Абрамова Л.И., Орлова И.Н. Цитологическая и цитоэмбриологическая техника

Подождите немного. Документ загружается.

колхицином концентрации 0,01 удобно начинать с четырехчасовой

обработки.

Обработанные корешки окрашивают ацетокармином и препарат

готовят по

описанному выше методу. Просмотр препарата под микроскопом

позволяет

выяснить, в достаточной ли мере обеспечено данным способом

обработки

укорочение хромосом и их разброс. Хромосомы должны лежать на

некотором

расстоянии друг от друга и, по возможности, не налегать одна на

другую.

Если хромосомы плохо разошлись, то время предфиксационной

обработки

следует увеличить (обычно на 30 мин), приготовить и просмотреть

следующий препарат и так до тех пор, пока не будут получены

метафазные пластинки с хорошим разбросом хромосом.

Начинающие исследователи должны иметь в виду, что

передозировка колхицина может привести к возникновению

полиплоидных клеток. Чтобы избежать ошибки при подсчете хромосом

на обработанном материале, нужно обращать внимание на толщину

хромосом и их расположение. При полиплоидизации они лежат

попарно, часто параллельно друг другу, и их толщина вдвое

меньше, чем у хромосом нормальных клеток исследуемого растения.

После определения условий предварительной обработки

отрезанные корешки длиной около одного сантиметра опускаются в

раствор реагента на соответствующее число часов.

1.1.4. Фиксация. Фиксация представляет собой такую

обработку исследуемого материала, которая дает возможность

быстро прервать течение жизненных процессов у объекта, но

сохранить неизменной тонкую структуру его клеток. При этом

фиксатор должен оказывать на объект такое химическое

воздействие, чтобы последний получил возможность надлежащим

образом воспринимать краситель.

Материал (корешки), подвергнутый предварительной обработке,

промывают 96-градусным спиртом и перекладывают в фиксатор, в

качестве которого можно использовать фиксаторы Карнуа, Батталья

(5:1:1:1 - для семейства лилейных или 5:5:1:1 - для других

семейств) и ледяную уксусную кислоту. Более полный список

фиксаторов и их подробное описание приводится в специальной

методической литературе [32,36].

Ниже приводятся составы используемых нами фиксаторов.

Фиксатор Карнуа (3:1): Спирт 96-градусный - 3 части,

ледяная уксусная кислота - 1 часть.

Фиксатор Батталья (5:1:1:1). Спирт 96-градусный – 5 частей,

формалин 40%-ный от продажного - 1 часть, хлороформ - 1 часть,

ледяная уксусная кислота - 1 часть.

Фиксатор Батталья (5:5:1:1). Спирт 96-градусный - 5 частей,

хлороформ - 1 часть, ледяная уксусная кислота – 1 часть,

формалин 40%-ный от продажного - 1 часть.

В фиксаторе Карнуа (3:1) материал можно держать от 1 до 6

ч, затем промыть в 96-градусном спирте до исчезновения запаха

уксусной кислоты (три раза) и перенести в 70-градусный спирт для

хранения.

В фиксаторе Батталья фиксация длится от 5 мин и более,

в нем же материал может быть оставлен на хранение. Раствор можно

использовать повторно, предварительно профильтровав. Материал

может храниться и в 70-градусном спирте, куда он переводится из

фиксатора после ополаскивания в 96-градусном спирте.

В ледяной уксусной кислоте корешки фиксируются от 12 ч

до трех суток (в холодильнике) и после промывки их в 96-

градусном спирте (в нескольких сменах) переносится для хранения

в 70-градусный спирт.

1.1.5. Окрашивание. Для того, чтобы хромосомы в клетках

стали отчетливо видны, необходимо окрасить зафиксированный

материал красителем, выявляющим хроматин. Большинство ядерных

красителей адсорбируется элементами ядра или пропитывает их.

Только окрашивание по Фельгену с использованием в качестве

красителя реактива Шиффа основывается на химической реакции.

Предметные и покровные стекла должны быть чистыми, для

этого их некоторое время (от суток и больше) необходимо

выдержать в хромовой смеси. В том случае, если покровные стекла

не сильно загрязнены, можно ограничиться промыванием их в

спирте, оставляя на хранение в спирте или смеси спирта с эфиром.

Предметные стекла из хромовой смеси по мере надобности после

промывания в проточной воде переносятся в дистиллированную воду.

