Абрамова Л.И., Орлова И.Н. Цитологическая и цитоэмбриологическая техника
Подождите немного. Документ загружается.
всего от температурных факторов. Поэтому время сбора материала
устанавливается экспериментально для каждого объекта (известно,
что при теплой погоде митоз начинается в более ранние часы и
протекает активнее). Размер пыльников, в пыльцевых зернах
которых можно обнаружить первый митоз, зависит от объекта
исследования.
Окрашивание хромосом в пыльцевых зернах см. разд. 1.1.5.3.
1.4. Методика подсчета хромосом в листьях картофеля и
злаков. При подсчете хромосом в листьях обычно не применяется
предварительная обработка материала. Для исследования
используются основания молодых растущих листочков. Отрезанные
основания листочков либо фиксируются предварительно по Карнуа
(3:1), либо погружаются непосредственно в маленький тигель с
ацетокармином или ацетолакмоидом, выполняющим двойную роль и
красителя и фиксатора. Для зафиксированного материала применяют
те же красителя. Тигель с обрабатываемым материалом нагревается
несколько раз на спиртовке, но при этом жидкость не доводится до
кипения. Прокрашенные основания листочков переносятся в 45%-ную
уксусную кислоту для уменьшения интенсивности окраски цитоплазмы
клеток. Препарат приготавливается в чистой капле 45%-ной
уксусной кислоты. Для этого окрашенный небольшой кусочек ткани
помещается на предметное стекло, разрезается на несколько
частей, которые равномерно распределяются под покровным стеклом.
Материал раздавливается постукиванием заостренной спички по
покровному стеклу. Лишнюю жидкость из препарата убирают
фильтровальной бумагой. Меристематическая зона листьев
характеризуется большим количеством делящихся клеток и их
относительно малыми размерами. Почти все хромосомные пластинки
просматриваются с полюса, поэтому хромосомы на них расположены
удобно для подсчета.
1.5. Буквенно-цифровые обозначения для описания кариотипов
растений. Необходимость морфологической идентификации хромосом
была вызвана появлением новой отрасли цитологии - сравнительной
кариологии. Поскольку кариосистематические исследования
проводились как на животных, так и на растениях, в разработке
вопросов терминологии приняли участие генетики и цитологи,
занимающиеся самыми различными объектами. Большой вклад в эту
работу внесли специалисты в области изучения хромосом человека,
так как для решения вопросов медицинской генетики наиболее
важным и актуальным на сегодняшний день является точная
идентификация индивидуальных пар хромосом.
Кариотип представляет собой совокупность хромосом
организма, т.е. его диплоидный набор, определяемый величиной,
формой и числом хромосом [16]. Один из способов его описания -
составление морфологической характеристики, включающей основное
число хромосом, их форму и относительную величину, число и
морфологию хромосом со вторичными перетяжками, абсолютную
величину хромосом, распределение эу- и гетерохроматина, степень
асимметрии кариотипа (соотношение равно- и неравноплечих
хромосом и различие между хромосомами по длине).
Анализ хромосомных наборов в соматических клетках
затрудняется в ряде случаев значительным сходством морфологии
гомологичных хромосом (например, у луков, пшениц). В работе с
таким материалом часто используется поликариограммный анализ с
применением двухмерных поликариограмм [8,13]. Каждая хромосома
характеризуется двумя параметрами, выбор которых зависит от
исследователя. В системе координат каждой хромосоме
соответствует одна точка. Число точек зависит от плоидности
растения и количества измеренных метафазных пластинок. Все
возможные поликариограммы делятся на два типа: количественные и
ранговые. Наиболее подробные сведения о различных вариантах
поликариограммного анализа изложены в статье Г.В.Дерягина и
Ю.М.Перельцвайга [6]. Авторы этой работы считают, что
количественные поликариограммы имеют преимущество перед
ранговыми.
1.5.1. Морфологические типы хромосом. Первые
характеристики хромосом появились в начале века, но до
настоящего времени основным признаком, на котором основывается
определение морфологического типа хромосом, служит
местоположение центромеры, в первую очередь "первичное
расчленение хромосом" [11].
Поскольку разными авторами приводятся разные словесные
описания одних и тех же типов хромосом, необходимо установить
однозначность некоторых из них. Так, в отечественной литературе
используются термины равноплечие - неравноплечие хромосомы.
