Абрамова Л.И., Орлова И.Н. Цитологическая и цитоэмбриологическая техника
Подождите немного. Документ загружается.
уксусной кислоты) материал переносится в новую порцию такого же спирта, где он
и хранится.
Для сильно опушенных объектов может быть рекомендован фиксатор с
пикриновой кислотой (яд!).
Фиксатор Bouin Dubosc. Приготавливается 0,7%-ный раствор пикриновой
кислоты в 80-градусном спирте - 30 куб.см, формалин - 12 куб.см, уксусная
кислота ледяная - 3 куб.см. Фиксация продолжается от 6 ч до одних суток. Затем
материал промывают 80-градусным спиртом около 10 раз, до исчезновения
желтой окраски. Хранят его в 80-градусном спирте.
3.4.1. Заливка материала парафином. Последовательность обработки
материала спиртами следующая:
10-градусный спирт - не менее 6 ч
20-градусный спирт - не менее 6 ч
40-градусный спирт - не менее 6 ч
60-градусный спирт - не менее 6 ч
80-градусный спирт - не менее 6 ч
96-градусный спирт - не менее 6 ч
первая порция
96-градусный спирт - 12 ч.
вторая свежая порция
Примечание:
После водных фиксаторов проводку необходимо начинать с 10-градусного спирта.
После спиртовых фиксаторов - с 80-градусного спирта
Далее материал обрабатывают следующими смесями:
1) одна часть бензола + три части спирта 96-градусного + фенол
(1% от объема смеси);
2) две части бензола + две части спирта 96-градусного + фенол
(2% от объема смеси);
3) три части бензола + одна часть спирта 96-градусного + фенол
(2% от объема смеси).
В каждой смеси материал держат не менее 6 ч. Кристаллы фенола
разогревают в капельнице и жидкость каплями вливают в смесь. Фенол
используется как водоотнимающее средство.
Далее материал обрабатывается следующими смесями:
бензол 1 + фенол (1% от объема бензола) - 1 сут.;
бензол 2 - не менее 1 сут. до погружения материала на дно.
В этих смесях бензол 1 - первая порция реактива, а бензол 2 - свежая порция.
Затем расплавленный парафин наливается в бюкс с бензолом, в котором
находится материал (парафин наливается по внутренней стенке так, чтобы над
бензолом из него образовывалась как бы крышка).
Бюкс с парафиновым слоем над бензолом закрывают крышкой и оставляют на
сутки при комнатной температуре, затем ставят в термостат при +40 град. на
сутки, держат еще одни сутки бюкс с закрытой крышкой при +57 град. и одни сутки
при +57 град. с открытой крышкой до полного испарения бензола.
Затем материал с парафином выливают в бумажные или фарфоровые
формочки. Застывший парафин образует "пряники", в которых материал хранится
неограниченно долго. По мере необходимости отдельные пестики выплывают из
"пряника" и заключают в блоки, которые режут на микротоме обычным способом.
Толщина срезов варьирует от 12 до 16 мкм.
3.4.2. Окрашивание срезов на предметных стеклах железным
гематоксилином по Гейденгайну. Для окрашивания срезов этим способом
предметные стекла с наклеенными срезами опускают последовательно в
следующие реактивы: ксилол 1 - 15 мин; ксилол 2 - 15 мин (парафин должен
полностью раствориться в ксилоле); 96-градусным спиртом ополаскивают стекла
из капельницы; 96-градусный спирт - 15 мин; две смены дистиллированной воды
по 1-5 мин; 4%-ный раствор железных квасцов 3-12 ч(2% от объема смеси). две
смены дистиллированной воды по 1-5 мин; гематоксилин 12 ч; 2%-ный раствор
железных квасцов (дифференцировка срезов, во время которой вымывается
избыток красителя, при этом ход дифференцировки исследуется под
микроскопом); вода проточная - до 1 ч; два смены 96-градусного спирта по 25-20
мин; две смены бутилового спирта по 10-15 мин; две смены ксилола по 20-30 мин.
