Абрамова Л.И., Орлова И.Н. Цитологическая и цитоэмбриологическая техника

Подождите немного. Документ загружается.

Буфер 2 х SSC. В мерной 0,5 л колбе растворить при комнатной

температуре в дистиллированной воде сначала 8,77 г NaCl, а затем

5,35 г цитрата натрия (C

х 5,5 H

O). Полученный раствор

тщательно смешать, переливая его до 10 раз в стеклянную посуду

соответствующего объема и обратно. Хранится

буфер около 2-х недель в холодильнике, в закрытом сосуде.

Фосфатный буфер Соренсона [7]. В отдельных мерных колбах по

0,25 л растворить 2,37 г Na

HPO

(I раствор) и 2,27 г КН

РО

(II

раствор). Хранить в закрытых сосудах в холодильнике. Сливать

вместе незадолго перед употреблением в соответствии с таблицей:

HPO

99,0 101,0 6,8

122,0 78,0 7,0

143,0 57,0 7,2

Краситель Гимза (по Романовскому). Стандартный раствор

азур-эозина по Романовскому непосредственно перед окрашиванием

разбавляется фосфатным буфером с рН 6,8 в соотношении 1:40 или

1:50. Выпадение хлопьев указывает на непригодность раствора для

работы. Причиной этого явления может быть плохой буферный

раствор.

Белок (Майера) для приклеивания объекта [17]. Взбить белок

куриного яйца с равным количеством химически чистого глицерина и

профильтровать через складчатый фильтр. К фильтрату добавить

несколько кристаллов тимола. Хранить в хорошо закрытом сосуде.

1.7. Рекомендуемая литература

1. Абрамова Л.И. Кариосистематический обзор видов Polygonatum (Mill.) вСоветском

Союзе. – Бот. журн., 1971, т. 56, № 4.

2. Абрамова Л.И. Кариотипическое сравнение видов картофеля (секция Tuberarium (Dun)

Buk.) рода Solanum L. – Бюлл. ВИР, 1973, вып. 32.

3. Абрамова Л.И. О дифференциальном окрашивании хромосом растений на примере

Polygonatum odoratum (Mill.) Druеe – Труды по прикл. бот., ген. и сел., 1977, т.60, вып.

4. Абрамова Л.И. Кариологическая характеристика видов рода Pisum L. – Культурная

флора СССР, 1979, т.4.

5. Босток К., Самнер Э. Хромосома эукариотической клетки, М., 1981.

6. Дерягин Г.В., Перельцвайг Ю.М. Поликариограммный анализ хромосом. – Изв. АН

СССР, сер. Биол., 1979, № 1.

7. Дженсен У. Ботаническая гистохимия. М., 1965.

8. Зурабишвили Т.Г., Иорданский А.Б., Бадаев Н.С. Поликариогаммный анализ и

исследование дифференциальной окраски хромосом Triticum aestivum L. – Докл. АН

СССР, 1974, т. 218, № 1-3.

9. Иорданский А.Б. Применение цитазы из улиток для микрорадиографии. – Цитология,

1965, т. 7, № 1.

10. Каптарь С.Г. Пропионово-лакмоидный метод. – Цитология и генетика, 1967, т. 1, № 4.

11. Левитский Г.А. Морфология хромосом. – Труды по прикл. бот., ген. и сел., 1931, т.27,

вып. 1.

12. Навашин М.С. Хромосомы и видообразование. – Бот. журн., 1957, т. 42, № 11.

13. Павулсоне С.А., Иорданский А.Б. Новый способ повышения разрешающей

способности кариограммного анализа. – Генетика, 1970, т. 7, № 4.

14. Прокофьева-Бельговская А.А. Строение и функция хромосом. – Руководство по

цитологии, 1966, т. 2.

15. Прокофьева-Бельговская А.А., Гиндилис В.М. Идентификация хромосом человека. –

Изв. АН СССР, сел. биол., 1965, вып. 2.