Зарубежными авторами употребляются соответственно термины
метацентрические - субметацентрические хромосомы, иногда
медиоцентрические для первых. Реже встречаются термины
изобрахиальные - гетеробрахиальные хромосомы. Под первыми
подразумеваются хромосомы, плечи которых примерно равны по
величине и соответственно центромера расположена почти посредине
хромосомы. Под вторыми хромосомы с плечами разной длины и
центромерой, сдвинутой к краю одного из плеч. Для описания
хромосом человека приняты такие термины, как метацентрик и
акроцентрик.
Из ранних работ, в которых наиболее подробно обсуждались
вопросы морфологии хромосом, необходимо упомянуть статью
Г.А.Левитского [11], в которой автор на основании соотношения
плеч выделил следующие типы хромосом:
Бисквитообразными назывались очень короткие равноплечие
хромосомы.
Более подробно вопросы истории возникновения различных
терминов и их соотношения между собой освещены в работе Левана и
др. [31].
Почти одновременно со словесными определениями типов
хромосом появились буквенные. Первоначально они основывались на
внешнем подобии формы хромосом и букв латинского алфавита.
Поскольку ранние исследователи имели дело с микротомными
препаратами, приготовленными из необработанного
метапластическими веществами материала, хромосомы на метафазных
пластинках обычно имели V-образную или палочковидную
(крючковидную) форму. Отсюда, видимо, и пошло обозначение
равноплечих хромосом буквами латинского алфавита V и v, а резко
неравноплечих - буквами J и j.
Для различения гомологичные пары хромосом на метафазной
пластинке подписывались заглавными буквами латинского алфавита
А, А
1
; В, В
1
; С, С
1
; D, D
1
и т.д. Несколько позже появилась
буквенная характеристика хромосом, основанная на обозначении их
размеров с помощью начальных букв слов, соответствующих этому
признаку - L (Long), M (Medium), S (Short).
Из приведенного выше видно, что в первом случае можно было,
хотя и грубо, с помощью одной буквы, применяя заглавные и
прописные, обозначить и размер и форму хромосом. Например V
обозначает длинную и равноплечую хромосому, v - короткую и
равноплечую, J - длинную и неравноплечую, а j - короткую и
неравноплечую. В двух других случаях появилась необходимость и
дополнительной характеристике, касающейся морфологического типа
хромосом. Обычно для этого пользуются одной или двумя первыми
буквами слов, определяющих положение центромеры: m
(metacentric), sm (submetacentric), st (subtelocentric), t
(telocentric). Встречаются самые различные сочетания таких
буквенных характеристик: V, J, v, j [29]; L, l; M, m; S, s [33];
L
s
, M, S
s
,S [34]; A
1
A
2
, B
1
B
2
, C
1
C
2
, и т.д. [12]; A
sm
, B
st
[28]; L
sm→
st
, S
1
sm→ st
S
2
m
и т.д. [20].
По всей вероятности, для облегчения сопоставления
результатов, полученных авторами, пишущими на разных языках,
лучше пользоваться предложенными английскими обозначениями.
В кариологии применяются и цифровые обозначения пар
хромосом. Так по Денверской системе хромосомы человека
пронумерованы арабскими цифрами. Чем меньше размер хромосом, тем
больше ее номер.
Специальной разработкой номенклатурных вопросов, касающихся
морфологических типов хромосом, растительных объектов,
занимались Батталья [21, 22], Леван и др. [31]. В статье Левана
с соавторами приводится новая система описания типов первичного
расчленения хромосом.
Трудно ожидать, чтобы сейчас появилась какая-то
универсальная система обозначения кариотипов. Это связано с
большим разнообразием задач, которые ставят перед собой
исследователи, разным таксономическим рангом обрабатываемых
кариологических групп растений и большими колебаниями размеров
хромосом у разных растений.
С другой стороны, нельзя не стремиться к единообразию
морфологических описаний хромосом. Этот вопрос неоднократно
поднимался во многих работах современных кариосистематиков и
цитологов.
1.5.2. Основные принципы описания кариотипа. В
кариосистематических исследованиях культурных и дикорастущих
растений значительную роль играет описание кариотипов изучаемых
видов. В отделе цитологии и анатомии ВИР разработана система
буквенно-цифровых обозначений основных типов хромосом,
позволяющая выразить кариотип растения формулой [1, 2],
выражающей величину хромосом и их морфологию "в
последовательности букв и цифр" [22].
В основу предлагаемой ниже схемы описаний кариотипов
положены исследования представителей родов Polygonatum Mill.,
Solanum L., Pisum L. и Vavilovia Fed.