Затем заключают в канадский бальзам и заклеивают покровным стеклом.
В результате такой обработки проросшие пыльцевые зерна оказываются
бесцветными, непроросшие - с темно-розовой цитоплазмой, генеративная клетка
(или спермии) и вегетативная клетка видны только при достаточной
дифференцировке в квасцах. Темноокрашенные в бордовый цвет концы
пыльцевых трубок выделяются на фоне клеток столбика со светло-розовой
цитоплазмой.
3.4.3. Приготовление раствора железных квасцов. Без нагревания
растворяют 10 г светло-фиолетовых кристаллов железных квасцов в 100 куб.см
дистиллированной воды. Из этого раствора готовят 4 и 2%-ные растворы,
добавляя дистиллированную воду. Желтые выветрившиеся кристаллы не годятся
(синонимы железных квасцов: железоаммиачные квасцы, сернокислый окисно-
железный аммиак, ферриаммиачный сульфат).
3.4.4. Приготовление раствора гематоксилина. 0,5 г гематоксилина
растворяют в 10 куб.см 96-градусного спирта и разбавляют 90 кус.см
дистиллированной воды. Раствор должен 4-5 недель "созревать" при доступе
воздуха. Перед употреблением его разбавляют равным количеством
дистиллированной воды. Использованный раствор можно профильтровать и
употребить повторно. Со временем он становится даже лучше.
3.5. Исследование роста пыльцевых трубок в пестике при наблюдении в
ультрафиолетовом свете . В последнее время при исследовании характера
прорастания пыльцевых трубок в тканях пестика широкое применение нашел
метод люминесцентной микроскопии. Этот метод сочетает в себе быстроту
приготовления препарата с простотой исследования. С помощью люминесцентной
микроскопии в довольно короткие сроки как на свежем, так и на
фиксированном материале можно проследить за особенностями прорастания
пыльцевых трубок и возможными нарушениями их роста в случаях
несовместимости при скрещиваниях или самонесовместимости (булавовидные
вздутия пыльцевых трубок, их ветвление, поворот в обратную сторону и т.п.).
Метод основан на специфической способности флуорохрома анилинового
синего соединяться с каллозой, которая входит в оболочки пыльцевых трубок и
образует каллозные пробки.
Необходимо учитывать, что разные виды растений могут требовать некоторых
изменений условий обработки и определения оптимального варианта для данного
вида. Ниже даются методики исследования роста пыльцевых трубок в пестике,
апробированные в отделе цитологии и анатомии.
Препараты надо наблюдать сразу после изготовления. Исследование
проводится с помощью люминесцентных микроскопов МУФ-2, МУФ-3, с лампами
ДРШ-250 или СВД-120А, фильтрами УФС-3 или УФС-6, пропускающими УФ-лучи в
области 365 нм. Можно также использовать осветитель ОИ-18 с любым
микроскопом (фильтры те же).
Пыльцевые трубки флуоресцируют желтовато-зеленым цветом на темном
фоне. Если препарат сделан достаточно хорошо, удается проследить рост
пыльцевых трубок до семяпочки.
3.5.1. Приготовление препаратов пыльцевых трубок злаков в столбике
после окрашивания флуорохромом и наблюдение их люминесценции в
ультрафиолетовом свете [7]. Свежесобранные или фиксированные пестики
слабо нагревают в лактофеноле на предметном стекле, затем несколько раз
рыльца промывают дистиллированной водой (лактофенол и вода оттягиваются
фильтровальной бумагой). После оттягивания фильтровальной бумагой
последней порции воды на пестик пипеткой накапывают раствор анилинового
синего и накрывают покровным стеклом.
