Абрамова Л.И., Орлова И.Н. Цитологическая и цитоэмбриологическая техника
Подождите немного. Документ загружается.
Материал может находиться в фиксаторе 1-3 месяца, или после
фиксации его переводят в 70-градусный этиловый спирт.
Окрашивание материала (по Фельгену) предшествует ферментативной
обработке. Зафиксированные колоски или цветки злаков промывают
дистиллированной водой 4-5 ч. Гидролиз проводят в три этапа: в 1
н. HCl - 1,5 ч, в 5 н. HCl - 1,5 ч, в 1 н. HCl - 1 ч. В реактиве
Шиффа материал выдерживают в холодильнике 16-17 ч. После
окрашивания промывают в трех порциях сернистой воды по 30 мин в
каждой порции. Затем промывают водопроводной водой в течение 3 ч
и подкрашивают цитоплазму клеток гематоксилином Эрлиха (1,5 ч).
Далее следует промывка дистиллированной водой 1-2 ч.
Завязи вынимают из колосковых и цветочных чешуй и помещают
в цитазу, где оставляют их на ночь (17-18 ч) при комнатной
температуре. Зародышевые мешки вычленяют, освобождая их острыми
препаровальными иглами от покровов семяпочек.
Данная методика позволяет приготовить постоянные тотальные
препараты зародышевых мешков. Для этого вычлененные зародышевые
мешки переносят при помощи капилляра на влажную фильтровальную
бумагу, находящуюся на предметном стекле. Обезвоживание
зародышевых мешков проводят в спиртах возрастающей концентрации:
50-градусный, 70, 96 и 100-градусный. Капля спирта наносится на
зародышевый мешок и затем оттягивается фильтровальной бумагой.
Таким же образом материал переводится в ксилол. В каждой из этих
жидкостей зародышевые мешки выдерживают по 10 мин.
Далее зародышевые мешки собирают с фильтровальной бумаги
тупой препаровальной иглой с каплей густого канадского бальзама
на конце и переносят на чистое предметное стекло с новой каплей
канадского бальзама обычной консистенции. Материал накрывают
покровным стеклом. Препарат сушат в термостате не менее суток.
Для мацерации тканей семяпочки можно использовать и другие
приемы. Так, П.Г.Куприянов [5] предлагает применять для
мацерации ряд процедур, включающий нагревание материала в 4%-ном
растворе железо-аммонийных квасцов до 70 град.С, выдерживание
при этой температуре в течение 15 мин, промывку материала в двух
порциях дистиллированной воды при той же температуре, обработку
в 75%-ном растворе (от продажной) соляной кислоты в течение
часа, промывку в нескольких порциях дистиллированной воды при
комнатной температуре в течение 5 ч.
4.2. Методы вычленения зародышевых мешков без мацерации
тканей семяпочки. Способ извлечения эндоспермальной пленки
нескольких видов лилейных и пшеницы использовала Т.Ф.Петрова
[2], отметив, что извлечение удается лучше, если материал
фиксируется жидкостями, содержащими формалин.
Однако Беннет, Смит и Барклай [7], исследуя зародышевые
мешки культурных злаков (пшеница, рожь, ячмень, тритикале),
вычленяли их после фиксации материала ацетоалкоголем (1:3).
Авторы отметили, что лишь некоторые зародышевые мешки удавалось
извлечь целыми. Они окрашивали семяпочки по Фельгену, оставляя
материал в реактиве Шиффа в течение 2 ч (с предварительным
горячим гидролизом в течение 12 мин), препарировали семяпочки
под лупой, затем подкрашивали зародышевые мешки уксусным или
спиртовым кармином. Наблюдения вели на временных препаратах.
Учитывая опыт предыдущих исследователей, мы разработали
следующие методы приготовления препаратов зародышевых мешков
культурных злаков (пшеницы, ржи, тритикале).