16. Ригер Р., Михаэлис А. Генетический и цитогенетический словарь. М., 1967.

17. Ромейс Б. Микроскопическая техника. М., 1954.

18.Тарасова Е.М. Исследования кариотипов девяти видов рода Allium L. – Бюлл. ВИР,

1973, вып. 29.

19. Щапова А.И. Дифференциальная окраска хромосом по Гимза и перспективы

использования этого метода в цитогенетике растений. – В кн.: Цитогенетика гибридов,

мутаций и эволюция кариотипа. Новосибирск, 1977.

20.Arano H., Nakanura Г. Cytological studies in family Lilliaceae of Japan.I. The karyotype

analysis and its karyological consideration in some species of Polygonatum, Disporum,

Veratrum and Smilacina. -Kromosomo, 1967, т.68, p.2205-2214.

21.Battaglia E. Сhгоmosome morphology and terminology. - Caryologia, 1955, v.8, N 1, p.179-

187.

22.Battaglia E. A system for the symbolic representation of karyotypes. - Bull.of Torrey

Bot.Club., 1955, v.82, N 3, p.163-167.

23.Gill B.S., Kimber G. The Giemsa-C-banded karyotype of rye. - Proc.Nat.Acad.Sci., 1974,

v.71, N 4, p.1247-1249.

24. Greilhuber J., Speta F. C-Banded karyotypes in the

Scilla hohenackeri group, S.persica and Pusckinia

(Liliaceae). - Plant Syst.Evol., 1976, v.126, p.149-188.

25. Greilhuber J., Speta F. Quantitative analyses of C-Banded karyotypes and systematics in the

cultivated species of the Scilla sibirica group (Liliaceae). - Plant Syst.Evol., 1978, v.129,

p.63-109.

26. Hadlaczky G., Kбlman L. Discrimination of homologous chromosomes of Maize with

Giemsa staining. — Heredity, 1975, v.35, M 3, p.371-374.

27. Henderson S.A., Lu B.C. The use of haematoxylin for

squash preparation of chromosomes. - Stain technol., 1968, v.43, N 4, p.233-236.

28. Inoue S.Cytogenetical studies of genus Polygonatum. I.Karyotype analysis of some

Alternifolia species in Japan. - Kromosomo, 1965, v.60, p.1951-1962.

29. Kawano S. Chronosome morphology of Smilacina scilloidea (Liliaceae) from Mexico. - Bot.

Mag.Tokyo, 1965, v.78, p.261-262.

30. Kimber G., Gill B.S., Rubenstein J.M., Barnhill G.L. The technique of Giemsa staining of

cereal chromosomes. - Res. Bull. Columbia, 1975, N 1012, p.3-6.

31. Levan A., Fredga К., Sandberg A.A. Nomenclature for centromeric position on

chromosomes. - Hereditas, 1964, Bd.52, p.201-220.

32. Löve A., Löve D. Plant Chromosomes. Vaduz, 1975, p.184.

33. Satina S., Bergner А.D., Blakeslee А.F. Morphological differentiation in chromosomes of

Dature stramonium. - Am.J.Bot., 1941, v.28, N 5, р.383-390.

34. Sato D. Karyotype alteration and phylogeny in Liliaceae and allied families. - Jap.J.Bot.,

1942, v.12, N 1-2, р.57-161.

35. Schweizer D.Differential staining of plant chromosomes with Giemsa. - Chromosoma, 1973,

Bd.40, S.307-320.

36. Sharma А.К. Fixation of plant chromosomes. - Bot. rev., 1956, v.22, N 10, p.665-695.

37. Vosa C.G. The basic karyotype of rye (Secale cereale) analysed with Giemsa and

fluorescence methods. - Heredity, v.33, p.403-408.

38. Vоsа С.G. Heterochromatin classification in Vicia faba and Scilla sibirica. - Chromosome

Today, 1976, v.5, p.185-192.