Для приготовления раствора флуорохрома используется только
водорастворимый анилиновый синий. Сначала готовится 0,05 М раствор К2НРО4,
в котором и растворяется анилиновый синий (0,1%). Первоначально раствор
красителя имеет густой синий цвет. Для его подщелачивания (увеличения рН от 9
до 12) необходимо осторожно по каплям добавлять однонормальный раствор
едкого кали или аммиака до получения светло-зеленого раствора.
Наблюдение рылец и столбиков под микроскопом может проводиться либо в
растворе красителя, либо в 50%-ном растворе глицерина в воде (1:1).
Ниже приводится несколько модификаций оптимальных вариантов
приготовления препаратов для конкретных видов растений, разработанных в
нашем отделе.
3.5.2. Приготовление препаратов пыльцевых трубок в пестиках
томатов. (Модификация метода проведена М.А.Вишняковой).
Свежесобранные или отмытые от фиксирующей жидкости пестики (через 6,12 и 24
ч после отмывания) разрезают лезвием вдоль, стараясь получить минимальную
толщину среза (0,5-1 мм). Если пестики достаточно тонкие, столбики оставляют
неповрежденными, срезая только выступающие участки завязи, чтобы столбик и
срез завязи лежали в одной плоскости. Затем срезы мацерируют в 10%-ном
спиртовом растворе едкого кали в течение 20-30 мин. После промывки в воде
пестики оставляют в растворе водно-растворимого анилинового синего на
несколько часов. Из красителя пестики переносят на предметное стекло в каплю
глицерина, смешанного с водой (1:1), накрывают покровным стеклом и слегка
раздавливают. При излишне сильном надавливании может произойти смещение
тканей пестика и разрыв пыльцевых трубок.
Получение минимальной толщины среза или слоя раздавленной ткани очень
важно, так как часто причина неудач кроется именно в недостаточном
расплющивании пестика.
3.5.3. Приготовление препаратов пыльцевых трубок в пестиках
яблони. (Модификация метода и составление раздела проведены
Л.В.Голышкиным). Материал фиксируют в фиксаторе Карнуа (3:1) через четыре
и более дней после опыления в течение 3-6 ч. Отмытые от фиксирующей
жидкости цветки и бутоны хранят в 70-градусном спирте. После двукратной
промывки в дистиллированной воде пестики подвергают мацерации. Ткани
плодово-ягодных древесных растений характеризуются очень большой
плотностью и мелкоклеточностью, поэтому главное в приготовлении давленого
препарата добиться достаточной мацерации тканей столбика.
Мацерирование проводится в насыщенном 6 н. растворе едкого кали в течение
2 мин в тигле при нагревании над пламенем спиртовки. Охлаждают материал в
том же растворе 7-8 мин. После трехкратной промывки в дистиллированной воде
в течение 5 мин пестик помещают в каплю флуорохрома на тонкое предметное
стекло. Раздавливание производят другим предметным стеклом.
Следует отметить, что мацерация кислотами не желательна, так как при этом
требуется более тщательная промывка материала перед окраской, чтобы
выдержать рН в допустимых пределах действия флуорохрома. Щелочи же
способствуют хорошей работе анилинового синего.
3.5.4. Приготовление препаратов пыльцевых трубок в пестиках
малины. (Модификация метода проведена О.В.Мочаловой и
Л.В.Голышкиным, текст составлен О.В.Мочаловой). Отмытые от
фиксирующей жидкости столбики с завязями отделяются от цветоложа и
помещаются в фарфоровый тигель с насыщенным раствором едкого натра.
Мацерация тканей производится осторожным кипячением тигля над пламенем
спиртовки в течение 10 мин, затем материал промывается в трех сменах
дистиллированной воды в течение 3-5 мин на предметном стекле с лункой.
Пестики помещаются в каплю флуорохрома на тонкое предметное стекло.
Раздавливание тканей производится другим тонким предметным стеклом, при
этом постукивают тупым концом карандаша по столбикам. Желательно избегать
сильного раздваливания завязи, т.к. при этом повреждается структура семяпочки.
Суммарное время приготовления одного препарата составляет примерно 20
мин.
