом

в виде 2,4-динитрофениламинокислоты (стабильной при гидролизе). В отли-

чие от других образовавшихся при гидролизе полипептида свободных

аминокислот она желтого цвета. Ее идентифицируют методом хромато-

графии.

Для определения N-концевой аминокислоты значительно более широко

применяется фенилтиогидантоиновый метод Эдмана благодаря

своей высокой чувствительности и возможности многократного использо-

вания в одной и той же пробе. Фенилизотиоцианат реагирует со свободной

α-NH

-группой N-концевой аминокислоты полипептида с образованием

фенилтиокарбамоилпептида.

* За разработку этого метода Ф. Сэнджер удостоен Нобелевской премии (1958). В 1980 г.

он был удостоен второй раз Нобелевской премии вместе с У. Гилбертом и П. Бергом за

разработку метода определения первичной структуры нуклеиновых кислот.

Полипептид (белок)

Гидролиз

+ Свободные аминокислоты

Динитрофениламинокислота

ДНФБ

Обработка продукта реакции кислотой приводит к циклизации и осво-

бождению фенилтиогидантоина N-концевой аминокислоты, природу кото-

рого устанавливают хроматографически. Укороченный на одну аминокис-

лоту полипептид подвергают дальнейшему анализу.

Эту процедуру ступенчатого расщепления пептида с N-конца можно

повторять многократно, идентифицируя последовательно одну аминокис-

лоту за другой. Метод Эдмана используется в качестве химической основы

для определения первичной структуры белков и пептидов. Он реализован

в специальном приборе – секвенаторе (от англ. sequence – последователь-

ность), работающем в автоматическом режиме и позволяющем определить

последовательность аминокислот с N-конца пептида до 50–60 аминокис-

лотных остатков.

Кроме этих реактивов, для определения чередования аминокислот ис-

пользуют цианат калия, 1-диметиламинонафтил-5-сульфонилхлорид – дан-

силхлорид и дабсилхлорид. Для этих же целей иногда применяют ферменты

экзопептидазы, в частности аланин- и лейцинаминопептидазу. Эти фермен-

ты разрывают пептидные связи с того конца полипептида, где имеется

свободная NН

-группа, освобождая N-концевую аминокислоту (механизм

действия экзопептидаз см. в главе 12).

Методы определения С-концевой аминокислоты

Для определения природы С-концевой аминокислоты часто используют

ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой,

которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится

свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокис-

лоты, природа которой может быть идентифицирована методом хромато-

графии.

Предложен также химический метод Акабори (S. Akabori), который

основан на гидразинолизе полипептида:

Фенилизотиоцианат

Полипептид

Фенилтиогидантоиновое

производное

N-концевой АМК

Полипептид, укороченный

на одну аминокислоту

HCl

Гидразин, вызывая распад чувствительных к нему пептидных связей

полипептида, реагирует со всеми аминокислотами, за исключением С-

концевой аминокислоты, поскольку ее карбоксильная группа не участвует

в образовании пептидной связи. При этом образуется смесь аминоацил-

гидразинов и свободной С-концевой аминокислоты. Последнюю после

обработки всей смеси ДНФБ отделяют и идентифицируют хроматографи-

чески, для чего образовавшиеся динитрофенилпроизводные аминоацил-

гидразинов предварительно экстрагируют уксусно-этиловым эфиром.

С-концевую аминокислоту идентифицируют также путем обработки

полипептида восстанавливающим агентом, например боргидридом натрия.

В простейшей форме эту процедуру можно представить в следующем виде:

Видно, что в указанных условиях только одна, а именно С-концевая,

аминокислота будет превращаться в α-аминоспирт, легко идентифицируе-

мый методом хроматографии. Таким образом, при помощи указанных

методов определяют природу N- и С-концевых аминокислот.

Следующий этап работы связан с определением чередования (последо-

вательности) аминокислот внутри полипептидной цепи. Для этого сначала

проводят избирательный, частичный (химический и ферментативный), гид-

ролиз полипептидной цепи на короткие пептидные фрагменты, последова-

тельность аминокислот в которых может быть точно определена описан-

ными ранее методами.

Химические методы избирательного и неполного гидролиза основаны

на применении таких химических реактивов, которые вызывают селектив-

ный, высокоспецифический разрыв пептидных связей, образованных опре-

деленными аминокислотами, оставляя незатронутыми остальные пептид-

ные связи. К этим избирательно гидролизующим веществам относятся

цианогенбромид, CNBr (по остаткам метионина), гидроксиламин (по свя-

зям между остатками аспарагиновой кислоты и глицина), N-бромсукцина-

Аминоацилгидразины

Аланин

Гидразин

NaBH

6М НСl, 105°С, 24ч

Свободные аминокислоты

α-Аминоспирт

мид (по остаткам триптофана). Метионина в составе белков содержится

обычно меньше, чем других аминокислот, поэтому обработка CNBr пред-

почтительнее, так как при этом образуется небольшое число пептидов,

первичную структуру которых определяют с помощью рассмотренных

ранее методов, всякий раз начиная с определения природы N- и С-концевых

аминокислот.