I. Колосья фиксируются по Чемберлену и оставляются в
фиксирующей жидкости на 1-3 сут. Затем материал переводится в
70-градусный этиловый спирт. Перед окрашиванием по Фельгену
завязи освобождаются из цветков и промываются в дистиллированной
воде 17-18 ч (в течение ночи). Для гидролиза материал оставляют
в 1 н. HCl на 1,5 ч, в 5 н. HCl 2 ч и снова в 1 н. HCl - 1 ч. В
реактиве Шиффа завязи оставляют на 17-18 ч в холодильнике.
Вычленение проводят в капле глицерина с водой (1:1) с помощью
микроскопа МБС-1 при нижнем освещении объекта и увеличении 12,5
х 2. Для этого очень тонкими препаровальными иглами, заточенными
химическим способом (см. раздел 4.3 и [6]), раздвигают вначале
ткани стенок завязи, а затем и ткани семяпочки от вентральной
стороны и удаляют их. Зародышевый мешок заметен на фоне
окрашенных соматических клеток благодаря интенсивной окраске
антиподального комплекса. Вычлененный зародышевый мешок
подкрашивают в ацетокармине, предварительно убрав с предметного
стекла глицерин фильтровальной бумагой, насколько это возможно
сделать, не задев зародышевый мешок. Зародышевый мешок оставляют
в капле ацетокармина 2-3 мин, удаляют ацетокармин фильтровальной
бумагой и наносят на зародышевый мешок каплю раствора Гойера
[8], который частично дифференцирует препарат, просветляет его и
является хорошей заливочной средой (рецепт раствора Гойера см.
ниже). Такой препарат может храниться несколько месяцев.
II. Материал, зафиксированный по Чемберлену, хранят в
фиксаторе или 70-градусном этиловом спирте. Вычленяют
зародышевые мешки до окрашивания завязей в капле фиксирующей
жидкости или спирте. Вычлененные зародышевые мешки окрашивают
пропионовым гематоксилином по Хендерсону и Лу [9], используя
первый из четырех предложенных авторами способов, т.е.
окрашивая смесью растворов гематоксилина и железоаммиачных
квасцов (см.1.1.5.2.4). Окрашивание происходит очень быстро.
При перекрашивании применяют дифференциацию материала 0,5%-ным
раствором железоаммиачных квасцов в 50%-ной пропионовой кислоте.
Добившись хорошего окрашивания, закапывают зародышевый мешок
раствором Гойера или эупаралем, предварительно оттянув
фильтровальной бумагой предшествующие растворы.
Раствор Гойера готовится следующим способом: подогревают 10
куб.см дистиллированной воды (до кипения не доводить), в ней
растворяют: 6 г химически чистого гуммиарабика, 3,2 г глицерина
и 40 г хлоралгидрата. Среда сразу же готова к употреблению [8].
С помощью разработанной нами методики удается вычленять
зародышевые мешки культурных злаков, начиная с двухъядерной
стадии (длина такого зародышевого мешка 0,07 мм) до 7 суток
после оплодотворения. Зародышевые мешки практически всех фаз
развития удается вычленить целыми, но в некоторых случаях
теряются несколько антипод.
Трудность применения второго способа состоит в вычленении
неокрашенных зародышевых мешков. Однако, получив определенный
навык, работающий обычно быстро овладевает методом приготовления
постоянных препаратов зародышевых мешков.
4.3. Способ химической заточки препаровальных игл. Принимая
за основу способ, описанный Ярошевской [6], мы рекомендуем:
прежде, чем приступить к заточке, заменить толстые иглы в
лабораторных препаровальных иглах самыми тонкими швейными
иглами. Для этого конец пластмассового держателя нагревается над
спиртовкой, и из него вынимается толстая и сразу вставляется
тонкая игла. Нагретая пластмасса обжимается пинцетом, а затем
пальцами.
Для химической заточки в короткую пробирку, закрепленную в
штативе над спиртовкой, наливают 3-5 мл концентрированной
азотной кислоты и нагревают ее до кипения. Работу проводят в
вытяжном шкафу. Зажав держатель иглы длинным пинцетом, опускают
острие иглы 50-70 раз в кипящую азотную кислоту, не дотрагиваясь
кончиком до дна пробирки. Поверхность иглы покрывается слоем
окислов черного цвета. Их удаляют, опуская иглу 2-3 раза в
пробирку с концентрированной соляной кислотой. Поверхность иглы
становится блестящей и гладкой. Кончики приготовленных таким
образом игл в несколько раз тоньше концов швейных игл, что
необходимо при таких манипуляциях, как вычленение зародышевых
мешков.