Реактив для способов приготовления препаратов, описанных в параграфах
3.5.2 - 3.5.4, готовят следующим образом. В 0,15 М растворе К2НРО4 разводят
анилиновый синий в концентрации 0,005%. Оптимальные значения рН для
работы с анилиновым синим в УФ-свете - 8-9 для исследования живого материала
и 10 - для фиксированного. Поэтому для доведения раствора до нужного значения
рН его подщелачивают, добавляя по каплям раствор
аммиака.
При окрашивании живого материала в раствор анилинового синего добавляют
каплю 0,2 М раствора сахарозы.
Реактивность флуорохрома следует проверять на контрольном материале,
которым могут служить каллозные оболочки тетрад злаков или других растений.
3.6. Исследование живой пыльцы злаков. В каплю 5-10%-ного раствора
сахарозы в воде на предметном стекле помещают пыльник, который разрезают
лезвием безопасной бритвы на две половинки. Из каждой половинки содержимое
пыльника выдавливают в раствор. Стенки гнезд пыльника оставляют в капле
раствора, чтобы избежать раздавливания пыльцевых зерен. Каплю раствора с
содержащейся в ней пыльцой накрывают покровным стеклом. Препарат
исследуют под микроскопом. При увеличении объектива х40, окуляра х10 в
пыльцевом зерне хорошо видны ядра с ядрышками, вакуоли и некоторые
органеллы цитоплазмы. В растворе сахарозы можно наблюдать стадии развития
пыльцы, начиная от тетрад микроспор, и весь процесс вакуолизации одноядерного
пыльцевого зерна, первый митоз, генеративную клетку и вегетативное ядро.
Дальнейшие фазы развития пыльцевых зерен (до и после второго митоза) на
живом материале наблюдать невозможно, т.к. интенсивное накопление крахмала
делает протопласт пыльцевого зерна непрозрачным.
В тетрадах микроспор, рассматриваемых в растворе сахарозы, легко
наблюдаются каллозные оболочки и каллозные гребни.
3.7. Выявление каллозы анилиновым синим с последующим
наблюдением под флуоресцентным микроскопом [1]. Применительно к
злакам этот способ окрашивания модифицирован И.Д.Романовым. Им подобрана
оптимальная для пыльцы злаков концентрация флуорохрома.
Для исследования могут быть использованы свежие и фиксированные
пыльники.
Готовится 0,0025%-ный раствор водорастворимого анилинового синего в 0,15 М
растворе К2НРО4 (рН=8,2). Содержимое пыльника выдавливается иглой в каплю
раствора на предметном стекле. Стенки пыльника удаляют. Объект накрывают
покровным стеклом.
Анилиновый синий низкой концентрации и при среднефизиологическом
значении рН является витальным красителем. Для того, чтобы проводить
наблюдения продолжительное время и пыльцевое зерно при этом оставалось
живым, в каплю раствора с флуорохромом добавляют каплю 5-10%-ного раствора
сахарозы.
Наблюдение ведется под флуоресцентным микроскопом, либо к обычному
микроскопу приставляется люминесцентный осветитель ОИ-18. При наблюдении
рекомендуется пользоваться фильтром УФС-6, пропускающим ультрафиолетовые
лучи 365 мк. Анилиновый синий окрашивает каллозу и дает желтовато-зеленую
флуоресценцию.
3.8. Выявление каллозы микроспороцитов и тетрад в 5-10%-ном растворе
сахарозы. Благодаря тому, что показатель преломления у каллозы несколько
иной, чем у раствора сахарозы, каллозную оболочку микроспороцитов и тетрад
можно наблюдать в световой микроскоп. Каллозная оболочка микроспороцитов и
тетрад микроспор бесцветна и гомогенна.
