Абрамова Л.И., Орлова И.Н. Цитологическая и цитоэмбриологическая техника

Всесоюзная ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени Академия

сельскохозяйственных наук им. В.И.Ленина и Всесоюзный ордена Ленина и ордена

Дружбы народов НИИ растениеводства им. Н.И.Вавилова (ВИР)

ЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ И ЦИТОЭМБРИОЛОГИЧЕСКАЯ

ТЕХНИКА

(для исследования культурных растений)

Методические указания

Составители:

Л.И.Абрамова, И.Н.Орлова, М.А.Вишнякова, Л.Н.Константинова,

Л.И.Орел, В.Ф.Огородникова,

под редакцией д.б.н. Л.И.Орел

Ленинград 1982 г.

Институт биофизики клетки РАН

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Электронная копия Методических указаний подготовлена в

Издательском Секторе Центра аналитической микроскопии (ЦАМ) для

Электронной библиотеки Сервера ЦАМ (http://cam.psn.ru)

Главный Редактор электронной копии – д.б.н.,проф. А.Ю.Буданцев

Пущино, 2001 г.

Редакционный Совет Центра аналитической микроскопии:

д.т.н.,проф. Г.М.Агаджанян, д.ф.-м.н.К.Б.Асланиди, д.б.н., проф. А.Ю.Буданцев – председатель

Совета, д.б.н., проф. В.П.Зинченко, к.б.н. В.Н.Карнаухов, д.т.н.,проф. Э.И.Лежнев, д.б.н., проф.

Д.А.Мошков, ст.н.сотр.В.А.Никитин,

д.б.н.,проф. В.А.Печатников, д.б.н. В.И.Попов,

ст.н.сотр. В.А.Яшин

Предисловие

редактора электронной копии

Изданием электронной копии методического руководства «Цитологическая и

цитоэмбриологическая техника» (для исследования культурных растений)

составленного группой ученых из Всесоюзного Института растениеводства им.

Н.И.Вавилова и опубликованной в полиграфическом виде в 1982 г. в Ленинграде,

мы продолжаем серию электронных книг по методам исследования

микроанатомии, цито- и гистохимии и цитоэмбриологии растений.

Это методическое руководство, или как авторы его назвали Методические

указания, представляет в настоящее время библиографическую редкость и

практически недоступно специалистам. Следуя нашим издательским принципам и

традиции мы издаем данное Руководство в том виде как оно издано в оригинале.

Этим мы отдаем дань уважения авторам книги и, с другой стороны, мы желаем,

чтобы читатель мог ретроспективно увидеть движение области знания, которой

посвящена данная книга.

Как многие полиграфические издания в области микроскопической анатомии и

цитоэмбриологии, выпускаемые даже в настоящее время, данная книга имеет

один серьезный изъян: в ней отсутствуют микрофотографии препаратов, что,

несомненно, затрудняет пользование книгой, особенно начинающим

исследователям. К сожалению, это удел многих отечественных авторов – издание

книг с высокой полиграфией микрофотографий, особенно цветных, почти всегда

находится далеко за пределами наших финансовых возможностей!

При подготовке электронной копии данного Руководства нам неоценимую

помощь оказала проф. М.А.Вишнякова, один из авторов исходной книги, за что

Редакционный Совет Центра аналитической микроскопии приносит ей глубокую

благодарность.

Мы уверены, что электронная копия Руководства по «Цитологической и

цитоэмбриологической технике» (для исследования культурных растений), которая

составлена специалистами Отдела цитологии ВИР им. Н.И.Вавилова будет

полезна для специалистов, молодых исследователей, аспирантов и студентов,

работающих и желающих работать в области цитогенетики и эмбриологии

растений и селекции культурных растений.

Пущино, 2001 д.б.н., проф. Буданцев А.Ю.