4.2. Рекомендуемая литература
1. Еналиева Н.Х., Тырнов В.С., Хохлов С.С. Выделение зародышевых мешков
покрытосеменных растений путем мацерации тканей. – Цитология и генетика, 1972, т.
6, № 5.
2. Петрова Т.Ф. Метод приготовления тотальных эмбриологический препаратов
эндосперма. Бот. журн., 1970, т.55, № 11.
3. Поддубная-Арнольди В.А. Исследование процесса оплодотворения у некоторых
покрытосеменных растений на живом метериале. – Бот. журн., 1958, т.43, № 2.
4. Солнцева М.П., Левковский В.П. Ускоренное изготовление постоянных препаратов
зародышевых мешков и пыльцевых комплексов растений. - Цитология и генетика,
1978, т. 12, № 6.
5. Хохлов С.С., Зайцева М.И., Куприянов П.Г. Ускоренные методы исследования
зародышевого мешка. – В кн.: Выявление апомиктичных форм во флоре цветковых
растений СССР, Саратов, 1978.
6. Ярошевская А.С. Исследования онтогенеза злаков с помошью сканирующего
электронного микроскопа. – Вестн. МГУ, Биол., 1978, № 1.
7. Bennet M.D., Smith J.B., Barclay I. Early seed development in the Triticeae. – Phil. trans. R.
Soc. Lond. B. Biol. sci., 1975, v.272, N 916, p. 199.
8. Freytag A.H. The use of ethanol to improve aceto-carmine staining of orchid chromosomes.
–
Stain Technol., v. 38, N 5, p. 290-292.
9. Henderson S.A., Lu B.C. The use of hematoxylin for aquash, preparation of chromosomes. –
Stain Technol., 1968, v. 43, N 4, p. 233-236.
5. МЕТОДИКА ИЗУЧЕНИЯ ЗАРОДЫШЕЙ И ЭНДОСПЕРМА В СЕМЕНАХ
МОРКОВИ
Изучать внутреннее строение семян моркови можно различными
способами в зависимости от целей и возможностей исследователя.
5.1. Исследование на постоянных резаных препаратах.
Приготовление постоянных препаратов включает в себя фиксацию
материала, заливку в парафин, резку, окрашивание и заключение в
бальзам (см.разд. 3.4.1.0. Хорошие результаты дает фиксация
(см.разд.1.1.4. и 2.1.1.) семян в смесях Карнуа (3:1) и
Ньюкомера (6:3:1:1:1). Проводка зафиксированного материала,
хранящегося в 70-градусном спирте и последующее заключение его в
парафин осуществляется по общепринятой эмбриологической
методике. Толщину микротомных срезом регулируют в зависимости от
целей исследования и состояния материала (10-18 мкм). Для того,
чтобы зародышевый мешок целиком попал в срез, необходима толщина
среза 14-18 мкм. Многоклеточные зародыши лучше изучать на более
тонких срезах (10-12 мкм). Срезы окрашивают гематоксилином по
Эрлиху. Для этого, после промывки в спирте, стекла со срезами
помещают в раствор гематоксилина на 2-3 мин, а затем
споласкивают их в дистиллированной воде. Затем материал
дифференцируют 2%-ной уксусной кислотой и промывают в проточной
воде в течение 1 ч.
При использовании гематоксилина Эрлиха ядра окрашиваются в
интенсивный сине-фиолетовый цвет, цитоплазма - в синий цвет.
Хорошие результаты получаются при подкраске оболочек альциановым
синим. Для этого после промывки в дистиллированной воде
окрашенных гематоксилином срезов их помещают на 1-2 мин в
раствор альцианового синего. В этом случае необходимость в
дифференцировке отпадает, так как раствор альцианового синего,
содержащий уксусную кислоту, одновременно ослабляет окраску
гематоксилином. В результате комбинированной окраски ядра клеток
приобретают фиолетовый цвет, клеточные стенки - интенсивный
голубой, а цитоплазма клеток (яйцеклетка, клетки эндосперма) -
розово-сиреневый. Окрашенные препараты доводят до ксилола и
заключают в бальзам по общепринятой методике.