Пыльники кукурузы помещаются в каплю раствора сахарозы и предметном
стекле. Верхушку пыльника отрезают лезвием бритвы и выдавливают тонкой
иглой его содержимое. Накрывают покровным стеклом. Остатки стенки пыльника
лучше оставить под покровным стеклом, чтобы предотвратить раздавливание
микроспороцитов и тетрад.
3.9. Просветление пыльников злаков для исследования расположения
пыльцевых зерен в гнездах. Пыльники, собранные в момент цветения
(содержащие зрелую пыльцу), фиксированные или свежие, разрезаются по
связнику на две теки под бинокулярным микроскопом МБС-1. Половинки
пыльников помещают в 5-10%-ный раствор КОН в воде или 5-10%-ный раствор
КОН в 70-градусном спирте (последний обеспечивает более быстрое
просветление).
После просветления половинки пыльников помещают в глицерин,
разбавленный водой в отношении 1:1, лактофенол или 50:-ный раствор молочной
кислоты. В этих растворах материал находится и во время микроскопического
исследования.
Благодаря тому, что щелочь, используемая для просветления, разрушает
протопласт клеток стенки пыльника, последняя становится оптически прозрачной
и через нее можно наблюдать слой пыльцевых зерен, выстилающий пыльцевое
гнездо изнутри. Пыльцевые зерна злаков прикреплены к тапетуму и при
правильном приготовлении препарата слой их не разрушается, пыльцевые зерна
лежат на месте образования.
Чтобы приготовить раствор лактофенола, смешивают 20 г химически чистой
кристаллической карболовой кислоты, 20 г молочной кислоты, 10 г глицерина и 20
г дистиллированной воды. Смесь сохраняют в склянке из темного стекла.
3.10. Окраска экзины пыльцы для изучения расположения пор и борозд.
Пыльники растений (живой или гербарный материал) разрезают на предметном
стекле, пыльцу из них извлекают при помощи иглы. Стенки пыльника
выбрасывают. На пыльцу наносят каплю ксилола, который растворяет жир. Ксилол
с предметного стекла испаряется. Всю пыльцу на предметном стекле собирают
вместе при помощи иглы и на пыльцу капают спиртовой раствор
основного фуксина. Степень окрашивания контролируется под микроскопом.
После полного испарения спирта на пыльцу наносят каплю расплавленной
глицерин-желатины и накрывают подогретым покровным стеклом. Если окажется,
что экзина переокрасилась, то перед нанесением глицерин-желатины пыльцу
необходимо дифференцировать насыщенным раствором питьевой соды (NaHCO
3
)
в воде.
В результате такой обработки общий тон окраски экзины получается ярко-
розовым, борозды и поры не окрашены или окрашены значительно слабее экзины.
3.11. Окраска пыльцевых зерен кукурузы и пшеницы для наблюдения
митозов и спермиев. В живом состоянии пыльцевые зерна кукурузы и пшеницы
могут наблюдаться только до периода формирования генеративной и
вегетативной клеток, до момента образования крахмала в пыльцевом зерне. Для
изучения последующих этапов развития исследуются фиксированные пыльцевые
зерна.
Окраска митотических хромосом пыльцевых зерен кукурузы ацетокармином не
удается. Хорошие результаты получают при окраске пыльцы кукурузы в реактиве
Шиффа. Пыльники в течение 1-3 часов фиксируют в смеси 70-градусного спирта и
ледяной уксусной кислоты (1:1), их хранят 70-градусном спирте. Перед
окрашиванием их помещают в 1 н. соляную кислоту на 1-2 мин, затем переносят в
50%-ную соляную кислоту для гидролиза на 20 мин и промывают водопроводной
водой 1-2 мин. Затем их помещают в реактив Шиффа на 15 мин, вновь промывают
водопроводной водой в течение 1 мин, далее в течение 1 мин промывают в 2%-
ном растворе биосульфита натрия или калия, куда добавляется 20 мл 1 н.
соляной кислоты. после окрашивания пыльник помещают на
предметное стекло в каплю ацетокармина и в ней нагревают (до кипения не
доводить).
