Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия

Подождите немного. Документ загружается.

Таблица 1.4. Аминокислотный состав некоторых природных белков, в процентах

Аминокислота

Белок

Аланин

Глицин

Валин

Лейцин

Изолейцин

Пролин

Фенилаланин

Тирозин

Триптофан

Серин

Треонин

Цистеин +

цистин

Метионин

Аргинин

Гистидин

Лизин

Аспарагиновая

кислота

Глутаминовая

кислота

Амидный азот

Саль-

мин

1,1

2,9

3,1

1,6

5,8

9,1

85,2

Гистон

(печень

телен-

ка)

7,6

5,8

5,5

9,1

4,6

3,4

3,5

3,9

–

4,1

6,4

–

0,9

14,8

2,3

11,7

5,5

10,3

0,7

Казеин

3,2

2,0

7,2

9,2

6,1

10,6

5,0

6,3

1,2

6,3

4,9

0,3

2,8

4,1

3,1

8,2

7,1

22,4

1,6

Альбу-

мин

(сы-

воротка

челове-

ка)

–

1,6

7,7

11,0

1,7

5,1

7,8

4,7

0,2

3,3

4,6

6,3

1,3

6,2

3,5

12,3

9,0

17,0

0,9

γ-Гло-

булин

(чело-

века)

–

4,2

9,7

9,3

2,7

8,1

4,6

6,8

2,9

11,4

8,4

3,1

1,1

4,8

2,5

8,1

8,8

11,8

1,1

Пепсин

–

6,4

7,1

10,4

10,8

5,0

6,4

8,5

2,4

12,2

9,6

2,1

1,7

1,0

0,9

16,0

11,9

1,3

Инсу-

лин

4,5

4,3

7,7

13,2

2,8

2,5

8,8

13,0

5,2

2,1

12,5

–

3,1

4,9

2,5

6,8

18,6

1,4

Колла-

ген

9,5

27,2

3,4

–

5,6

15,1

2,5

1,0

3,4

2,3

0,8

8,6

0,7

4,5

6,3

11,3

0,7

и др.). Здесь будут рассмотрены общие цветные реакции для обнаружения

индивидуальных аминокислот и аминокислот, входящих в состав белков,

основанные на химической природе радикалов аминокислот (табл. 1.5).

Для открытия в биообъектах и количественного определения аминокис-

лот успешно применяется реакция их с нингидрином. На I стадии реакции

образуется восстановленный нингидрин за счет окислительного дезами-

нирования аминокислот (параллельно происходит декарбоксилирование

аминокислот):

На II стадии образовавшийся аммиак реагирует с эквимолярными

количествами окисленного и восстановленного нингидрина, образуя сине-

фиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (при 570 нм) про-

порциональна количеству аминокислоты:

Аминокислота

Окисленный

нингидрин

Восстановленный

нингидрин

+ СО

+ NH

На основе нингидриновой реакции были разработаны методы количест-

венного определения аминокислот, в частности метод распределительной

хроматографии на бумаге, впервые внедренный в 1944 г. (А. Мартин

и Р. Синдж). Эта же реакция используется благодаря своей высокой

чувствительности в автоматическом анализаторе аминокислот. Впервые

такой прибор сконструировали Д. Шпакман, С. Мур и У. Стейн (рис. 1.7).