Описанный способ позволяет изучать степень сформированности
зародыша и эндосперма в семенах моркови.
5.2. Исследование разрезанных семян моркови. Параллельно с
микротомными постоянными препаратами можно приготавливать
временные препараты из разрезанных частей семян. Этот способ
удобно применять, когда есть необходимость быстро определить
размеры зародыша, эндосперма и толщину покровов зрелых или
близких к стадии зрелости семян.
Перед препарированием семена предварительно замачивают в
воде в течение 2 ч для размягчения. Можно выдерживать семена в
70-градусном спирте. Второй способ предпочтительнее, так как в
спирте, который в данном случае является также и фиксатором,
семена могут сохраняться неограниченно долго, не изменяя своей
консистенции. Подготовленные таким оброазом семена разрезают
лезвием бритвы или скальпелем посередине вдоль комиссурального
шва. Половинки разрезанного семени помещают на агаровую
пластинку и слегка вдавливают в нее так, чтобы плоскость среза
была повернута кверху.
Агаровую пластинку готовят следующим образом: 1 г агар-
агара заливают 100 мл дистиллированной воды, смесь нагревают на
водяной бане до полного растворения агар-агара. Чтобы
предотвратить развитие плесневых грибов и колоний бактерий, в
качестве антисептика в горячий раствор добавляют несколько
кристалликов тимола (на кончике скальпеля). Слегка остывший, но
не затвердевший раствор разливают в чашки Петри слоем 0,5 см.
Остывая, раствор превращается в гель.
Использование агаровой пластинки для фиксирования положения
семени облегчает процедуру извлечения зародыша из семени и,
кроме того, позволяет длительное время сохранять препарированные
семена в свежем виде, что особенно важно, когда объект надо
фотографировать.
Зародыши извлекают из семени с помощью препарировальной
иглы и стеклянного манипулятора, изготовленного из стеклянной
трубки на пламени газовой горелки. Зародыш помещают на
поверхность агара рядом с семенем. Изучение проводят с помощью
микроскопа МБС-1, измерения - с помощью окуляр-микрометра.
5.3. Рентгенография семян для определения величины
эндосперма. Этот метод в отличие от первых двух имеет то
преимущество, что он не требует фиксации и вскрытия семян. Это
особенно важно, когда необходимо сохранить живыми семена редких
образцов. Приемы рентгенографической съемки семян моркови
разработаны на основе методики для древесных растений, описанной
в книге Н.Г.Смирновой [1].
Съемку семян моркови производят аппаратом АРС-1, снабженным
мягколучевой трубкой типа БТВ-25. Для сйемки используют
рентгеновские пластинки типа РМ-1, обычно применяемые в
медицинской практике. Силу тока и экспозицию необходимо
подбирать в зависимости от конкретных условий съемки (от 3 до 10
ма и от 5 до 20 мин). Хорошие результаты получаются при силе
тока в 3 ма и экспозиции 20 мин и при силе тока 8 ма с
экспозицией 5 мин. Чтобы во время съемки семена не сдвигались,
удобно наклеивать их на липкую полимерную ленту (для этой цели
удобна лента "Для детского технического творчества"). Перед
съемкой семена можно замачивать, в этом случае на рентгенограмме
четче выявляются контуры эндосперма. С негативов получают
позитивные отпечатки.
При дешифровке рентгенограмм выделяется четыре класса
семян: 1) семена с выполненным эндоспермом; 2) семена с
невыполненным эндоспермом; 3) пустые семена; 4) щуплые семена.
Рентгенографический метод изучения семян моркови позволяет
с достаточной достоверностью судить о степени развития
эндосперма и покровов семени. Существенным недостатком метода
является то, что на рентгенограммах семян моркови не виден
зародыш.
5.4. Рекомендуемая литература
1. Смирнова Н.Г. Рентгенографическое изучение семян лиственных древесных растений.