Пыльцевые зерна выдавливают из пыльника препаровальной иглой и
оставляют под покровным стеклом в капле ацетокармина на несколько часов.
Пыльники пшеницы после обработки реактивом Шиффа и промывки (без
обработки ацетокармином) следует поместить в каплю глицерина, тонкой иглой
освободить пыльцевые зерна из пыльников, накрыть покровным стеклом. Для
наблюдения второго митоза пыльцу пшеницы достаточно окрашивать только
ацетокармином.
Препараты с пыльцой пшеницы и кукурузы исследуют под микроскопом при
увеличении 40 х 10, 60 х 10, 90 х 10. Хромосомы на разных стадиях митоза и
спермии окрашиваются в красный цвет, цитоплазма пыльцевого зерна
ацетокармином окрашивается слабо.
3.12. Выявление крахмала в пыльцевых зернах злаков [2]. В фертильной
пыльце накопление крахмала заканчивается незадолго до выбрасывания
пыльников. В пыльцевых зернах, не достигших зрелости, крахмал обычно
находится в небольших количествах. В пыльцевых зернах кукурузы при
цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) образуется значительно
меньше крахмала, чем в фертильной пыльце. Содержание крахмала в стерильной
пыльце никогда не достигает нормы, поэтому степень окрашиваемости
протопласта пыльцы растворами, содержащими йод, может служить способом
идентификации стерильной пыльцы. Для этого используют хлоралгидрат с йодом
(5 г его растворяется в 2 мл воды, затем в раствор до насыщения добавляют
кристаллический йод) или йодистый калий с металлическим йодом (в 100 мл воды
растворяют 3 г йодистого калия, затем 0,2 г кристаллического йода).
Можно использовать свежие и фиксированные пыльники. В каплю раствора,
содержащего йод, помещают пыльник, из которого пыльцу извлекают иглой. Через
несколько минут крахмал окрасится в цвета от синего до черного.
Фертильные пыльцевые зерна принимают густой сиренево-черный цвет. В
стерильных пыльцевых зернах крахмала оказывается меньше нормы или только
следы его. Стерильная пыльца окрашивается в синий (иногда бурый) цвет.
Пыльцевые зерна, не содержащие крахмал, бесцветны.
В селекционной работе нередко появляется необходимость проводить
подсчеты количества фертильной и стерильной пыльцы в пыльнике. Растворы
йодхлоралгидрата и йодного калия быстро испаряются, поэтому заключать в них
пыльники для подсчета стерильной и фертильной пыльцы не рекомендуется.
Лучше заключать окрашенные пыльцевые зерна в агар, благодаря которому
пыльцевые зерна под покровным стеклом закрепляются неподвижно.
3.13. Окраска пыльцы кукурузы для подсчета фертильных и стерильных
пыльцевых зерен [6]. 1 г агара растворяют в 50 мл дистиллированной воды и
кипятят 3 мин. К раствору добавляют 6 мл йода в йодистом калии (0,3 г J и 1 г KJ в
100 мл воды). Добавляют 14 мл 1 н. соляной кислоты. Раствор следует хорошо
перемешать и остудить. Горячий раствор переливают в небольшую колбу, из
которой его удобно брать стеклянной палочкой. Перед приготовлением препарата
раствор разогревают на водяной бане.
Пыльцу из пыльника помещают на предметное стекло, на нее наносят каплю
разогретого раствора. Пыльцу следует равномерно распределить в капле, после
чего все закрыть покровным стеклом.
3.14. Проращивание пыльцы томатов на искусственной питательной
среде. Чашку Петри изнутри обкладывают влажной фильтровальной бумагой. На
дно на подставки (спички) кладут чистые предметные стекла. На них наносят 2-3
капли 10%-ного раствора сахарозы с добавлением бора (0,001%). Производят
посев свежесобранной пыльцы. Наблюдение проводят через 4-6 ч под
микроскопом без покровного стекла. Проросшие пыльцевые зерна считают
жизнеспособными, непроросшие - стерильными.