После разделения смеси аминокислот в колонках, заполненных специаль-

ными ионообменными смолами (сульфополистирольный катионит), ток

элюента из колонки поступает в смеситель, туда же поступает раствор

нингидрина; интенсивность образующейся окраски автоматически измеря-

ется на фотоэлектроколориметре и регистрируется самописцем. Этот метод

нашел широкое применение в клинической практике при исследовании

крови, мочи, спинномозговой жидкости. С его помощью за 2–3 ч можно

получить полную картину качественного состава аминокислот в биологи-

Таблица 1.5. Реакции, используемые для идентификации и полуколичественного

определения аминокислот и белков

Реакция

Миллона

Ксантопротеи-

новая

Гопкинса-

Коула

Эрлиха

Сакагучи

Нитропрус-

сидная

Салливена

Паули

Фолина-

Чокалтеу

Реактивы

HgNO

в азотной кислоте в при-

сутствии азотистой кислоты

Кипящая концентрированная

азотная кислота

Глиоксиловая кислота в кон-

центрированной серной кислоте

n-Диметиламинобензальдегид

в концентрированной хлорис-

товодородной кислоте

α-Нафтол и гипохлорит натрия

Нитропруссид натрия в разбав-

ленном растворе аммиака

1,2-Нафтохинон-4-сульфонат

натрия и бисульфит натрия

Диазотированная сульфанило-

вая кислота в щелочном раст-

воре

Фосфомолибденово-вольфра-

мовая кислота

Определяемая

аминокислота

Тирозин

Фенилаланин,

тирозин

Триптофан

Аргинин

Цистеин

Гистидин,

тирозин

Тирозин

Окраска

Красная

Желтая

Сине-фиоле-

товая

Синяя

Красная

Синяя

Рис. 1.7. Работа автоматического анализатора аминокислот (принципиальная схема

по Шпакману, Муру и Стейну).

1 - смеситель; 2 - фотоэлектроколориметр; 3 - самописец.

ческих жидкостях и выявить наличие в них необычных азотсодержащих

веществ, что имеет важное диагностическое и прогностическое значение.

Автоматические анализаторы аминокислот все время совершенствуют-

ся, повышаются чувствительность методов и скорость проведения анализа.

Так, в современных приборах высокоэффективной жидкостной хроматогра-

фии (ВЭЖХ) удается проводить анализ гидролизата белка за 45 мин,

определяя при этом концентрацию аминокислот в пикомолях (рис. 1.8).

Смесь аминокислот может быть успешно разделена также методом

электрофореза на бумаге. При рН 6,0 возможно хорошее разделение кислых

и основных аминокислот с нейтральными. В этом случае отрицательно

заряженные (кислые) аминокислоты будут двигаться к аноду, а положитель-

но заряженные – к катоду. Нейтральные аминокислоты остаются на линии

старта.

Для их разделения электрофорез обычно проводят при рН 1,8–2,0, когда

все они мигрируют к аноду с незначительным, но уловимым различием

в подвижности. После электрофореза местоположение аминокислот на

электофореграмме выявляют с помощью химических реакций, а после

элюции окрашенных продуктов определяют их количественно.

Рис. 1.8. ВЭЖХ аминокислот по

Цеху и Вольтеру. Разделение на

колонке (3 х 250 мм), наполнен-

ной ионообменной смолой – поли-

стиролдивинилбензолом. Концент-

рация аминокислот 500 пмоль/л,

реактив для детектирования –

флюорескамин, образующий с

аминогруппой сильно флюоресци-

рующее соединение.

1 -

Асп;

2 -

Тре;

3 -

Сер;

4 -

Глу;

5 -

Гли;

6 -

Ала;

7 -

Цис;

8 -

Вал;

9 -

Мет;

10 -

Иле;

11 -

Лей;

12 -

Тир;

13 -

Фен;

14 -

Лиз;

15 -

Гис;

16 -

Арг.

БУФЕР

НИНГИДРИН

КОЛОНКА

Время, мин

100°

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются

высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набу-

ханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электри-

ческом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давле-

ние, способность к поглощению УФ-лучей при 280 нм (это свойство,

обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, использует-

ся для количественного определения белков).

Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных

- и СООН-групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований.

В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных

аминокислот белки в растворе несут или отрицательный, или положитель-

ный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при

очистке белков методом электрофореза.

Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Раст-

воры белков имеют очень низкое осмотическое давление, высокую вязкость

и незначительную способность к диффузии. Белки способны к набуханию

в очень больших пределах. С коллоидным состоянием белков связан ряд

характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе

количественного определения белков методом нефелометрии. Этот эффект

используется, кроме того, в современных методах микроскопии биологи-

ческих объектов. Молекулы белка не способны проникать через полупрони-

цаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также

биомембраны растительных и животных тканей, хотя при органических

поражениях, например, почек капсула почечного клубочка (Шумлянского-

Боумена) становится проницаемой для альбуминов сыворотки крови и по-

следние появляются в моче.

Молекулярная масса белков

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых

входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных

в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков колеблется

от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества

отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры

белка. Такие полипептидные цепи получили название субъединиц. Их мол.

масса варьирует в широких пределах – от 6000 до 100000 и более.

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены

для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их

молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для

огромного количества встречающихся в природе белков химическое строе-

ние не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной

массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические,

осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и

др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного

анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. Определение молеку-

лярной массы белков методами седиментационного анализа проводят

в ультрацентрифугах *, в которых удается создать центробежные ускорения

* Впервые ультрацентрифуга была сконструирована шведским ученым Т. Сведбергом.