39. Wittman W. Aceto-iron-haematoxylin-chloralhydrate for chromosome staining. - Stain

Technol., 1962, v.37, N 1, р.161-164.

2. ТЕХНИКА ИССЛЕДОВАНИЯ МЕЙОТИЧЕСКИХ ХРОМОСОМ В

МИКРОСПОРОГЕНЕЗЕ КУЛЬТУРНЫХ ЗЛАКОВ И КАРТОФЕЛЯ

Поведение хромосом в мейозе дает возможность судить о

характере конъюгации, а следовательно, степени гомологии

хромосом исследуемых форм, цитологической стабильности, помогает

делать выводы о генетической полноценности гамет и причинах

стерильности микроспор.

Для приготовления хороших препаратов мейотических хромосом

следует выдавливать совокупности материнских клеток пыльцы из

покровов пыльника в каплю 45%-ной уксусной кислоты. Удалив

оболочки пыльника с предметного стекла, нужно равномерно

распределить выдавленные материнские клетки пыльцы, слегка

размешав содержимое капли тонкой препаровальной иглой. Каплю с

материалом накрыть покровным стеклом. Легкое надавливание на

него делает протопласты клеток достаточно плоскими, а

хромосомные конфигурации - доступными для наблюдения в большом

количестве материнских клеток пыльцы одного пыльника. Способ

выдавливания содержимого пыльника см. в разделе 2.1.3.

2.1. Обработка материала.

2.1.1. Фиксация. Материал следует фиксировать с 8 до 10-

11 ч утра в районе Ленинграда, а на юге, например в Дербенте, в

5-6 ч утра. Выбирают растения в фазе выхода в трубку, когда

колос находится еще глубоко в трубке. Для

определения нужной стадии мейоза следует освободить из трубки и

извлечь пыльник из колоска, сидящего приблизительно в середине

колоса. Окрашивают пыльник, нагревая его 3-4 раза почти до

кипения в капле ацетокармина на предметном стекле, раздавливают,

предварительно накрыв его покровным стеклом, и просматривают.

Обнаружив нужную стадию мейоза, в фиксирующую жидкость опускают

весь колос или фиксируют только по 2-3 срединных колоска с

каждой стороны колоса, аккуратно обламывая их пинцетом с уступов

колоскового стержня. Для более быстрого и успешного

проникновения фиксирующей жидкости с верхними частями колосковых

чешуй лучше всего срезать ножницами. Следует иметь в виду, что в

колосках, сидящих ниже и выше срединной части колоса, пыльники

несколько отстают по стадии мейоза от пыльников срединных

колосков.

Обычно материал фиксируют в смеси Карнуа (3:1) в течение

нескольких (3-5) часов, затем переносят в 70-градусный спирт на

сутки, после чего помещают в новую порцию 70-градусного спирта и

оставляют в нем до момента исследования.

Лучший результат дает фиксация по Ньюкомеру [4]. Фиксатор

состоит из следующих реактивов:

изопропилового спирта - 6 частей;

пропионовой кислоты - 3 части;

диоксана - 1 часть;

ацетона - 1 часть;

петролейного эфира - 1 часть.

В фиксаторе материал оставляют на сутки, после чего его

заменяют новой порцией фиксатора и хранят в холодильнике при

температуре +2-4 град.С до исследования. Существует другой

способ хранения, когда через сутки материал промывают 96-

градусным спиртом, сменив его трижды в течение для, а затем

помещают в 70-градусном спирте в холодильник. С фиксатором

Ньюкомера следует обращаться осторожно (диоксан - яд!),

необходимо работать в резиновых перчатках и в вытяжном шкафу.

Эти предосторожности нужно соблюдать и при приготовлении

фиксатора. Хранящийся в фиксаторе Ньюкомера материал годен для

исследований только в течение 6-7 мес. (при условии хранения его

в холодильнике). Перенос зафиксированного материала в 70-

градусный спирт удваивает срок его годности.

2.1.2. Окрашивание. При необходимости исследовать большое

количество материала удобнее окрашивать пыльники ацетокармином.