3.15. Изучение митотического деления генеративной клетки в пыльцевых
трубках томатов. На искусственной питательной среде, описанной в
предыдущем разделе, проращивают пыльцу, высеянную в капле среды в большом
количестве. После образования пыльцевых трубок на поверхности капли
невооруженным глазом можно рассмотреть белые, напоминающие плесень пятна.
Пятна представляют собой переплетения пыльцевых трубок. Образования не
разрушаются, если их пинцетом осторожно переносить из одного раствора в
другой. Если растворы фиксаторов, красителей, а также сред для обезвоживания
и заключения в бальзам разлить в чашки Петри, то, перенося из одной чашки
Петри в другую скопления пыльцевых трубок, можно получить постоянные
препараты пыльцевых трубок. Рекомендуется окраска хромосом по Фельгену с
холодным гидролизом, а также ацетокармином без подогрева.
3.16. Исследование мейоза в пыльниках кукурузы, пшеницы. Пыльники,
мейоциты которых находятся на разных фазах мейоза, фиксируют в смеси спирта
с ледяной уксусной кислотой (3:1) в течение часа, промывают 70-градусным
спиртом до исчезновения запаха уксусной кислоты. В таком спирте пыльники
могут сохраняться несколько месяцев.
Окрашивание а ацетокармине. Процедура аналогична окрашиванию
пыльцевых трубок. После обработки красителем пыльник переносят на чистое
предметное стекло в каплю свежего ацетокармина, накрывают покровным стеклом
и раздавливают.
Окрашивание в реактиве Шиффа. Пыльники переносят из 70-градусного
спирта в 50%-ную соляную кислоту на 20 мин для "холодного" гидролиза, затем
помещают в реактив Шиффа на 2 ч (пыльники окрашиваются в фиолетовый цвет),
кладут на предметное стекло и промывают 2-3 раза уксусной кислотой (раствор
оттягивается фильтровальной бумагой). В капле уксусной кислоты пыльник
накрывают покровным стеклом и раздавливают. Препарат исследуется под
микроскопом при увеличении 60 х 15 и 90 х 15.
3.17. Рекомендуемая литература
1. Дженсен У. Ботаническая гистохимия. М., 1965.
2. Орел Л.И. Цитология мужской цитоплазматической стерильности
кукурузы и других культурных растений. Л., 1972.
3. Поддубная-Арнольди В.А. Стешина Н., Сосновец А. Материал к
биологии цветения и размножения Scorzoonera tau-Saghys et
Bosse – Бот. журн., 1934, т.19, № 4.
4. Ромейс Б. Микроскопическая техника. М., 1954.
5. Chandra D.P., N.Anita, Staining pollen tubes in the style,
cotton blue versus carmine for general use. - Stain technol.,
1967, v.42, N 2, р.81-85.
6. Kowles K.V. A stain for pollen sterility determination. -
Maize genetics cooperation, 1971, N 45, p.132.
7. Laloutte J.A. Growth of grass pollen tubes exibited by
callose fluorochrome reaction. - Grana palynolog., 1967, v.7,
N 2-3, p.601-603.
8. Watkins A.E. Gtinetic and cytological studies in wheat. -
Journ.of Genet., 1942; v.15, N 3.
4. УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ТОТАЛЬНЫХ
ПРЕПАРАТОВ ЗАРОДЫШЕВЫХ МЕШКОВ
Наряду с микротомным методом приготовления препаратов для
исследования женского гаметофита растений в последнее время
часто используются ускоренные методы [1-5]. Наиболее
употребительны из них - препарирование семяпочек с мацерацией
[1, 4, 5] и без мацерации тканей семяпочки [2, 3]. Использование
того или иного метода связано с особенностями используемого
материала.