Прибор был снабжен оптической приставкой, способной периодически через равные промежут-

ки времени фотографировать процесс осаждения (седиментации) белковых частиц.

(g), превышающие в 200000 и более раз ускорение земного притяжения.

Обычно вычисляют молекулярную массу по скорости седиментации моле-

кул белка или седиментационному равновесию. По мере перемещения

молекул от центра к периферии образуется резкая граница растворитель-

белок (регистрируется автоматически). Оптические свойства растворителя

и белка используются при определении скорости седиментации; последнюю

выражают через константу седиментации s, которая зависит как от массы,

так и от формы белковой частицы:

где v – скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с; ω – угло-

вая скорость ротора, рад/с; r – расстояние от центра ротора до середины

ячейки с раствором белка, см. Константа седиментации имеет размерность

времени (ее выражают в секундах). Величина константы седиментации,

равная 1•10

–13

с, условно принята за единицу и названа сведбергом (S).

Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах

1–50 S, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 S.

Для вычисления молекулярной массы (М), помимо константы седимен-

тации, необходимы дополнительные сведения о плотности растворителя

и белка и другие согласно уравнению Сведберга:

где R – газовая постоянная, эрг/(моль•град); Т – абсолютная температура

(по шкале Кельвина); s – константа седиментации; ρ – плотность раствори-

теля; v – парциальный удельный объем молекулы белка; D - коэффициент

диффузии.

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифуги-

рования требует много времени и сложной и дорогостоящей аппаратуры.

Поэтому в последние годы разработаны два более простых метода (гель-

хроматография и электрофорез). При использовании гель-хроматографии

в первую очередь требуется откалибровать колонку. Для этого через

колонку с сефадексом пропускают несколько белков с известными молеку-

лярными массами и строят график, откладывая значения логарифмов

молекулярной массы против их элюционных объемов, которые находят, как

показано на рис. 1.9.

Известно, что между логарифмом молекулярной массы белка, имеюще-

го сферическую форму, и элюционным объемом существует прямая зависи-

мость. Поэтому легко определить молекулярную массу исследуемого белка,

зная его объем элюции. Второй разновидностью этого метода является

тонкослойная гель-хроматография. Длина пробега белка (в миллиметрах)

Рис. 1.9. Измерение объема элюции (V

Концентрация

мл

Рис. 1.10. Зависимость между длиной

пробега белковых частиц при гель-хро-

матографии в тонком слое сефадекса

Г-150 (сверхтонкого) и их молекуляр-

ными массами (в полулогарифмической

системе координат).

1 - рибонуклеаза; 2 - химотрипсиноген; 3 -

яичный альбумин; 4 - сывороточный альбу-

мин; 5 - γ-глобулин; Х - белок с неизвестной

молекулярной массой.

через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от

молекулярной массы белка (рис. 1.10).

Гель-хроматография, кроме простоты и быстроты, имеет дополнитель-

ное преимущество: не требуется выделять белок в чистом виде, так как

примеси других белков не мешают определению, поскольку каждый из них

проходит через колонку со свойственной ему скоростью, определяемой

молекулярной массой. Это обстоятельство широко используется в энзимо-

логии, когда оказывается возможным определение молекулярной массы

даже очень небольшого количества фермента в присутствии других белков,

не обладающих аналогичной каталитической активностью.

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для

определения молекулярной массы белков также строят график зависимости

между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвиж-

ностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив

подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 1.11).

Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия,

так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная

зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки

с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы,

поэтому метод находит широкое применение для определения молекуляр-

ной массы субъединиц белка.

Рис. 1.11. Зависимость между молеку-

лярной массой и относительной подвиж-

ностью белка при диск-электрофорезе

в полиакриламидном геле в присутствии

додецилсульфата натрия (в полулогариф-

мической системе координат).

1 - сывороточный альбумин; 2 - яичный альбу-

мин; 3 - пепсин; 4 - химотрипсиноген; 5 - мио-

глобин; 6 - цитохром с; Х - белок с неизвест-

ной молекулярной массой.