Ферментативные методы гидролиза основаны на избирательности дей-

ствия протеолитических (вызывающих распад белков) ферментов, расщеп-

ляющих пептидные связи, образованные определенными аминокислотами.

В частности, пепсин ускоряет гидролиз связей, образованных остатками

фенилаланина, тирозина и глутаминовой кислоты, трипсин – аргинина и ли-

зина, химотрипсин – триптофана, тирозина и фенилаланина. Ряд других

ферментов, например папаин, субтилизин, проназа и другие бактериальные

протеиназы, также используется для неполного гидролиза белков. В резуль-

тате полипептидная цепь расщепляется на мелкие пептиды, содержащие

иногда всего несколько аминокислот, которые отделяют друг от друга

сочетанными электрофоретическими и хроматографическими методами,

получая своеобразные пептидные карты. Далее определяют чередование

аминокислот в каждом индивидуальном пептиде. Завершается работа

воссозданием первичной структуры полной полипептидной цепи на основа-

нии определения последовательности аминокислот в отдельных пептидах.

Метод составления пептидных карт, получивший образное название

«метод отпечатков пальцев», используется при определении сходства или

различия гомологичных белков по первичной структуре. Белок инкубируют

с каким-либо протеолитическим ферментом. Часто порции белка инкубиру-

ют как с пепсином, так и с трипсином. При этом вследствие гидролиза

строго определенных пептидных связей образуется смесь коротких пепти-

дов, легко разделяемых с помощью хроматографии в одном направлении

и электрофореза – в другом, под углом 90° от первого (пептидная карта).

Дальнейшие задачи – установление последовательности расположения

аминокислот в каждом из выделенных пептидов (фенилтиогидантоиновым

или другими методами), сопоставление полученных данных и установление

первичной структуры всей молекулы.

Возможность применения рентгеноструктурного анализа для определе-

ния последовательности аминокислот в белковой молекуле была рассмот-

рена ранее. Следует отметить совершенно новый подход к решению этой

важной проблемы – определение последовательности аминокислот в белко-

вой молекуле с использованием данных о комплементарной нуклеотидной

последовательности ДНК. Этому способствуют как методы быстрого

секвенирования ДНК, так и техника изолирования и доступности самого

гена *.

В настоящее время выяснение первичной структуры белков является

вопросом времени и технического оснащения лабораторий. Полностью

выяснена первичная структура многих природных белков и прежде всего

инсулина, содержащего 51 аминокислотный остаток [Сэнджер Ф., 1954].

Более крупным белком с выясненной первичной структурой оказался

иммуноглобулин, в четырех полипептидных цепях которого насчитывается

1300 аминокислотных остатков. За эту работу Дж. Эдельман и Р. Портер

были удостоены Нобелевской премии (1972).

* Описана первичная структура многих белков и ферментов, в частности репликазы фага

MS2 (544 аминокислотных остатка), установленная этим методическим приемом.

Рис. 1.14. Структура проинсулина.

Расшифрованы первичные структуры миоглобина человека (153 амино-

кислотных остатка), α-цепи (141) и β-цепи (146) гемоглобина человека,

цитохрома С из сердечной мышцы человека (104), лизоцима молока

человека (130), химотрипсиногена быка (245) и многих других белков, в том

числе ферментов и токсинов. На рис. 1.14 представлена последовательность

аминокислотных остатков проинсулина. Видно, что молекула инсулина

(выделена темными кружками), состоящая из двух цепей (А – 21 и В – 30

аминокислотных остатков), образуется из своего предшественника – про-

инсулина (84 аминокислотных остатка), представленного одной полипеп-

тидной цепью, после отщепления от него пептида, состоящего из 33

аминокислотных остатков. Строение молекулы инсулина (51 аминокислот-

ный остаток) схематически можно представить следующим образом:

Между цепями А и В и внутри А-цепи инсулина образуются дисуль-

фидные

(—S—S—)

связи. Выяснена первичная структура более

инсули-

А-цепь (21)

В-цепь (30)

Цепь А

Цепь В

нов, выделенных из разных источников. Близкими по первичной структуре

оказались инсулины из поджелудочной железы человека, свиньи и каша-

лота. Единственным отличием инсулина человека является нахождение

треонина в положении 30 В-цепи вместо аланина.

Вторым белком, первичная структура которого расшифрована С. Му-

ром и У. Стейном, является рибонуклеаза (рис. 1.15) из поджелудочной

железы, катализирующая расщепление РНК. Фермент состоит из 124

аминокислотных остатков с N-концевым лизином и С-концевым валином,

между остатками цистеина образуются дисульфидные (—S—S—) связи

в 4 участках.

Полностью расшифрована последовательность аминокислот полипеп-

тидной цепи фермента лизоцима, имеющего важное защитное и медицин-

ское значение, так как он вызывает лизис ряда бактерий, расщепляя

основное вещество их клеточной оболочки. Лизоцим белка куриного яйца

содержит 129 аминокислот (рис. 1.16) с N-концевым лизином и С-концевым

лейцином.