Оглавление

Введение

1. Изучение митотических хромосом растений

1.1Методика подсчета хромосом в меристеме корешков

1.1.1. Проращивание

1.1.2. Определение времени фиксации

1.1.3. Предфиксационная обработка

1.1.4. Фиксация

1.1.5. Окрашивание

1.1.5.1. Окрашивание по Фельгену с холодным гидролизом

1.1.5.2. Ускоренные методы окрашивания

1.1.5.2.1. Мацерация

1.1.5.2.2. Окрашивание ацетоорсеином

1.1.5.2.3. Окрашивание пропионовым лакмоидом

1.1.5.2.4. Окрашивание пропионовым гематоксилином

1.1.5.3. Окрашивание ацетокармином

1.1.5.4. Методика дифференциального окрашивания хромосом по Гимза

1.1.5.4.1. Предобработка и приготовление препарата

1.1.5.4.2. Окрашивание

1.2. Приготовление постоянных препаратов

1.3. Методика подсчета хромосом в пыльцевом зерне

1.4. Методика подсчета хромосом в листьях картофеля и злаков

1.5. Буквенно-цифровые обозначения для описания кариотипа растений

1.5.1. Морфологические типы хромосом

1.5.2. Основные принципы описания кариотипа

1.5.3. Пример описания кариотипа

1.5.4. Описание кариотипа с применением дифференциального окрашивания

1 1.6. Приготовление реактивов

2 1.7. Рекомендуемая литература

3

4 2. Техника исследований мейотических хромосом в микроспорогенезе

культурных злаков и картофеля

2.1. Обработка материала

2.1.1.Фиксация

2.1.2. Окрашивание

2.1.3. Приготовление препарата

2.1.4. Изготовление постоянных препаратов

5 2.2. Окрашивание мейотических хромосом картофеля

спиртсолянокислым кармином

2.3. Методика исследования цитомиксиса

2.4 Рекомендуемая литература

3. Методики исследования пыльцы и пыльцевых трубок на рыльце и в

пестике различных растений

3.1. Окрашивание пыльцевых трубок ацетокармином

3.2 Окрашивание пыльцевых трубок в столбике хлопчатобумажным

синим

3.3. Окрашивание хлопчатобумажным синим пыльцевых трубок

пшеницы

3.4. Исследование пыльцевых трубок на рыльце и в столбике на

серийных срезах, окрашенных железным гематоксилином по

Гейденгайну

3.4.1. Заливка материала парафином

3.4.2. Окрашивание срезов напредметных стеклах железным

гематоксилином по Гейденгайну

3.4.3. Приготовление раствора железных квасцов

3.4.4. Приготовление раствора гематоксилина

3.5. Исследование роста пыльцевых трубок в пестике при наблюдении

в ультрафиолетовом свете

3.5.1.Приготовление препаратов пыльцевых трубок злаков в столбике

после окрашивания флуорохромом и наблюдение их люминесценции

в ультрафиолетовом свете

3.5.2. Приготовление препаратов пыльцевых трубок в пестиках томатов

3.5.3. Приготовление препаратов пыльцевых трубок в пестиках яблони

3.5.4. Приготовление препаратов пыльцевых трубок в пестиках малины

3.6. Исследование живой пыльцы злаков

3.7. Выявление каллозы анилиновым синим с последующим

наблюдением под флуоресцентным микроскопом

3.8. Выявление каллозы микроспороцитов и тетрад в 5-10%-ном

растворе сахарозы

3.9. Просветление пыльников злаков для исследования расположения

пыльцевых зерен в гнездах

3.10.Окраска экзины пыльцы для изучения расположения пор и борозд

3.11.Окраска пыльцевых зерен кукурузы и пшеницы для наблюдения

митозов и спермиев

3.12.Выявление крахмала в пыльцевых зернах злаков

3.13.Окраска пыльцы кукурузы для подсчета фертильных и стерильных

пыльцевых зерен

3.14.Проращивание пыльцы томатов на искуственной питательной

среде

3.15.Изучение митотического деления генеративной клетки в пыльцевых

трубках томатов

3.16.Исследование мейоза в пыльниках кукурузы, пшеницы

3.17. Рекомендуемая литература