Препараты лучшего качества получаются из материала,

зафиксированного по Ньюкомеру, т.к. при фиксации легче добиться

равномерного уплощения протопласта клетки, а,

следовательно, наилучшего распределения хромосомных конфигураций

в метафазной пластинке.

Освобожденные от колосковых и цветочных чешуй

зафиксированные пыльники помещают в фарфоровый тигель с

несколькими каплями ацетокармина. Тигель нагревают

последовательно 5-7 раз над спиртовкой, не доводя ацетокармин до

кипения и полного испарения. Накрывают тигель часовым стеклом и

оставляют в нем материал не менее, чем на сутки при комнатной

температуре. Окрашенный материал можно оставлять в тигле под

часовым стеклом в течение двух недель, добавляя при частичном

испарении несколько капель ацетокармина. Качество окраски при

этом не ухудшается.

Для детального исследования конфигураций мейотических

хромосом пыльники лучше окрашивать по Фельгену. Освобожденные от

колосковых и цветочных чешуй пыльники переносят из фиксатора в

дистиллированную воду, затем их споласкивают в 1-нормальной

соляной кислоте и помещают в 50%-ную соляную кислоту (от

продажной) на 20 мин для гидролиза. После этого пыльники

помещают в реактив Шиффа на 1-2 ч. Окрашенные хромосомы

приобретают интенсивный фиолетовый цвет, а цитоплазма клетки

остается бесцветной или с едва заметным розовым оттенком.

Хромосомы кукурузы хорошо окрашиваются только по Фельгену.

2.1.3. Приготовление препарата. После окрашивания

пыльников ацетокармином каждый из них промывают на предметном

стекле последовательно в 2-3 каплях 45%-ной уксусной кислоты,

оттягивая загрязненную осадком ацетокармина уксусную кислоту

полоской фильтровальной бумаги.

Окрашенный по Фельгену пыльник сразу переносят в каплю 45%-

ной уксусной кислоты на предметное стекло и выдавливают

материнские клетки пыльцы из гнезд пыльника. Для этого,

придерживая один конец пыльника пинцетом, отрезают лезвием

безопасной бритвы другой его конец. Продолжая удерживать пыльник

пинцетом, проводят тонкой упругой иглой в направлении от пинцета

к отрезанному концу пыльника, выдавливая таким образом,

материнские клетки пыльцы. Чтобы распределить материнские клетки

пыльцы равномерно, содержимое капли слегка размешивают иглой.

Покрывают каплю покровным стеклом, на которое кладут полоску

фильтровальной бумаги и очень легко надавливают на него, не

допуская скользящего движения покровного стекла по предметному.

Просматривают препарат. При недостаточном уплощении клеток

легкое надавливание на покровное стекло повторяют.

Для работы с временным препаратом в течение 1-2 дней можно

окантовать покровное стекло расплавленным парафином.

Предварительно следует тщательно удалить уксусную кислоту вокруг

него фильтровальной бумагой, а затем, окунув конец шпателя в

расплавленный парафин, легко провести им по граням покровного

стекла. При работе с таким препаратом необходимо следить за

сохранностью парафиновой окантовки.

Можно заключить окрашенный материал в раствор Гойера [1],

капнув им на объект и накрыв его покровным стеклом. Это

избавляет от обработки препарата этиловым спиртом возрастающей

концентрации, бутиловым спиртом и ксилолом (до заключения в

бальзам). Раствор Гойера является хорошей заливочной средой и

просветляет препарат. Такие препараты, подобно глицерин-

желатиновым, можно хранить годы. Рецепт приготовления раствора

Гойера см. в разделе 4.2.

2.1.4. Изготовление постоянных препаратов. С временного

препарата следует снять покровное стекло, придерживая его

кончиком пальца за нижний левый угол и приподнимая лезвием

безопасной бритвы за верхний правый угол. Это можно сделать и в

том случае, если покровное стекло окантовано парафином.