Необходимо сразу же оговориться, что мы ограничились
методом описательной морфологии, уделяя особое внимание наличию
спутников и вторичных перетяжек. Использование их в качестве
маркеров расширяет возможности внутригрупповой идентификации.
Это обусловлено особой спецификой работы с объектом, имеющим
крупные хромосомы с отчетливым и разнообразным по типу
расчленением.
Из предложенных разными авторами буквенно-цифровых
обозначений были выбраны сочетания, наиболее удобные для
описания обрабатываемого материала. Предполагалось, что формула
даже при отсутствии рисунков даст полное представление о
кариотипе, и при сравнении формул появится возможность оценить
сходство и различие сравниваемых кариотипов. По размерам
выделены три класса хромосом. Они обозначены заглавными буквами
английских слов: длинные (L), средние (М), короткие (S).
Морфологическая характеристика хромосом основана на положении
первичной перетяжки-центромеры. При срединном положении
центромеры различаются медианная центромера, в таком случае
хромосомы равноплечие, метацентрические (m), соотношение плеч
около 1:1, и субмедианная - у неравноплечих, субметацентрических
хромосом (s), соотношение плеч колеблется от 1:1,5 до 1:3. При
положении центромеры, близком к концу хромосомы, т.е.
субтерминальной, хромосомы резко неравноплечие, акроцентрические
(а), соотношение их плеч равно 1:3 [ 11, 14, 21, 22].
Представляется удобным использовать следующие обозначения
при описании хромосомы: заглавные буквы (L, M, S) - ее размеры и
прописные (m, s, a) - положение ее центромеры. Наличие вторичной
перетяжки (с) и спутника (t) приводится в виде показателя
степени у большой буквы, определяющей размеры хромосомы.
Таким образом, буквы, характеризующие первичное расчленение
хромосом, составляют нижний ряд, а буквы, обозначающие вторичное
расчленение, верхний ряд.
Цифры перед заглавными буквами указывают на число пар
сходных хромосом в кариотипе вида. Видовой кариотип состоит из
суммы всех типов хромосом, определенных при изучении метафазных
пластинок. На повторность в кариотипе основного числа хромосом
указывает цифра перед скобками, в которые заключено буквенно-
цифровое обозначение гаплоидного набора. Для
кариосистематических сравнений вида такие формулы очень удобны.
В качестве примера принятой системы описания приведем
обозначения основных типов хромосом у исследованных видов
Polygonatum Mill: длинные равноплечие и почти равноплечие
хромосомы, центромера медианная (L
m
); длинные равноплечие
хромосомы со вторичной перетяжкой, центромера медианная (Lm
с
);
длинные резко неравноплечие хромосомы, центромера
субтерминальная (L
a
); средние неравноплечие хромосомы, центромера
субмедианная (M
s
); средние неравноплечие хромосомы со вторичной
перетяжкой, центромера субмедианная (M
s
c
), средние резко
неравноплечие хромосомы со вторичной перетяжкой, центромера
субтерминальная (M
a
c
); короткие неравноплечие хромосомы со
вторичной перетяжкой, центромера субмедианная
(S
s
c
); короткие резко неравноплечие хромосомы, центромера
субтерминальная (S
a
).
В кариотипах у видов Solanum секции Tuberarium, Pisum и у
Vavilivia formosa (Stev.) Fed. появляется еще один тип хромосом
спутничные: средние неравноплечие хромосомы со спутниками,
центромера субмедианная (М
s
t
).
При описании хромосом со вторичными перетяжками и
спутниками часто приходится приводить дополнительную
характеристику района вторичного расчленения. При этом у
спутничных хромосом указывается размер спутника, его тип,
величина плеча, к которому он прикреплен. У хромосом со
вторичными перетяжками отличительным признаком является величина
плеча с перетяжкой и положение ее на плече (дистальное или
проксимальное по отношению к центромере).
Спутничные хромосомы, различающиеся только по типу
спутника, отмечаются арабскими цифрами. Например, у видов Pisum
и у Vavilivia formosa в кариотипе встречаются спутничные
хромосомы двух типов - с макроспутниками, обозначенными t
1
и
микроспутниками - t
2
.
Для определения местоположения центромеры по длине
хромосомы можно пользоваться несколькими числовыми
характеристиками. В первую очередь это соотношение плеч (r),
разница их длин (d), и, наконец, центромерный индекс
(I
с
) -процентное отношение длины короткого плеча к общей длине
хромосомы. В последнее время наиболее часто определяющей
характеристикой морфологического типа хромосом служил
центромерный индекс, хотя, по мнению некоторых авторов [31],
удобнее пользоваться двумя первыми. Именно на основании
параметров r и d построена система определения положения
центромеры - M, m, sm, st, t, T, где М и Т - идеальные случаи
равноплечей и одноплечей хромосом.