4. Ускоренные методы приготовления препаратов тотальных

зародышевых мешков

4.1. Методики, включающие мацерацию тканей семяпочки

4.2. Методы вычленения зародышевых мешков без мацерации тканей

семяпочки

4.3. Способ химической заточки препаровальных игл

4.4. Рекомендуемая литература

5. Методика изучения зародышей и эндосперма в семенах моркови

5.1. Исследование на постоянных резанных препаратах

5.2. Исследование разрезанных семян моркови

5.3. Рентгенография семян для определения величины эндосперма

5.4. Рекомендуемая литература

6. Гистохимия клеточной оболочки

6.1. Порядок дифференциального извлечения полисахаридов из

клеточной оболочки

6.2. Окрашивание реактивом Шиффа и иодной кислотой (ШИК)

6.3. Методы выявления веществ клеточной оболочки

6.3.1. Реакция с хлор-цинк-йодом для выявления целлюлозы

6.3.2. Реакция с йодом в растворе йодистого калия и с серной кислотой для

выявления целлюлозы

6.3.3. Реакция Крайчиновича для окрашивания пектиновых веществ

6.3.4. Реакция с флороглюцином для выявления лигнина

6.3.5. Реакция Молиша для выявления лигнина

6.3.6. Реакция Хенеля на суберин

6.3.7. Реакция с серной кислотой для выявления кутина

6.4. Окрашивание клеточных оболочек альциановым синим

6.5. Рекомендуемая литература

7. Фиксация и заливка пыльников для электронномикроскопических

наблюдений

Рекомендуемая литература

8. Выявление спорополлениновых оболочек тапетальных клеток

пыльников растений

9. Микроскопические измерения

9.1. Линейное измерение объектов

9.2. Определение увеличения (масштаба) изображения на

микрофотографиях и рисунках

9.3. Определение абсолютной величины объекта по его рисунку

9.4. Определение «линейного увеличения» объектов

9.5. Измерение длины с помощью крестообразного столика

(препаратоводителя) микроскопа

9.6. Измерение длины с помощью счетной камеры

9.7. Подсчет количества структурныхэлементов (устьиц, волосков и др.)

на единицу площади (1мм2) органа, ткани

9.8. Измерение толщины объекта

9.9. Методы нахождения определенных участков препарата

9.10. Рекомендуемая литература

10. Рецепты для приготовления фоторастворов

Рекомендуемая литература

11. Тонирование негативов в синий тон

Рекомендуемая литература

12. Приготовление рисунка на фотографии

Рекомендуемая литература

13. Таблица для разведения спирта водой

14. Единицы измерения, используемые в современной морфологии и

гистохимии

15. Реактивы

Рекомендуемая литература

ВВЕДЕНИЕ

Методические указания по цитологической и

цитоэмбриологической технике

представляют собой расширенное и переработанное издание

"Руководства по

цитологической технике" (1974).

В предлагаемые методические указания включены способы

подготовки

препаратов, рецепты, приемы подготовки материала к исследованию,

используемые в отделе цитологии и анатомии ВИР им.Н.И.Вавилова.

Ряд методик

разработаны или модифицированы сотрудниками и аспирантами

отдела.

В методических указаниях приводятся в основном методы,

апробированные в

практической работе.

По сравнению с предыдущим, в настоящем издании введены

дополнительные

разделы, включающие описания хорошо зарекомендовавших себя и

относительно

новых способов: дифференциального окрашивания хромосом,

вычленения целых

зародышевых мешков злаков из семяпочки и заключения их в смесь

Гойера,

цитохимического выявления составных компонентов клеточной

оболочки. Введены разделы по микроскопическим измерениям,

рецептуре некоторых используемых при микрофотографии растворов.