1.1.5.1. Окрашивание по Фельгену с холодным гидролизом.

Корешки непосредственно из фиксатора или 70-градусного спирта

помещаются на 10 мин в 1 н. соляную кислоту (для промывки),

затем переносятся для гидролиза в соляную кислоту, разведенную

дистиллированной водой (1:1), при комнатной температуре.

Время гидролиза определяется для каждого вида растений

опытном путем. Оно зависит от исследуемого объекта и

примененного фиксатора. Для интенсивного окрашивания хромосом в

корешках гороха, хлопчатника и почти всех линейных оно равно 20

мин, для корешков картофеля - двум часам.

Кислотный гидролиз освобождает альдегидные группы, с

которыми взаимодействует фуксинсернистая кислота (реактив

Шиффа), вызывая красно-фиолетовой окрашивание ДНК,

локализованной в хромосомах. При правильно подобранном времени

гидролиза происходит максимальное окрашивание хромосом. Если

гидролиз продолжается сверх оптимального срока, интенсивность

окрашивания убывает вплоть до полного исчезновения краски, при

недостаточном времени гидролиза наблюдается такая же картина. У

некоторых объектов концентрация ДНК в хромосомах так мала, что

реакция Фельгена не дает положительного результата. В этом

случае нужно применить другие красители.

Окрашивание производят в реактиве в течение 15 мин и

больше. Корешки лилейных в свежем красителе можно оставлять на

ночь в холодильнике. Окрашенный материал промывают в течение 1-2

мин в 45%-ной уксусной кислоте, а затем помещают в каплю свежей

45%-ной уксусной кислоты на предметное стекло. У помещенного на

предметное стекло корешка отрезают корневой чехлик и

неокрашенную часть - их убирают со стекла. Зону деления корешка,

окрашенную в интенсивный красно-фиолетовый цвет, разрезают на

несколько частей и распределяют на предметном стекле так, чтобы

все части уместились под накладываемое сверху покровное стекло,

но в то же время лежали на некотором расстоянии друг от друга.

Процедура подготовки препарата для исследования

приведена ранее

в разделе 1.1.2. Клетки плохо расходятся или ткань остается

частично нераздавленной, если корешок был разрезан на слишком

крупные куски. При работе с мелкими корешками можно помещать их

по три-четыре под покровное стекло, а в случае крупных корешков

лучше ограничиться одним. Необходимо всегда помнить, что каждый

препарат должен быть приготовлен из корешков одного растения.

Обычно покровные стекла бывают недостаточно плоскими. Поэтому

при изготовлении давленых препаратов покровные стекла следует

класть выпуклой стороной вверх. Такое положение покровного

стекла препятствует выходу материала из-под него при

надавливании.

Недостаточно интенсивная окраска хромосом на готовом

препарате может быть связана с неправильным определением

продолжительности гидролиза (см. выше), ухудшением качества

реактива Шиффа и, иногда, с низкой комнатной температурой. В

случае неудовлетворительной окраски препарат можно подкрасить

ацетокармином, подкапав краситель под покровное стекло, не

снимая его.

1.1.5.2. Ускоренные методы окрашивания хромосом. В

цитологической практике широко используются различные

быстродействующие красители, в состав которых в качестве

растворителя входят уксусная и пропионовая кислоты:

ацетоорсеин, ацетолакмоид, пропионовый лакмоид и сравнительно

недавно вошедший в употребление уксусный и пропионовый

гематоксилины. Замена уксусной кислоты пропионовой дает

возможность окрашивать трудноокрашиваемые объекты.

Растворы красителей, благодаря присутствию в их составе

уксусной или пропионовой кислот, обладают одновременно и

красящим и фиксирующим действием. Они обеспечивают хорошее

окрашивание хромосом в делящихся меристематических клетках

различных частей растений. При работе с этими красителями всегда

можно несколько модифицировать способы окрашивания в зависимости

от применяемого фиксатора и свойств исследуемого объекта.

Ацето- и пропионовыми красителями хорошо окрашивается

фиксированный и нефиксированный материала. Для фиксации чаще

применяется спирто-уксусный фиксатор Карнуа (3:1). Используется

также материал, сохраняемый после фиксации в 70-градусном

спирте. В этом случае объект перед окрашиванием помещают на один

час в 45%-ную уксусную кислоту или в 50%-ную пропионовую, в

зависимости от того, какая кислота входит в состав красителя.