При описании типов хромосом в нашей методике используются
числовые соотношения плеч.
Рис.1. Метафазная пластинка Polygonatum odoratum
1.5.3. Пример описания кариотипа ( Polygonatum odoratum,
рис.1). Прежде всего на препарате выбираются лучшие по
расположению хромосом пластинки, которые зарисовываются и
фотографируются. По рисункам или отпечаткам производится анализ
кариотипа.
Приступая к описанию конкретной метафазной пластинки,
необходимо разбить все хромосомы на пары. Поскольку нами не
ставилась задача идентификации каждой пары хромосом кариотипа,
возможность "перекрывания различий между гомологами
неспецифическим сходством между негомологами" [15] не
учитывалась, важно было выявить группы хромосом,
характеризующиеся одним морфологическим типом.
Пары хромосом последовательно обозначаются заглавными
буквами латинского алфавита: А А
1
, В В
1
, С С
1
и т.д. Затем пары
разбиваются на классы. В черновом варианте разбивки удобно
сначала выделить длинные - L, средние - М и короткие - S
хромосомы.
На этом этапе кариотипа выглядит так:
или K = 2n = 20 = 2 (1L + 5M + 4S).
Точно так же в дальнейшем определяется число пар хромосом,
сходных по положению центромеры:
Теперь можно составить окончательную формулу кариотипа:
K=2n=20=2(1L
m
+ 1M
m
+ 1M
m
c
+ 3M
s
+ 2S
m
+ 1S
m
c
+ 1S
a
).
Следующим этапом работы будет сопоставление результатов
описания нескольких метафазных пластинок одного и того же
препарата. Это позволит определить кариотип данного растения. В
тех случаях, когда исследователь имеет несколько образцов одного
вида, собранных из разных точек ареала или представляющих разные
морфологически отличающиеся популяции, он должен
проанализировать весь материал. Только сравнение кариотипов всех
изученных образцов даст возможность охарактеризовать постоянство
и вариабельность кариотипа всего вида.
В качестве еще одного примера описания кариотипов приведем
Pisum siryacum (Berger) Lehm. и Vavilovia formosa (Stev.) Fed.
Кариотипы асимметричные, с преобладанием неравноплечих
(субметацентрических) хромосом. Наиболее характерным признаком,
различающим представителей этих двух близкородственных родов
служит место прикрепления спутников. У рода Pisum спутники
прикрепляются к длинному плечу, а у Vavilovia formosa - к
короткому плечу спутничных хромосом. Общая формула кариотипа
Pisum siryacum, идиограмма которого представлена на рис.2а,
может быть записана следующим образом:
K = 2n = 14 = 2(3M
s
+ 1M
s
t1
+ 1M
s
t2
+ 1M
a
+ 1M
m
).
Кариотип Vavilovia formosa (рис.2б) не содержит пары резко
неравноплечих хромосом (M
а
). Его формула:
K = 2n = 14 = 2(M
s
t1
+ 4M
s
+ 1M
s
t2
+ 1M
m
).
1.5.4. Описание кариотипа с применением дифференциального
окрашивания. Составление общей характеристики кариотипа с
использованием дифференциального окрашивания требует просмотра и
анализа нескольких метафазных пластинок с хорошо распределенными
хромосомами. Корректировка типов хромосом производится по
описаниям, составленным ранее с использованием препаратов,
окрашенных по Фельгену.
Очень важную роль в описательной и подготовительной работе
играют рисунки, выполненные с рисовальным аппаратом, которые в
дальнейшем помогают расшифровать и уточнить полученные
микрофотографии.
Окрашенные районы хромосом носят название сегментов, полос
или блоков (bands). Блоки располагаются специфическим образом на
каждой хромосоме и этот характер расположения одинаков для всех
тканей организма [5].
Работ, посвященных вопросам терминологии и подробного
описания типов дифференциальных блоков пока немного [8, 25, 38],
и результаты, изложенные в них, еще не обобщены.
Мы выделили три типа блоков по размерам: крупные, средние и
небольшие и два типа по местоположению на хромосоме: теломерные
и интеркалярные. Эта разбивка определяется характером
дифференциального окрашивания исследуемого нами материала и
основывается на морфологических признаках линейной
неоднородности хромосом.