Составители надеются, что методические указания будут

полезны

селекционерам в тех случаях, когда у них возникнет необходимость

в

микроскопических исследованиях растений.

1. ИЗУЧЕНИЕ МИТОТИЧЕСКИХ ХРОМОСОМ РАСТЕНИЙ

1.1. Методика подсчета хромосом в меристеме корешков. В

последнее время исследователи все чаще наряду с микротомными

используют давленые

препараты. Приготовление давленых препаратов для подсчета числа

хромосом

занимает меньше времени и c соответствующей обработкой

исходного материала дает хорошие результаты. Изучение морфологии

хромосом тоже удобнее проводить на таких препаратах не столько

из-за быстроты их приготовления, сколько из-за удобства

использования при кариологическом анализе.

Многочисленные опыты показали, что метод давленых

препаратов дает лучшие результаты особенно, когда это касается

материала из молодых растущих

корешков, в том случае, если последние подвергаются

предварительной

обработке колхицином, 8-гидроксихинолином, альфа-

монобромнафталином,

парадихлорбензолом. Считают, что эти реагенты вызывают

определенные

физические изменения в цитоплазме и хромосомах, способствуя

разбрасыванию и укорочению хромосом и выявляя более отчетливо их

морфологию. Давление,

оказываемое на исследуемую ткань, позволяет добиваться

распределения всех

клеток в один слой на предметном стекле и одновременно делать их

более

плоскими.

Основные этапы работы: проращивание семян, клубней, корневищ

и луковиц

для получения молодых растущих корешков; предварительная

обработка живых

(нефиксированных) кончиков корешков веществами, действующими на

митоз;

фиксация и окрашивание фиксированных корешков; исследование

готовых

препаратов под микроскопом.

1.1.1. Проращивание. Семена, клубни, луковицы, корневища

проращивают в чашках Петри, чашках Коха или кристаллизаторах на

влажной фильтровальной бумаге. Можно использовать корешки

свежевыкопанных живых растений, а также корешки укорененных

побегов.

1.1.2. Определение времени фиксации. Прежде чем

начать приготовление препаратов для работы, нужно определить

время, когда у исследуемого объекта в корешках наиболее

интенсивно проходит деление меристематических клеток. Для этого,

обеспечив достаточную влажность и температуру, в разное время

дня (обычно с 8-9 ч утра до 17-18 ч вечера) нужно приготовить и

просмотреть серию препаратов, окрашивая материал ацетокармином

или каким-нибудь другим красителем, красящим и фиксирующим

одновременно. Это позволяет найти наbболее пригодное для

дальнейших фиксаций время с учетом количества делящихся клеток.

Для окрашивания ацетокармином корешки нагреваются в тигле почти

до кипения, затем помещаются в свежую каплю красителя на

предметное стекло, где кончик корешка (зона деления) отрезается.

Если корешок крупный, он расщепляется на части. Препарат

накрывается покровным стеклом. Более равномерное распределение

материала под ним достигается постукиванием по покровному стеклу

заостренной спичкой.

1.1.3. Предфиксационная обработка. Еще одним

существенным моментом в предфиксационной обработке является

определение наиболее подходящей концентрации и времени

воздействия используемых метапластических веществ. При этом надо

учитывать различное действие этих веществ на клетки растений

разных родов, а иногда и видов. Ниже приводятся данные о

концентрации и времени воздействия реагентов на митотически

делящиеся клетки (табл.1). Часть сообщаемых сведений проверена в

отделе цитологии и анатомии ВИР им.Н.И.Вавилова, часть взята из

работ, опубликованных в области цитологии.

Таблица 1

Условия предварительной обработки метапластическими веществами

меристематических тканей растений

Метапласти-

ческие вещества

Исследуемые

объекты

Конценрация, Время

воздействия

ч

Температура в

период

воздействия

°С

Колхицин

Agropyron 0,2 4-4,5 комн.