М., 1978.
6. ГИСТОХИМИЯ КЛЕТОЧНОЙ ОБОЛОЧКИ
В состав клеточной оболочки входит несколько групп
соединений, которые различаются по своему отношению к химическим
реагентам, используемым для извлечения этих соединений из
оболочек. При обработке промытых клеточных
оболочек липофильными жидкостями выделяется фракция так
называемых адкрустирующих веществ - растворимых соединений,
входящих в состав кутинизированных клеток эпидермиса (кутин,
суберин, каллоза, слизистые вещества). Путем обработки горячей
водой и попеременной экстракцией разведенными щелочами и
разведенными кислотами из оболочек извлекаются пектиновые
вещества и гемицеллюлозы, образующие основное вещество (матрикс)
клеточных оболочек. После их извлечения остается фракция,
называемая сырым волокном. Она состоит из волокнистых скелетных
веществ (целлюлоза) и инкрустирующих веществ типа лигнина.
В связи с наличием в клеточной оболочке большого количества
различающихся между собой полисахаридов, возникают определенные
трудности при изучении ее гистохимии. Для выявления локализации
всех вместе взятых нерастворимых полисахаридов, содержащихся в
клеточной оболочке, существует всего один метод. Очень мало
методов, дающих возможность обнаружить отдельные полисахариды с
их специфическими особенностями.
Определить весь набор полисахаридов, присутствующих в
клетке, позволяет реакция ШИК (Шифф-йодная кислота).
Реакция ШИК отвечает всем требованиям гистохимии: она не
вызывает распада полисахаридов, который мог бы привести к
диффузии продуктов реакции, кроме того, она специфична, при
выявлении локализации углеводов не приводит к ошибкам. Наконец,
окраска, возникающая в процессе этой реакции, отличается
одновременно большой интенсивностью и устойчивостью.
При исследовании характера распределения в оболочке
различных полисахаридов применяется метод дифференциального
извлечения компонентов клеточной оболочки с последующим
дифференциальным окрашиванием. Процедуру дифференциального
извлечения компонентов клеточных оболочек можно проводить прямо
на микротомных препаратах. При этом необходимо наклеивание
срезов на предметные стекла с помощью желатинового клея и
целлоидина. Но даже соблюдая все меры предосторожности при
данном методе обработки можно легко потерять срезы. Поэтому мы
предлагаем проводить дифференциальное экстрагирование веществ
клеточной оболочки из целых фиксированных объектов или их частей
(пыльников, завязей и т.п.) до заливки их парафином.
6.1. Порядок дифференциального извлечения полисахаридов из
клеточной оболочки [1] . Объекты, отмытые от фиксирующей
жидкости, помещают в бюкс или пробирку с 0,5%-ным раствором
щавелевокислого аммония для экстрагирования пектиновых веществ,
выдерживают в термостате или на водяной бане при температуре 90
градусов 12 ч (можно в два приема по 6 ч).
Промывают в дистиллированной воде.
Для извлечения гемицеллюлоз объекты помещают в 4%-ный
раствор едкого натра. Выдерживают при температуре 20-25 градусов
12 ч.
Раствор щелочи отсасывают пипеткой или осторожно сливают и
вводят раствор едкого натра повышенной концентрации - 17,5%-ный.
Этим раствором производится экстрагирование полисахаридов
нецеллюлозной природы. Выдерживают при температуре 20-25
градусов 12 ч.
После проведенных процедур в клеточных оболочках остается
единственное вещество - целлюлоза.
Далее обрабатывают материал спиртами в последовательности:
а) 96-градусный; б) 70-градусный; в) 50-градусный.
Затем осуществляется общепринятая обработка материала для
заливки его в парафин и проведения реакции ШИК.
Если заключить в парафин и разрезать необработанные объекты
(контроль), а также объекты после удаления пектиновых веществ,
после удаления гемицеллюлозы и после экстрагирования
полисахаридов нецеллюлозной природы, получится четыре группы
препаратов. После обработки их реактивом Шиффа и йодной кислотой
сравнение интенсивности окраски клеточных оболочек дает
представление об относительном количестве содержащихся в них
компонентов и об их локализации.