Отечественными исследователями установлена первичная структура

многих белков и полипептидов, в том числе крупного белка РНК-полимера-

зы (в частности, последовательности ее β- и β

-субъединиц, 1342 и 1407

Рис. 1.15. Первичная структура РНКазы. Цветом выделены четыре дисульфидные

связи.

Рис. 1.16. Первичная структура полипептидной цепи лизоцима (схема).

аминокислотных остатков соответственно * фактора элонгации G из Е.coli

(701 аминокислота) (Ю.А. Овчинников и др.), фермента аспартатамино-

трансферазы, состоящей из 412 аминокислотных остатков (А.Е. Браун-

штейн, Ю.А. Овчинников и др.), леггемоглобина, белка L25 из рибосом

E.coli, нейротоксинов из яда кобры (Ю.А. Овчинников и др.), пепсиногена

и пепсина (В.М. Степанов и др.), L-липотропина и лактогенного гормона

быка (Н.А. Юдаев, Ю.А. Панков) и др.

Исследования первичной структуры α- и β-цепей гемоглобина способ-

ствовали выяснению структуры необычных, так называемых аномальных,

гемоглобинов, встречающихся в крови больных гемоглобинопатиями.

Иногда развитие болезни, как и изменение пространственной структуры

гемоглобина человека, обусловлено заменой лишь одной какой-либо

аминокислоты в структуре β-цепей (реже α-цепей) гемоглобина (см. главу 2).

Анализ данных о первичной структуре белков позволяет сделать сле-

дующие общие выводы.

1. Первичная структура белков уникальна и детерминирована генети-

чески. Каждый индивидуальный гомогенный белок характеризуется уни-

кальной последовательностью аминокислот: частота замены аминокислот

приводит не только к структурным перестройкам, но и к изменениям

физико-химических свойств и биологических функций.

* Следует указать, что в молекуле ДНК-зависимой РНК-полимеразы содержатся, помимо

указанных β- и β'-, также α- и α'-субъединицы и σ-фактор, первичная структура которых пока не

расшифрована, хотя известно общее количество аминокислот (~5000), входящих в состав

этого гигантского белка.

2. Стабильность первичной структуры обеспечивается в основном глав-

новалентными пептидными связями; возможно участие небольшого числа

дисульфидных связей.

3. В полипептидной цепи могут быть обнаружены разнообразные ком-

бинации аминокислот; в полипептидах относительно редки повторяющиеся

последовательности.

4. В некоторых ферментах, обладающих близкими каталитическими

свойствами, встречаются идентичные пептидные структуры, содержащие

неизменные (инвариантные) участки и вариабельные последовательности

аминокислот, особенно в областях их активных центров. Этот принцип

структурного подобия наиболее типичен для ряда протеолитических фер-

ментов: трипсина, химотрипсина и др. (см. главу 4).

5. В первичной структуре полипептидной цепи детерминированы вто-

ричная, третичная и четвертичная структуры белковой молекулы, опреде-

ляющие ее общую пространственную конформацию.

Вторичная структура белка

Рентгеноструктурная кристаллография решает две главные проблемы бел-

ковой химии: закономерности чередования последовательности аминокис-

лотных остатков в полипептидной цепи и закономерности конфигурации

белковой молекулы.

Первые рентгенограммы белков, полученные еще в 30-х годах У. Астбю-

ри, а затем Л. Полингом и Р. Кори, позволили установить наличие в белках

наряду с линейной полипептидной цепью участков, определенным образом

скрученных.

Под вторичной структурой белка подразумевают конфигурацию поли-

пептидной цепи, т. е. способ свертывания, скручивания (складывание, упа-

ковка) полипептидной цепи в спиральную или какую-либо другую конфор-

мацию. Процесс этот протекает не хаотично, а в соответствии с програм-

мой, заложенной в первичной структуре. Подробно изучены две основные

конфигурации полипептидных цепей, отвечающих структурным требова-

ниям и экспериментальным данным: α-спирали и β-структуры.

Благодаря исследованиям Л. Полинга * наиболее вероятным типом

строения глобулярных белков принято считать α-спираль (рис. 1.17). Закру-

чивание полипептидной цепи происходит по часовой стрелке (правый ход

спирали), что обусловлено L-аминокислотным составом природных белков.

Движущей силой в возникновении α-спиралей (так же как и β-структур)

является способность аминокислот к образованию водородных связей.

В структуре α-спиралей открыт ряд закономерностей. На каждый виток

(шаг) спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка. Шаг спирали

(расстояние вдоль оси) равен 0,54 нм на виток, а на один аминокислотный

остаток приходится 0,15 нм. Угол подъема спирали 26°, через 5 витков

спирали (18 аминокислотных остатков) структурная конфигурация полипеп-

тидной цепи повторяется. Это означает, что период повторяемости (или

идентичности) α-спиральной структуры составляет 2,7 нм.

Для каждого белка характерна определенная степень спирализации его

полипептидной цепи. Степень спирализации устанавливают путем измере-

ния удельного вращения плоскости поляризованного света. Изменение

* За открытие тонкой структуры белков при помощи рентгеноструктурного анализа

нативных белков и синтезированных полипептидов Л. Полинг удостоен Нобелевской премии

(1954).