При работе с трудноокрашиваемыми объектами лучшие

результаты получаются, если перед окрашиванием материал держат

несколько минут в соответствующей кислоте, в которую добавлено

несколько капель насыщенного раствора уксуснокислого железа.

1.1.5.2.1. Мацерация. Твердые объекты можно предварительно

подвергнуть мацерирующему воздействию 1 н. соляной кислоты

(время воздействия подбирается опытным путем).

В качестве мацерирующего вещества используют и горячую 45%-

ную уксусную кислоту. В этом случае отрезанные меристематические

зоны корешков помещаются в маленький бюкс или пенициллиновый

пузырек с небольшим количеством кислоты, он закрывается крышкой

и несколько секунд подогревается на спиртовке. Для того, чтобы

жидкость не перегрелась, пузырек

периодически отводится на спиртовке и осаждается. Из кислоты

материал переносится на предметное стекло в каплю красителя.

Довольно часто для мацерации применяются водные растворы

ферментов: пектиназа, цитазы и целлюлазы, как по отдельности,

так и в смеси. Методика использования цитазы подробно описана у

А.Б.Иорданского [9]. После мацерации приступают непосредственно

к окрашиванию.

1.1.5.2.2. Окрашивание ацетоорсеином. Корешки или другие

части растений, содержащие меристематическую ткань (после

фиксации или без нее) помещаются в тигель с несколькими каплями

ацетоорсеина. Тигель подогревается несколько раз над спиртовкой.

Жидкость до кипения не доводится.

После подогревания можно приступать непосредственно к

приготовлению препарата, а можно оставить материал для более

интенсивного окрашивания (лучше в холодильнике для уменьшения

испарения ацетоорсеина из тигля, закрытого только часовым

стеклом) на 12 ч и более.

Окрашенный материал помещается на предметное стекло в каплю

45%-ной уксусной кислоты для ослабления окраски цитоплазмы и

дополнительной мацерации. В качестве среды для приготовления

препарата иногда используются глицерин и хлоралгидрат.

Подробное описание приготовления препарата из корешков

растений приведено в разделе 1.1.2.

При работе с очень твердыми корешками перед процедурой

окрашивания необходимо провести мацерацию (см.выше).

1.1.5.2.3. Окрашивание пропионовым лакмоидом [10]. Корешки

фиксируются фиксатором Карнуа (3:1) и помещаются в несколько

капель красителя на 1-2 ч. Окрашенные корешки переносятся в 40%-

ную пропионовую кислоту, и жидкость нагревается до кипения в

течение нескольких секунд для дополнительной мацерации ткани и

ослабления окраски цитоплазмы. Затем материал переносится на

предметное стекло в каплю чистой 40%-ной пропионовой кислоты,

накрывается покровным стеклом и раздавливается.

Контрастность окрашивания хромосом увеличивается со сроком

хранения препарата.

1.1.5.2.4. Окрашивание пропионовым гематоксилином [27].

Гематоксилин сравнительно недавно вошел в практику приготовления

давленых препаратов. Первый вариант его применения включал

протравливание окрашиваемого материала большим числом веществ

[39].

Усовершенствование методики значительно упростило работу

с этим красителем и сократило количество компонентов,

участвующих в процессе окрашивания [27]. Гематоксилин,

растворенный в пропионовой кислоте, не обладает способностью

окрашивать хромосомы без протравливания, поэтому необходима

предварительная обработка материала раствором железоаммиачных

квасцов, обладающих протравливающими свойствами.

Для окрашивания хромосом применяются два основных

раствора: раствор А, состоящий из 2%-ного гематоксилина в 50%-

ной пропионовой кислоте и раствор В, состоящий из 0,5%-ных

железоаммиачных квасцов в 50%-ной пропионовой кислоте. Метод

применим для окрашивания как фиксированного, так и

нефиксированного материала.

Перед окрашиванием материал подвергается мацерации в 1 н.

соляной кислоте от нескольких минут до получаса, в зависимости

от толщины и твердости тканей. После этого он промывается в воде

и опускается для пропитывания на несколько минут в 50%-ную

пропионовую кислоту.

Существует четыре способа окрашивания пропионовым

гематоксилином, зависящие от объекта и целей исследования.

1-й Способ (особенно удобен при работе с "незрелым"

раствором А). Растворы А и В смешиваются в соотношении 1:1 в

количестве, необходимом для окрашивания данного материала, и

используются в смеси через сутки или через несколько суток.