Разъединенные предметное и покровное стекла обрабатываются 96-

градусным спиртом, бутиловым спиртом и ксилолом. В каждом из

этих веществ стекла выдерживают по 2-3 мин. После ксилола

следует заклеивание раствором канадского бальзама в ксилоле.

Материал можно заключить в среду Гойера сразу после разъединения

предметного и покровного стекол.

С помощью приведенной методики, проверенной нами на ржи,

пшенице, пшенично-ржаных гибридах, межвидовых амфидиплоидах

пшениц, тритикале и кукурузе, представляется возможным

определять числа бивалентов и унивалентов, тип конъюгации

хромосом, числа хиазм, вторичные ассоциации хромосом, числа

микроядер в тетрадах микроспор и другие детали микроспорогенеза

у культурных злаков.

2.2. Окрашивание мейотических хромосом картофеля спирто-

солянокислым кармином. Картофель относится к объектам, хромосомы

которых хорошо окрашиваются после применения специальных

методик. Это касается митотических и мейотических хромосом.

Большая часть обычно применяемых красителей слабо окрашивает

клетки картофеля. Картины мейоза наиболее хорошо выявляются

после фиксации по Ньюкомеру и окрашивание в

спирто-солянокислом кармине [5]. Для картофеля этот краситель

введен Хеглунг [3]. Материал (бутоны, освобожденные от покровов

цветков) помещается в краситель на 1-5 дней (можно дольше) при

комнатной температуре. Прогревание уменьшает время окрашивания

[2]. Непосредственно перед приготовлением препарата бутоны или

отдельные пыльники переносятся в 45%-ную уксусную кислоту для

дифференцировки на 1 ч и больше. В качестве среды для

приготовления препарата можно использовать 45%ную уксусную

кислоту или глицерин. Глицерин позволяет сохранять препараты в

течение недели, но клетки при этом остаются неуплощенными. В

случае же более сильного надавливания, протопласты клеток теряют

целостность.

Поэтому для получения препаратов, пригодных для

фотографирования, на наш взгляд, предпочтительнее использовать

45%-ную уксусную кислоту, позволяющую раздавить клетки и

добиться лучшего распределения в них хромосом. Приготовление

препарата описано в разделе 1.1.2. Описание фиксации материала

приведено ранее (раздел 2.1.1.). У картофеля фиксируются целые

соцветия. Приготовление реактива см. в разделе 1.6.

2.3. Методика исследования цитомиксиса. У дикорастущих

видов, культурных растений, а также различных гибридов часто

наблюдается цитомиксис - перемещение некоторого количества

цитоплазмы с ядром или частью ядра из

одной клетки в другую на любой стадии митотического цикла.

Миграция цитоплазмы с ядром является несомненно, нарушением

нормальных функций клетки, поэтому часто становится объектом

цитогенетических исследований. Мы наблюдали цитомиксис в

микроспорогенеза у пшениц, ржи, пшенично-ржаных гибридов и

амфидиплоидов, у межвидовых пшеничных и пшенично-эгилопсных

амфидиплоидов, а также аллоплазматических ржи и пшеницы.

Неверное истолкование картин цитомиксиса и его последствий

при цитологических исследованиях иногда вносит неясность в

решение принципиальных вопросов. Так, при обсуждении

возможности согласованного функционирования геномов исходных

видов в пшенично-ржаных амфидиплоидных гибридах, картины

последствий цитомиксиса ошибочно считали одним из доказательств

обособления генома ржи у тритикале. Источником этой ошибки была

прежде всего неправильная методика исследований цитомиксиса.

Наилучший результат дает наблюдение цитомиксиса в

неповрежденном спорогенном комплексе пыльника со специальным

окрашиванием клеточных оболочек.