Длина пробега,

мм

Молекулярная масса x 10

–4

Молекулярная

масса

–4

Относительная подвижность

Недавно предложен новый масс-спектрометрический метод (так назы-

ваемый лазерный десорбционно-ионизационный метод), позволяющий оп-

ределять молекулярную массу небольших пептидов (вазопрессин, инсулин)

и крупных биополимерных молекул и, кроме того, структуру биомолекул.

Форма белковых молекул

О величине и форме белковых молекул раньше судили по данным ультра-

центрифугирования, двойного лучепреломления и диффузии. Эти данные

указывали на существование в природе глобулярных (шарообразных) и

фибриллярных (нитевидных) белков. В настоящее время общие представле-

ния о форме белковых молекул в основном подтвердились, однако только

современные методы исследования позволили установить детали прост-

ранственной конфигурации (трехмерной структуры) белковых молекул.

Благодаря применению сканирующей микроскопии и рентгеноструктурного

анализа (высокое разрешение, порядка 0,2–0,3 нм) удалось в деталях

расшифровать не только полную пространственную структуру, форму, но

и степень асимметрии белковых молекул во всех трех измерениях. Оказа-

лось, что даже глобулярные белки крови (гемоглобин, альбумины и гло-

булины) являются асимметричными в указанных измерениях. Следует

отметить, что не только физико-химические, но и биологические свойства

белков (в свободном или в связанном друг с другом или с другими

биополимерами состоянии) определяются их пространственной структурой.

Денатурация белков

Природные белковые тела наделены определенной, строго заданной прост-

ранственной конфигурацией и обладают рядом характерных физико-хими-

ческих и биологических свойств при физиологических значениях темпера-

туры и рН среды. Под влиянием различных физических и химических

факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя

нативные свойства. Таким образом, под денатурацией следует понимать

нарушение общего плана уникальной структуры нативной молекулы белка,

преимущественно ее третичной структуры, приводящее к потере характер-

ных для нее свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность,

биологическая активность и т.д.). Большинство белков денатурирует при

нагревании их растворов выше 50–60°С.

Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости,

особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых раство-

ров, увеличению количества свободных функциональных SH-групп и изме-

нению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным

признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря

белком его биологической активности (каталитической, антигенной или

гормональной). При денатурации белка, вызванной 8М мочевиной или

другим агентом, разрушаются в основном нековалентные связи (в частно-

сти, гидрофобные взаимодействия и водородные связи). Дисульфидные

связи в присутствии восстанавливающего агента меркаптоэтанола разры-

ваются, в то время как пептидные связи самого остова полипептидной цепи

не затрагиваются. В этих условиях развертываются глобулы нативных

белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры

(рис. 1.12).

При непродолжительном действии и быстром удалении денатурирую-

щих агентов возможна ренатурация белка с полным восстановлением

Рис. 1.12. Денатурация бел-

ковой молекулы (схема).

а - исходное состояние; б - начи-

нающееся обратимое нарушение

молекулярной структуры; в - не-

обратимое развертывание поли-

пептидной цепи.

Рис. 1.13. Денатурация и ре-

натурация рибонуклеазы (по

Анфинсену).

а - развертывание (мочевина +

меркаптоэтанол); б - повторное

свертывание.

исходной трехмерной структуры и нативных свойств его молекулы

(рис. 1.13), включая биологическую активность. Таким образом, при дена-

турации белковая молекула полностью теряет биологические свойства,

демонстрируя тем самым тесную связь между структурой и функцией. Для

практических целей иногда используют процесс денатурации в «мягких»

условиях, например при получении ферментов или других биологически

активных белковых препаратов в условиях низких температур в присутст-

вии солей и при соответствующем значении рН *. При лиофилизации

белков (высушивание в вакууме путем возгонки влаги из замороженного

состояния) для предотвращения денатурации часто пользуются химически-

ми веществами (простые сахара, глицерин, органические анионы).

* Процесс денатурации используется в медицинской практике: при отравлениях сулемой

или другими солями тяжелых металлов пострадавшему в качестве «противоядия» дают

молоко или раствор яичного белка.

Изоэлектрическая и изоионная точки белков

В изоэлектрической точке суммарный заряд белков, обладающих амфотер-

ными свойствами, равен нулю и белки не перемещаются в электрическом

поле. Зная аминокислотный состав белка, можно приближенно определить

изоэлектрическую точку (pI); pI является характерной константой белков.