При построении общей схемы местоположения дифференциальных
блоков применялась буквенно-цифровая характеристика кариотипа.
Рис.2. Идиограммы
гаплоидных
наборов хромосом
а) Pisum
syriacum;
formosa
Ниже приводится тип описания диплоидного набора обобщенного
кариотипа Polygonatum odoratum с дифференциально окрашенными
хромосомами (рис.3).
Общая формула кариотипа этого вида:
K = 20 = 2n = 2(1L
m
+ 1M
s
c
+ 4M
s
+ 1S
m
c
+ 2S
m
+ 1S
a
).
L
m
- 1 пара длинных равноплечих или почти равноплечих
хромосом, без блоков;
M
s
c
- 1 пара средних почти равноплечих хромосом со вторичной
перетяжкой, сегмент дистальный, без блоков;
M
s
- 1 пара средних неравноплечих хромосом с небольшими
теломерными блоками на коротких плечах;
- 1 пара средних неравноплечих хромосом с крупными
теломерными блоками на коротких плечах;
- 2 пары средних неравноплечих хромосом, без блоков;
S
m
c
- 1 пара коротких почти равноплечих хромосом со вторичной
перетяжкой, сегмент проксимальный, с интеркалярными блоками
среднего размера в районе вторичной перетяжки;
S
m
- 1 пара коротких почти равноплечих хромосом, с
небольшими блоками на коротких плечах;
- 1 пара коротких почти равноплечих хромосом, с крупными
теломерными
блоками на коротких плечах;
S
a
- 1 пара коротких резко неравноплечих хромосом, без
блоков.
Кариотип характеризуется наличием средних (M
s
) и коротких
(S
m
) хромосом как с крупными, так и с небольшими теломерными
блоками. Хромосома S
m
c
несет блок в районе вторичной перетяжки.
Таким образом с применением дифференциального окрашивания в
Рис.3. Идиограмма
диплоидного набора
хромосом
Polygonatum
odoratum
кариотипе Polygonatum odoratum вместо выделяемых раньше 6 пар
хромосом стало возможно идентифицировать уже 8 пар. Практически
идентифицируются все пары хромосом набора за
исключением двух пар средних неравноплечих хромосом.
Составленное подробное описание может служить основой для
идиограммы, которая представляет собой графическое изображение
одной из исследованных пластинок с сохранением присущих ей
размеров хромосом, а также размеров и местоположения
дифференциально окрашенных блоков. Для построения идиограмм
можно использовать как микрофотографии, так и рисунки.
1.6. Приготовление реактивов. Ацетоорсеин. 1 г орсеина
залить 45 мл подогретой почти до кипения уксусной кислотой и
добавить 55 мл дистиллированной воды. Прокипятить 3 ч на водяной
бане в колбе с отводной трубкой или обратным холодильником.
Остудить, профильтровать и хранить в
плотно закрытом сосуде.
Пропионовый лакмоид. 4 г лакмоида растворить в 50 мл 50%-
ной пропионовой кислоты, периодически в течение 3-5 дней
тщательно взбалтывая. Профильтровать и хранить в темной закрытой
посуде.
Пропионовый гематоксилин. 4 г железного гематоксилина
растворить в 10 мл 96-градусного спирта и долить до 100 мл
дистиллированной водой. Поставить "вызревать" в открытом сосуде
на 2-3 месяца при комнатной температуре или, чтобы ускорить
процесс "созревания", поместить в термостат при 30-35 град.С. В
термостате раствор "вызревает" через сутки. "Созревший" раствор
смешать со 100 мл 50%-ной пропионовой кислоты. Можно смешивать
свежеприготовленный раствор гематоксилина с тем же количеством
пропионовой кислоты и окрашивать материал по 1 способу (см.
с.15).
Пропионовые железоаммиачные квасцы. 1 г железоаммиачных
квасцов растворить в 200 мл 50%-ной пропионовой кислоты.
Спирто-солянокислый кармин. 4 г порошка кармина растворить
в 15 мл кипящей дистиллированной воды, к которой добавлен 1 мл
концентрированной соляной кислоты, и продолжать кипятить еще 10
мин. После охлаждения влить 95 мл 85-градусного спирта и
профильтровать полученный ратвор. Краситель можно использовать
повторно.
Гидрат окиси бария. За день до работы или в тот же день с
утра из гидрата окиси бария приготовить насыщенный раствор в
дистиллированной воде. Хранить в плотно закрытом сосуде,
наполненном до верха, для предохранения вещества от образования
соединений с углеродом воздуха. Повторно не использовать.