0,05 2-5 комн.

Allium 0,1 1-2 комн.

Anemone 0,05 2-3,5 комн.

Crepis 0,05 2 20

Gossipium 0,01 5 20

Hordeum 0,01 4 20

Lilium 0,2 3,5 комн.

Lotus 0,05 1 комн.

Ornithogalum 0,01 4 20

Phlox 0,1 3-4 комн.

Pinus 0,2 8 комн.

Pisum 0,01 6 20

Polygonatum 0,01 5,5 комн.

Ranunculaceae 0,05 5 комн.

Scilla 0,05 3-5 комн.

Secale 0,1 3-4 комн.

0,2 5 комн.

Sоlanum 0,01 5 комн.

Trifolium 0,01 6 комн.

Triticum 0,1 5 комн.

Vicia 0,01 5 20

Vicia faba 0,05 2-4 комн.

Оксихинолин

Allium 0,002М 4 комн.

Beta 0,002М 3 16

Сhrysanthemum 0,002М 2-5 комн.

Hordeum 0,002М 3-4 18

Nicotiana 0,002М 3 20

Poaceae 0,002М 3-4 15

Ranunculus 0,002М 6 комн.

Solanum 0,002М 2-3 20

Vicia 0,002М 5 комн.

Парадихлор-

бензол

Bromus

насыщен-

ный р-р

4

20

Medicago То же 50 мин 20

Pisum То же 6 20

Vicia То же 4 20

Umbelliferae То же 2 10-12

-монобром-

нафталин

Avena

Водный

раствор

3

20

Сitrulus То же 1,5 5

Cucumis То же 1,5 5

Hordeum То же 1,5 5

Lolium То же 2,5-3 24

Lycopersicon То же 1,5 5

Ornithogalum То же 0,5 комн.

Polygonatum То же 1-2 комн.

Secale То же 1-3 20-30

Triticum То же 5 2-4

Некоторые исследователи считают, что лучшие результаты дает

предварительная обработка несколькими веществами, действующими

последовательно или в смеси. Наиболее распространенные условия

такой

обработки приведены в табл.2.

Таблица 2.

Условия проведения предварительной обработки меристематических

тканей растений смесью реагентов

Объект Реагент Концент-

рация,

%,

М

Время

воздей-

ствия,

ч

Температура

воздействия

°С

Ист

очник

Allium

Колхицин 0,025% 1,5 -

Оксихинолин 0,002М 1,5 4

Тарасова,

1973 [18]

Allium

Колхицин 0,025% 2 22

Оксихинолин насыщен-

ный р-р

2 10

Паву

лсоне,

Иордански

й

[13]

Zea

Смесь:

Колхицин+

α-монобром

-

нафталин

0,05% +

0,5%

4

комн . Hadlaczky

,

Kalman,

1975

[26]

Hordeum Колхицин 0,05% 1,5 комн. опытные

данные

α-монобром-

нафталин

насыщен-

ный р-р

0,5 комн. опытные

данные

Pisum

Колхицин 0,05% 1 комн.

α-монобром

-

нафталин

насыщен-

ный р-р

0,5 комн.

Абрамова

,

1979

[4]

Pisum

оксихинолин 0,002М 1 комн.

α-монобром

- нафталин

насыщен-

ный р-р

0,5 комн.

Абрамова

1979 [4]

Pisum

Смесь:

Оксихинолин

+

α-монобром-

нафталин

0,002М+

насыщен-

ный р-р

16 3

Абрамова,

1979 [4]

Исходя из данных о времени воздействия и концентрации

веществ, известных

для близких видов и родов, берется минимальная концентрация и

самое

короткое время предфиксационной обработки. Например, при работе

с

Абрамова Л.И., Орлова И.Н. Цитологическая и цитоэмбриологическая техника

Подождите немного. Документ загружается.