Цитомиксис имеет место на разных стадиях развития

спорогенной ткани, начиная с премейотической интерфазы до тетрад

микроспор. В зависимости от стадии, в которой он чаще всего

встречается в конкретном материале, методики исследования

различаются. Так как миграция хроматина - процесс, в котором

участвуют не менее двух соседних клеток, необходимо наблюдать

его не в разобщенных клетках, как это часто делается, а в

неповрежденном спорогенном комплексе, желательно при однослойном

расположении микроспороцитов. Это условие можно соблюсти,

исследуя цитомиксис в премейотической интерфазе и ранней профазе

на постоянных препаратах, а в более поздних стадиях - на

выдавленных из гнезд пыльников спорогенных комплексах.

Цитомиктические каналы, через которые мигрирует цитоплазма

и ядерное вещество, возникают при повреждениях клеточных

оболочек. Наблюдать эти поврежденные участки, а также измерять

их удобнее всего на постоянных препаратах после реакции на

нерастворимые полисахариды с шифф-йодной кислотой (ШИК), хорошо

выявляющей клеточные оболочки.

Постоянные препараты продольных срезов пыльников готовят,

заключая в парафин молодые пыльники, зафиксированные по

Ньюкомеру или Карнуа. Стадию развития определяют предварительно

на временных препаратах, окрашенных ацетокармином. Оптимальная

толщина срезов молодых пыльников злаков равна 15 мкм. Для любого

другого объекта оптимальную толщину срезов следует

предварительно подбирать. Препараты окрашивают по Фельгену

обычным способом с применением холодного гидролиза, затем

обрабатывают 0,5%-ным раствором йодной кислоты и вторично

помещают в ту же порцию реактива Шиффа для получения реакции на

нерастворимые полисахариды (ШИК).

Процедура окрашивания постоянных препаратов (реакция

Фельгена + ШИК) состоит в следующем:

1. Срезы освобождают от парафина общепринятым способом и

доводят препараты до дистиллированной воды.

Далее препараты помещают последовательно в:

2. 1 н. соляную кислоту на 2 мин;

3. 50%-ную соляную кислоту на 20 мин;

4. дистиллированную воду на 10-15 мин;

5. реактив Шиффа на 0,5-1 ч;

6. воду водопроводную проточную на 10 мин;

7. воду дистиллированную на 2 мин;

8. 0,5%-ную йодную кислоту на 5-15 мин;

9. воду водопроводную проточную на 10 мин;

10. реактив Шиффа на 10-15 мин;

11. воду дистиллированную на 2 мин;

12. 2%-ный раствор метабисульфита натрия или калия на 2 мин;

13. воду водопроводную проточную на 5-10 мин.

Далее препараты доводят до ксилола и заключают в канадский

бальзам или иную среду общепринятым способом.

На готовом препарате оболочки археспориальных клеток или

микроспороцитов окрашены в яркий лиловый, а хроматин - в красно-

фиолетовый цвета на фоне бесцветной или светло-розовой

цитоплазмы.

На стадиях от средней профазы до тетрад микроспор

спорогенный комплекс удобнее исследовать на давленных

препаратах. Зафиксированные по Ньюкомеру пыльники окрашивают

ацетокармином или по Фельгену (см. раздел 2.1.1., 2.1.2.).

Окрашенный пыльник препарируют способом, описанным в разделе

2.1.3. На стадиях профазы (а часто и метафазы) удается таким

способом выдавить неповрежденные трубкообразные спорогенные

комплексы. В более поздних стадиях они при выдавливании частично

разрушаются. Под тяжестью покровного стекла спорогенный комплекс

также может частично разрушиться. Чтобы этого избежать, накрывая

объект покровным стеклом, следует класть последнее на кусочки

покровных стекол. На приготовленном таким способом препарате

хромосомы окрашены в интенсивный красно-фиолетовый (по Фельгену)

или красный (ацетокармином) цвета, а цитоплазма - бесцветная или

розовая. Оболочки клеток не окрашены, однако, из-за различных

коэффициентов преломления, граница между протопластом и хорошо

выраженным на этих стадиях слоем каллозы видна отчетливо.