Преимущества указанных методов перед микротомными срезами
зародышевых мешков, на наш взгляд, не столько в ускорении
процесса приготовления препаратов, сколько в качестве препарата
(сохраняется целостность исследуемого объекта). С помощью этих
методов получают тотальные препараты зародышевых мешков.
Наблюдая целые зародышевые мешки, мы имеем возможность изучить
не только истинную форму, величину и взаимное расположение
элементов зародышевого мешка, но и динамику изменения их
взаимного расположения в процессе роста и развития. Вычлененные
из семяпочек зародышевые мешки лишены артефактов, связанных с
процедурой парафинирования фиксированного материала. Кроме того,
пользуясь тотальным препаратом, в случае необходимости можно
изменить положение объекта для наблюдения его в более удобном
положении.
Здесь мы приводим несколько наиболее известных методик
вычленения зародышевых мешков и приготовления их тотальных
препаратов с мацерацией и без мацерации тканей семяпочки.
4.1. Методики, включающие мацерацию тканей семяпочки. Эти
методики основаны на разрушении оболочек клеток тканей семяпочек
комплексом ферментов пищеварительных желез виноградной улитки,
условно называемым "цитазой", химически-чистыми целлюлазой,
пектиназой, а также другими способами.
Мацерация тканей семяпочек применяется в исследовании видов
с мелкими, так и с крупными семяпочками. Если работают с
завязями, содержащими большое количество сравнительно мелких
семяпочек (например, виды Solanaceae, Paraveraceae и др.),
целесообразно мацерировать ткани семяпочек и приготавливать
суспензию, состоящую из соматических клеток семяпочек и
зародышевых мешков. Из суспензии выделяется с помощью
центрифугирования наиболее тяжелая ее фракция, содержащая
зародышевые мешки.
Этот метод разработан на кафедре генетики и цитологии
Саратовского государственного университета и с успехом
применяется в других лабораториях.
Методика С.С.Хохлова, М.И.Зайцевой и П.Г.Куприянова [5].
Зафиксированные ацетоалкоголем (1:3) завязи помещают в
насыщенный раствор двууглекислого натрия, затем ополаскивают
дистиллированной водой. Препаровальной иглой семяпочки отделяют
от плаценты под лупой и помещают в небольшие пробирки с
цитазой. Объем пробирки должен превышать объем семяпочек не
менее чем в два раза. Пробирки, плотно закрытые резиновыми
пробками, помещают в штатив, закрепленный на оси электромотора.
Вращение пробирок происходит так, что жидкость с материалом
перетекает вдоль пробирки. Оптимальное число оборотов
электромотора 10-20 в минуту. Мацерация тканей семяпочек
наступает через 24 ч. Цитаза удаляется после трехминутного
центрифугирования (5000 об/мин). Материал промывают, встряхивая
осадок в дистиллированной воде и снова центрифугируют. В тех же
пробирках суспензию клеток протравливают квасцами в течение трех
минут, споласкивают дистиллированной водой и окрашивают в
ацетокармине. Каждая операция сопровождается центрифугированием
и удалением надосадочной жидкости. Время окрашивания в
ацетокармине устанавливается эмпирически. Окрасив материал,
добавляют в пробирку с материалом несколько капель ледяной
уксусной кислоты и глицерина(1:1). Суспензию материала в смеси
ледяной уксусной кислоты и глицерина наносят пипеткой на
предметное стекло и накрывают покровным. Среди клеток,
расположенных в один слой, встречаются зародышевые мешки.
По методике, предложенной М.П.Солнцевой и В.П.Левковским
[4], после ферментативной мацерации проводится препарирование
каждой семяпочки в отдельности. Эта методика пригодна для видов
со сравнительно крупными семяпочками, например, для злаков.
Материал (метелки диких злаков) фиксируют по Чемберлену
(ФУС, FAA). Фиксатор Чемберлена состоит из 90 частей 50-
градусного этилового спирта, пяти частей формалина (продажного)
и пяти частей ледяной уксусной кислоты.