При исследовании описанным способом клеточных оболочек
одревесневших тканей могут встретиться некоторые трудности. Они
связаны с тем, что лигнин реагирует с реактивом Шиффа
непосредственно, без окисления йодной кислотой и может
маскировать другие компоненты клеточных оболочек.
6.2. Окрашивание реактивом Шиффа и йодной кислотой (ШИК)
[1]. Срезы толщиной 10-20 мкм освобождают от парафина и
обрабатывают серией спиртов различной концентрации. Затем
препараты последовательно помещают в следующие растворы: 1 н.
соляная кислота - 2 мин; 50%-ная соляная кислота - 20 мин;
дистиллированная вода - 10-15 мин; реактив Шиффа - 0,5-1 ч.
Затем промывают в проточной водопроводной воде в течение 10 мин.
Осуществляют ополаскивание в дистиллированной воде и помещают в
0,5%-ную йодную кислоту на 5-30 мин, после чего снова промывают
в проточной водопроводной воде 5-10 мин. Повторяют окрашивание в
реактиве Шиффа в течение 10-15 мин, ополаскивают в
дистиллированной воде и помещают в 2%-ный раствор бисульфита
натрия или калия на 2 мин. После очередного промывания в
проточной водопроводной воде в течение 5-10 мин срезы
обезвоживают и заключают в бальзам.
Полисахариды окрасятся в интенсивный пурпурно-красный цвет.
Цитоплазма остается бесцветной, а ядра приобретают лилово-
красный цвет.
Кроме реакции ШИК, выявляющей полисахариды клеточных
оболочек, существует ряд других методов для выявления химических
компонентов клеточной оболочки растений.
6.3. Методы выявления веществ клеточной оболочки.
6.3.1. Реакция с хлор-цинк-йодом для выявления целлюлозы
[4]. При проведении этой реакции нельзя пользоваться тканями,
фиксированными в растворах, содержащих хром, например,
фиксатором Навашина.
На освобожденные от парафина срезы поместить несколько
капель хлор-цинк-йода. Клеточные оболочки, содержащие большое
количество целлюлозы окрасятся в синий цвет. Оболочки,
содержащие кроме целлюлозы много лигнина, кутина или суберина,
приобретают желто-оранжевые тона. Следовательно, целлюлоза может
быть окрашена только после удаления этих веществ. Нужно
учитывать, что некоторые гемицеллюлозы тоже могут приобретать
синюю окраску, то есть реакция не является специфичной именно
для клетчатки.
Приготовление реактива. 1) по Хенелю: хлористого цинка - 30
г, йодистого калия - 5 г, йода - 1 г, воды - 14 мл. 2) по
Дженсену: хлористого цинка - 50 г, йодистого калия - 16 г, воды
- 17 мл. Добавить избыток йода и выдерживать несколько дней.
6.3.2. Реакция с йодом в растворе йодистого калия и серной
кислотой для выявления целлюлозы. Срезы, освобожденные от
парафина, помещают в раствор йодистого калия на 15 мин и более.
Покрывают срезы покровным стеклом и вводят под него с краю каплю
65%-ной серной кислоты. Дают ей возможность проникнуть под
стекло и смешаться путем диффузии с раствором.
Оболочки, содержащие целлюлозу, окрашиваются в темно-синий
цвет. Лигнин приобретает окраску оранжево-желтых тонов. Под
действием серной кислоты оболочки набухают, в результате чего
целлюлоза выявляется даже в одревесневших оболочках. В срединной
пластинке, где целлюлоза и лигнин очень тесно связаны друг с
другом, может появиться зеленое окрашивание.
Приготовление реактива: в 100 мл воды растворяют 2 г KI,
после чего в этом растворе растворяют 0,2 г йода [1].
6.3.3. Реакция Крайчиновича для окрашивания пектиновых
веществ [6]. Освобожденные от парафина срезы помещают в 1%-ную
соляную кислоту на 2 мин. Затем промывают в трех порциях
абсолютного спирта - по две мин в каждой. Выдерживают в растворе
%,1 М бензидина в спирте 45 мин. Снова промывают в абсолютном
спирте, сменяя четыре порции - в каждой по 2 мин. Затем
диазотируют в смеси 0,1 н. соляной кислоты и 0,1 н.