Следующими тремя способами (2-4) можно работать только при

наличии "созревшего" раствора гематоксилина.

2-й Способ. Одна-две капли растворов А и В смешиваются

прямо на предметном стекле и в эту смесь помещается материал.

3-й Способ. В каплю раствора А на предметное стекло

помещается материал, который при необходимости расщепляется на

части. После этого сюда же добавляется капля раствора В.

4-й Способ. На стекло в каплю раствора В помещается

материал, затем туда добавляется капля раствора А и жидкости

перемешиваются.

Независимо от способа окрашивания крупные куски

материала расщепляются на части и распределяются на предметном

стекле так, чтобы получилось однослойное расположение клеток

раздавливаемой ткани. Усиление интенсивности окрашивания

материала достигается тем, что после обработки в 1 н. соляной

кислоте, он промывается 50%-ной пропионовой кислотой с

добавлением в нее нескольких капель насыщенного раствора

уксуснокислого железа в 50%-ной пропионовой кислоте.

Таким образом, полный курс окрашивания состоит из пяти

этапов: фиксации, промывки в 1 н. соляной кислоте, промывки в

дистиллированной воде, протравливании в растворе уксуснокислого

железа в 50%-ной пропионовой кислоте, окрашивании.

В некоторых случаях можно ограничиться только последним

пятым этапом, опустив четыре предыдущих, которые призваны только

улучшить качество окрашивания и мацерацию материала.

Пропионовый гематоксилин дает хорошее окрашивание

митотических хромосом льна, которые не красятся при

использовании ряда других известных методов.

1.1.5.3. Окрашивание ацетокармином. Хорошее окрашивание

хромосом в пыльцевых зернах большинства растений дает

ацетокармин. Способ приготовления препарата зависит от размеров

пыльника. Крупный пыльник помещается на предметное стекло в

каплю ацетокармина, у него отрезается широкий конец и содержимое

выдавливается в краситель. Оболочки пыльника удаляются, после

чего капля красителя с материалом накрывается покровным стеклом.

Мелкий пыльник целиком помещается в каплю ацетокармина.

Приготовленный препарат несколько раз нагревается над пламенем

спиртовки. При этом необходимо следить, чтобы подогреваемая

жидкость не закипела. Избыток ацетокармина убирается

фильтровальной бумагой после того, как пыльца окрасится. Мелкие

пыльники хорошо мацерируются при нагревании в красителе и легко

раздавливаются при постукивании спичкой по покровному стеклу.

Если одного постукивания недостаточно, можно, накрыв препарат

полоской фильтровальной бумаги, слегка на него надавить, не

допуская при этом сдвигания материала.

Для более интенсивного окрашивания хромосом в пыльцевом

зерне бутоны с пыльниками, находищимися в нужной стадии деления,

лучше зафиксировать в фиксаторе Карнуа (3:1) или Батталья

(5:5:1:1) и уже затем окрашивать. Состав фиксаторов смотри в

разделе 1.1.4.

В стадии метафазы первого митоза после окрашивания

ацетокармином, ярко-красные хромосомы четко видны на фоне

светло-розовой цитоплазмы.

1.1.5.4. Методика дифференциального окрашивания

митотических хромосом по Гимза [3]. Дифференциальное

окрашивание хромосом выявляет их неоднородность по длине.

Различия, обнаруживаемые у хромосом одной и той же метафазной

пластинки, позволяют идентифицировать отдельные хромосомы и пары

гомологов. Одновременно с этим появляется возможность анализа

кариотипов на внутривидовом и межвидовом уровнях. На

растительных объектах

методика начала разрабатываться сравнительно недавно, с 70-х

годов, поэтому существует ряд нерешенных вопросов как

теоретического, так и методического плана. Необходимо указать,

что не существует универсального метода работы со всеми

растениями. Для каждого рода, а иногда и вида приходится

подбирать режим работы, в то время как общие этапы обработки

сходны для всех растительных объектов. Ниже приводится подробное

изложение условий обработки и окрашивания раствором Гимза по

Романовскому для представителей рода купен Polygonatum.