Изоэлектрическая точка большинства белков животных тканей лежит в пре-

делах от 5,5 до 7,0, что свидетельствует о частичном преобладании кислых

аминокислот. Однако в природе имеются белки, у которых значения

изоэлектрических точек лежат в крайних значениях рН среды. В частности,

величина рI пепсина (фермент желудочного сока) равна 1, а сальмина

(основной белок из молоки семги) – почти 12.

В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и легко

выпадают в осадок. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени

зависит от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее

величину не влияет концентрация белка.

В химии белков существует понятие «изоионная точка белка». Раствор

белка называется изоионным, если он не содержит никаких других ионов,

кроме ионизированных остатков аминокислот белковой молекулы и ионов,

образующихся при диссоциации воды. Для освобождения белка от посто-

ронних ионов обычно его раствор пропускают через колонку, наполненную

смесью анионо- и катионообменников. Изоионной точкой данного белка

принято называть значение рН изоионного раствора этого белка:

где [Р] – молярная концентрация белка; Z – средний заряд молекулы. Со-

гласно этому уравнению, изоионная точка белка зависит от его концент-

рации. Очевидно, поэтому белок, за исключением случая, когда рI равно 7,

не может быть одновременно изоэлектрическим и изоионным.

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ

Выяснение структурной организации белков считается одной из главных

проблем современной биохимии. Оно имеет важное научно-практическое

значение для понимания огромного разнообразия функций белков, выпол-

няемых ими в живых организмах. Белковые молекулы представляют собой

продукт полимеризации 20 различных мономерных молекул (аминокислот),

соединенных не хаотично, а в строгом соответствии с кодом белкового

синтеза (см. главу 14). Вопрос о том, каким образом соединяются между

собой многие десятки и сотни аминокислот в белковой молекуле, был

предметом пристального внимания многих лабораторий мира, занимав-

шихся химией белка.

Впервые А.Я. Данилевский (1888), изучая биуретовую реакцию, высказал

предположение о существовании во всех белковых веществах одинаковых

групп атомов и связей, аналогичных биурету NH

—СО—NH—СО—NH

Тем самым А.Я. Данилевский первый указал на связь —NH—СО—

(позднее получившую название пептидной связи) как на наиболее вероят-

ный способ соединения аминокислот в белковой молекуле.

Однако только Э. Фишер (1902) сформулировал полипептидную теорию

строения. Согласно этой теории, белки представляют собой сложные

полипептиды, в которых отдельные аминокислоты связаны друг с другом

пептидными связями, возникающими при взаимодействии α-карбоксильных

СООН- и α-NН

-групп аминокислот. На примере взаимодействия аланина

и глицина образование пептидной связи и дипептида (с выделением молеку-

лы воды) можно представить следующим уравнением:

Аналогичным способом к дипептиду могут присоединяться и другие

аминокислоты с образованием три-, тетра-, пентапептида и т.д. вплоть до

крупной молекулы полипептида (белка). Наименование пептидов склады-

вается из названия первой N-концевой аминокислоты со свободной NH

группой (с окончанием -ил, типичным для ацилов), названий последующих

аминокислот (также с окончаниями -ил) и полного названия С-концевой

аминокислоты со свободной СООН-группой. Например, пентапептид из

5 аминокислот может быть обозначен полным наименованием: глицил-

аланил-серил-цистеинил-аланин, или сокращенно Гли–Ала–Сер–Цис–Ала *.

Образование пептидных связей, например, из трех разных аминокислот

может быть представлено в виде следующей схемы:

Химический синтез полипептидов и современные физико-химические

методы исследования белков полностью подтвердили существование пеп-

тидных связей в структуре белка. Получены следующие экспериментальные

доказательства полипептидной теории строения белка.

1. В природных белках сравнительно мало титруемых свободных

СООН- и NH

-групп, поскольку абсолютное их большинство находится

в связанном состоянии, участвуя в образовании пептидных связей; титрова-

нию доступны в основном свободные СООН- и NН

-группы у N- и С-

концевых аминокислот пептида.

2. В процессе кислотного или щелочного гидролиза белка образуются

стехиометрические количества титруемых СООН- и NH

-групп, что свиде-

тельствует о распаде определенного числа пептидных связей.

* Синтез полипептидов (белков) в клетках живых организмов протекает значительно

сложнее с участием нуклеиновых кислот. Этот процесс детально рассматривается в главе 14.

Аланин

Глицин

Аланилглицин

Трипептид

N-концевая АМК

Пептидные связи

С-концевая АМК