Чтобы идентифицировать мигрировавшей хроматин в клетке-

реципиенте, следует иметь в виду следующее: во-первых, он всегда

лежит в цитоплазме клетки-реципиента и никогда не включается в

ее ядро; во-вторых, в зависимости от стадии, в которой произошла

миграция, он может быть в виде гомогенных капель различной

величины, в виде клубков профазных хромосом различной степени

спирализации, суженных в направлении к цитомиктическому каналу,

или в виде бивалентов, унивалентов и фрагментов метафазных

хромосом; в-третьих, мигрировавшие хромосомы оказываются более

или менее разрушенными в зависимости от ширины цитомиктических

каналов. Необходимо отличать случаи оптического наложения масс

мигрировавшего хроматина на собственное ядро клетки-реципиента.

2.4. Рекомендуемая литература

1. Freytag A.H. The of ethanol to improve aceto-carmine staining of orchid chromosomes. -

Stain Technol., 1963, v.38, N 5, p.290-292.

2. Gardner R.О., J.A.Rattenbury. Staining pollen nuclei with Snow's alcoholic hydrochloric acid-

carmine. - Stain Technol, 1974, v.49, N 5, p.257-259.

3. Höglund M. Meiosis in Solanum phureja. - Hereditas, 1970, т.66, N 2, р.183-188.

4. Newcomer E.H. A new cytological and histological fixing fluid. - Science, 1953, v.118, N

3058, p.161.

5. Snow R. Alcoholic hydrochloric acid-carmine as a stain for chromosomes in squash

preparations. - Stain Technol, 1963, v.38, N 1, p.9-13.

3. МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ ПЫЛЬЦЫ И ПЫЛЬЦЕВЫХ ТРУБОК

НА РЫЛЬЦЕ И В ПЕСТИКЕ РАЗЛИЧНЫХ РАСТЕНИЙ

В селекционной и генетической практике часто появляется необходимость

оценить фертильность пыльцы, восприимчивость рыльца к пыльце,

самостерильность или самофертильность, а также определить совместимость

скрещиваемых растений и уточнить момент проявления факторов

несовместимости в рыльце или столбике. Прямое наблюдение за прорастанием

пыльцевых зерен на рыльце и ростом пыльцевых трубок в столбике, как правило,

дает возможность быстро получать ответы на все эти вопросы.

Существует значительное число методик наблюдений пыльцевых трубок в

столбике. Описанные в них процедуры при определенном навыке легко

выполнимы. Следует иметь в виду, что приведенные ниже методики пригодны для

исследований одних видов растений и не удаются для других. После описания

процедуры окрашивания мы указываем виды растений, на которых этот метод

проверен. Очевидно, каждый исследователь может увеличить этот перечень.

Очень часто исследование прорастания пыльцевых трубок в пестиках растений

проводят после искусственного опыления пыльцой других растений или нанесения

на рыльце собственной пыльцы. В обоих случаях исследователь точно знает

время опыления. Затем производятся темпоральные фиксации гинецеев. Время

фиксаций зависит от скорости прорастания пыльцевых трубок в пестике

данного вида, может сильно варьировать и должно быть подобрано опытным

путем. Мы рекомендуем начать фиксировать материал через 2-4 ч после

опыления с интервалами 12, 24, 48, 72 и т.д. часов (до 5-7 сут.) и при

исследовании прорастания пыльцевых трубок выбрать для себя оптимальный

вариант фиксаций.

3.1. Окрашивание пыльцевых трубок ацетокармином [3]. Для окрашивания

используется ацетокармин, приготовленный по стандартной методике, или смесь

его с глицерином в равных частях. Предварительно фиксированные по Карнуа

или другими фиксаторами пестики помещаются в ацетокармин или в смесь его с

глицерином и слегка подогреваются (не доводить до кипения). Время

окрашивания может сильно варьировать в зависимости от объекта.