1.1.5.4.1. Предобработка и приготовление препарата. В

качестве материала используются растущие корни взрослых

растений. Кончики корней обрабатываются 0,5%-ным раствором

колхицина в течение 5,5 ч, из которых 1-2 ч сосуды с корешками

выдерживаются в холодильнике при температуре 5 град.С. Фиксация

производится в ледяной уксусной кислоте [23] и продолжается от

16 ч до трех суток в холодильнике. Препараты приготавливаются из

свержезафиксированного материала, что крайне важно для получения

в дальнейшем хорошего окрашивания.

Отрезанные меристематические зоны корней (беловатые по

цвету) мацерируются в 45%-ной уксусной кислоте при слабом

нагревании в течение нескольких секунд [25]. Вытянутые пипеткой

из жидкого фиксатора кусочки корней с меристематическими зонами

помещаются по одному на предметное стекло в каплю ацетокармина

[19]. Материал на стекле разрезается на несколько частей,

закрывается покровным стеклом и раздавливается. Подкрашивание

ацетокармином позволяет отбраковывать препараты с малым числом

делений в клетках и следить за хорошим распределением хромосом в

них. Готовый препарат обсушивается фильтровальной бумагой,

чтобы удалить лишнюю жидкость, и помещается на кусок сухого

льда. Предметное стекло после снятия покровного опускается на

некоторое время в 96-градусный этиловый спирт (см. пункт 5А в

статье Кимбер и др. [30]). После обезвоживания в спирте

препараты подвергаются воздушной сушке не менее одних суток. В

таком виде их можно хранить до года при комнатной температуре,

оберегая от пыли.

Готовые высушенные препараты в ограниченном количестве

(не более четырех на 50 мл раствора) перед окрашиванием

подвергаются обработке в насыщенном растворе гидрата окиси бария

- Ba(OH)

х 8Н

О в дистиллированной воде.

Раствор с барием готовится за день до работы или в тот же

день с утра и хранится в плотно закрытом сосуде при комнатной

температуре. Жидкость доливается до верха сосуда для

предохранения вещества от соприкосновения с воздухом.

Применяемая горячая обработка препаратов Ba(OH)

х 8Н

О в

течение 10 мин при 60°С, после чего они споласкиваются в 1 н.

соляной кислоте, промываются в трех сменах дистиллированной воды

по 10 мин в каждой и либо непосредственно переносятся в буфер 2

x SSC, либо высушиваются на воздухе.

За это время заранее приготовленный буфер 2 x SSC (0,3M

NaCl + 0,03М C

x 2H

O с рН 6,8) подогревается до 60 град.С.

В ходе приготовления буфера вещества поочередно растворяются в

дистиллированной воде в одной и той же мерной колбе. Материал в

буфере 2 x SSC обрабатывается 30 мин при 60

град.С. Препараты, обработанные в буфере, промываются тремя

сменами дистиллированной воды по 10 мин в каждой. Можно

приступать к окрашиванию влажных препаратов и можно

предварительно подсушить их на воздухе.

1.1.5.4.2. Окрашивание. В качестве красителя используется

готовый жидкий основной раствор Гимза по Романовскому,

разведенный фосфатным буфером Соренсона с рН 6,8 или рН 7,0 в

соотношении 1:40.

В 25 мл красителя окрашивается 2-6 препаратов.

Необходимая яркость достигается в течение 5-20 мин. Более

длительное выдерживание приводит к перекрашиванию препарата,

которое трудно ослабить дифференцировкой в воде или буфере.

В ходе окрашивания препараты анализируются под

микроскопом и по мере выявления в интерфазных ядрах

хромоцентров, которые видны отчетливее, чем блоки на хромосомах

при маленьком увеличении микроскопа, переносятся для промывания

в дистиллированную воду. При слабом перекрашивании препарат

можно отдифференцировать, продержав его в воде минут 20. В том

случае,

когда рН дистиллированной воды приближается к 5,5, хромосомы

приобретают голубоватый оттенок, а блоки на них и хромоцентры

имеют малиново-сиреневый цвет. После промывания в воде препарат

высушивается на воздухе, обрабатывается последовательно

бутиловым спиртом и ксилолом (по 5 мин в каждом) и заключается в

бальзам. Ниже приводится общая схема двух способов окрашивания

препаратов по Гимза (Схема 1).

Необходимо остановиться на нескольких, на наш взгляд,

методически важных моментах работы.

Замена мацерирующего фермента (см.раздел 1.1.5.2.1) 45%-ной

уксусной кислотой имеет свои преимущества. Во-первых, не все

ферменты пригодны в работах по дифференциальному окрашиванию

хромосом, во-вторых, не все лаборатории располагают такими

ферментами.

Переход к фиксации ледяной уксусной кислотой подсказан

опытом ряда авторов [19,23]. Даже те исследователи, которые

применяли в качестве фиксаторов ацето-алкоголь (1:3) с метиловым

или этиловым спиртами, почти всегда выдерживали материал после

фиксации и непосредственно перед обработкой ферментами в 45%-ной

уксусной кислоте от нескольких минут до нескольких часов.

Швейцер [35] считает, что 45%-ная уксусная кислота действует на

фиксированную меристему двояко: с одной стороны, мацерирует ее,

с другой, подготавливает хроматин к дифференцированному

восприятию красителя Гимза.

1-й способ

2-й способ Схема 1

Ba(OH)

- 60 град.С; 7-10 мин Ba(OH)

– комн.,

10-15 мин

1 н. соляная к-та (сполоснуть) промывка под

струей дист.воды

три смены дист. воды

2 х SSC - 60 град.С; 30-45 мин

(рН 7,2)

высушивание на воздухе три смены

дист. воды

2 х SSC - 60 град.С; 30-45 мин р-р Гимза

(1:40) - комн.;

(рН 7,2)

1-20 мин (рН 6,8)

высушивание на воздухе

р-р Гимза (1:40) - комн.;

1-20 мин (рН 6,8)

бальзам

высушивание на воздухе

бутиловый спирт, ксилол

(по 5 мин)

бальзам

Удобства применения ацетокармина при приготовлении

препаратов указаны выше. В ходе обработки краска вымывается и в

дальнейшем не мешает проведению исследования. Необходимость

ограничения числа обрабатываемых препаратов связана не только с

определенным объемом красителя, но и с невозможностью просмотра

и обработки больше 4-6 препаратов одновременно. Между всеми

этапами, заканчивающимися сушкой на воздухе, можно делать

перерыв до 24 ч.

1.2. Приготовление постоянных препаратов. Временные

давленые препараты можно сделать постоянными. Если в лаборатории

есть сухой лед или жидкий азот, препарат охлаждается под их

воздействием. Покровное стекло легко удаляется лезвием

безопасной бритвы. Материал, приклеившийся на предметном стекле,

подвергается обезвоживанию последовательным проведением через

96-градусный и бутиловый спирты и ксилол и заключается в

бальзам.

Предметные стекла с материалом обрабатываются спиртами и

ксилолом в цилиндрах с притертыми крышками.

При отсутствии сухого льда или жидкого азота можно

разъединить предметное и покровное стекла , после некоторого

подсушивания на воздухе с помощью лезвия безопасной бритвы,

подведенной под край покровного стекла. Поскольку при этом

материал остается частично на обоих стеклах, то обработке

подвергаются оба стекла. Для покровных стекол используются

бюксы маленьких объемов, и чтобы стекла в них не падали на дно,

готовятся подставки из тонкой стеклянной трубки, согнутой под

острым углом. Концы ее лежат на дне, а угол опирается на боковую

стенку бюкса. Расстояние между концами трубки не должно

превышать ширины покровного стекла (чтобы оно удерживалось на

подставке, не падая на дно). Такое приспособление предохраняет

приклеившийся материал от царапин и облегчает перенос стекол из

одного бюкса в другой. Для работы по обезвоживанию материала

необходимо иметь три цилиндра и три бюкса, по одному для каждого

спирта и ксилола. Поскольку в ходе приготовления препарата

клетки корешка пристают к обоим стеклам (предметному и

покровному) при заклейке бальзамом материал на предметном стекле

накрывают чистым покровным стеклом, а старое покровное стекло

приклеивают рядом. Иногда для того, чтобы оставить весь

материал только на покровном стекле, последнее предварительно

специально обрабатывают белком. Капля белка наносится на одну из

сторон покровного стекла и распределяется по нему очень ровно.

Стекло прогревается на спиртовке до высыхания белка. Затем такие

стекла используются в обычной процедуре приготовления давленых

препаратов. С предметного стекла они снимаются в сосуде с

абсолютным спиртом [37].

1.3. Методика подсчета хромосом в пыльцевом зерне.

Хромосомы в пыльцевом зерне удобнее считать во время первого

митоза. У различных растений митотические деления в пыльцевых

зернах наблюдаются в разное время суток, и это зависит прежде