В результате пыльцевые трубки окрашиваются в красный цвет и хорошо видны

на светло-розовом фоне проводящей ткани пестика. Этот метод дал хорошие

результаты при исследованиях пыльцевых трубок традесканции, льна, некоторых

сложноцветных и злаков.

3.2. Окрашивание пыльцевых трубок в столбике хлопчатобумажным

синим. Окрашивание пыльцевых трубок проводится в целом, неразрезанном

столбике. В качестве фиксирующей жидкости применяется смесь уксусной

кислоты и спирта в отношении 1:1. Фиксирующую смесь нагревают до 60 град.

Фиксация продолжается в течение 30 мин.

Затем пестики переносят в воду, и, поместив в небольшую стеклянную

пробирку, нагревают на кипящей водяной бане в течение 5-10 мин. Для плотных

объектов время нагревания может быть увеличено до 30 мин. После этого пестик

просветляют в 60%-ной молочной кислоте в течение 30 мин, при температуре 60

град.

Готовится 1%-ный раствор красителя хлопчатобумажного синего (cotton blue),

или метилового синего, или анилинового синего в лактофеноле, и в этом растворе

окрашивают пестики 30-60 мин при температуре 60 град.

После этого пестики промывают в молочной кислоте несколько минут и

помещают на предметное стекло в каплю молочной кислоты, закрывают

покровным стеклом и раздавливают.

3.3. Окрашивание хлопчатобумажным синим пыльцевых трубок пшеницы

[8]. Этот метод является упрощенной модификацией предыдущего. Рыльце

пшеницы, по сравнению с рыльцами столбиков других растений, тонкое, поэтому

нет необходимости его нагревать. Растворяется 0,5 г хлопчатобумажного синего

(cotton blue) в 100 куб.см лактофенола (молочная кислота + фенол + глицерин +

вода - все в равных количествах). Фиксированные рыльца окрашиваются на

стекле в растворе красителя. В случае переокрашивания дифференцируют их в

лактофеноле. Для приготовления постоянного препарата рыльце можно заключить

в глицерин-желатину или, обработав спиртом и ксилолом, - в бальзам.

Для сохранения препарата в течение нескольких суток края покровного стекла

окантовывают расплавленным парафином.

Окрашенные в синий цвет пыльцевые трубки хорошо видны на фоне

просветленной проводящей ткани столбика. На рыльце пестика пыльцевые зерна,

образовавшие пыльцевую трубку, бесцветны. Непроросшие пыльцевые зерна

окрашены в синий цвет. Сосочки рыльца часто также окрашиваются.

Примечание. Этот метод, испытанный в отделе цитологии ВИР, дал хорошие

результаты при окрашивании пыльцевых трубок капусты и томатов. Необходима

тщательная мацерация тканей столбика и иногда более длительное окрашивание.

Метод апробирован для четырех видов однодольных и 32 видов двудольных

растений [5].

3.4. Исследование пыльцевых трубок на рыльце и в столбике на

серийных срезах, окрашенных железным гематоксилином по Гейденгайну.

В практике часто бывают такие случаи, когда вышеописанные методы

исследований растущих в столбиках пыльцевых трубок не дают положительных

результатов. Причины этого различные. На результат оказывают влияние

особенности объекта, качество красителей и реактивов и, наконец, предыдущий

опыт работы исследователя.

При неудачах использования способов исследований пыльцевых трубок,

рыльца и столбика не временных препаратах можно рекомендовать методику

заключения пестиков в парафин, резку их на микротоме и окраску срезов

гематоксилином. Этот метод окрашивания трудоемок и требует определенного

оборудования, которое обычно имеется в цитологической лаборатории.

Ниже приводятся способы фиксации, заливки материала в парафин и

окрашивания микротомных срезов, принятые в отделе цитологии ВИР.

Гинецеи фиксируют в смеси 96-градусного спирта и ледяной уксусной кислоты

(3:1), время фиксации от 4 ч до одних суток, в зависимости от толщины объекта.

После 1-2-кратной промывки 70-градусным спиртом (до исчезновения запаха