азотистокислого натрия (NaNO2) (3:1) в течение 1 мин. Промывают
последовательно в воде и спирте и проводят реакцию сочетания с
бета-нафтолом в спирте (0,1 М раствор). Затем следует очередное
промывание в воде и заключение в глицерин.
Препараты при необходимости можно после последнего
промывания в спирте обработать бутиловым спиртом и ксилолом и
заключить в бальзам.
В результате пектиновые вещества окрашиваются в красный
цвет.
Приготовление реактивов: 0,1 М раствор бензидина в спирте
получают, растворяя 1,84 г вещества в 100 мл раствора; 0,1 М
раствор бута-нафтола в спирте содержит 1,44 г вещества в 100 мл
раствора. Для приготовления 0.1 н. HCl нужно взять 8,3 мл
концентрированной соляной кислоты и долить до 100 мл
дистиллированной воды. 0,1 н. раствор NaNO2 в воде готовится из
расчета 0,69 г соли в 100 мл раствора.
6.3.4. Реакция с флороглюцином для выявления лигнина [4].
На освобожденные от парафина срезы наносят каплю 0,1-5%-ного
водного или спиртового флороглюцина. Спустя некоторое время туда
же вносят 1-2 капли дымящейся соляной кислоты или 25%-ной
серной. После появления окраски оттягивают реактив
фильтровальной бумагой, заменяют его каплей глицерина и
накрывают покровным стеклом.
При этом одревесневшая клетчатка окрашивается в малиново-
красный цвет.
6.3.5. Реакция Молиша для выявления лигнина [4]. На
освобожденные от парафина и обработанные спиртами срезы
действуют 15%-ным раствором альфа-нафтола в спирте с последующим
добавлением на срезы соляной кислоты (подобно флороглюцину).
Одревесневшая клетчатка приобретает голубовато-зеленое
окрашивание.
6.3.6. Реакция Хенеля на суберин [4]. При действии на
освобожденные от парафина срезы концентрированным раствором КОН
при комнатной температуре суберин окрашивается в желтый цвет.
При нагревании окраска усиливается.
6.3.7. Реакция с серной кислотой для выявления кутина [4].
При действии на срезы концентрированной серной кислотой
целлюлоза растворяется. Кутикула и кутикулярные слои при этом не
растворяются и окрашиваются в коричневый цвет.
6.4. Окрашивание клеточных оболочек алциановым синим.
Алциановый синий относится к красителям с широким диапазоном
действия. Он окрашивает кислые мукополисахариды, каллозу,
клеточные оболочки, оболочку пыльцевых зерен и некоторые другие
клеточные компоненты.
Химизм окрашивания алциановым синим полностью не раскрыт.
Считают, что процесс взаимодействия связан с карбоксильными
группами - СООН [2,3].
При исследовании окрашивания алциановым синим оболочек
растительных клеток установлено, что окрашивающее действие
красителя блокируется при воздействии пектиназой и
метилированием, но восстанавливается при деметилировании. На
основании этого предполагают, что окраска клеточных стенок
основывается на связи красителя со свободными группами
галактуроновой кислоты, входящей в состав пектиновых веществ
[5]. Кроме того, свободные кислотные группы имеются и в другом
компоненте матрикса клеточных оболочек - гемицеллюлозах, в
состав которых входят уроновые кислоты (галактуроновая и
глюкуроновая) и которые также могут вступать во взаимодействие с
алциановым синим.
Алциановый синий может быть рекомендован для исследования
оболочек растительных клеток как самостоятельный краситель, а
также в качестве подкрашивающего реагента. Хорошие результаты
дает окрашивание препаратов гематоксилином Эрлиха или
Гейденгайна с последующей подкраской алциановым синим.
Окрашивают парафиновые и замороженные срезы после фиксации
их жидкостями Карнуа, Ньюкомера или формалиновых фиксаторов.
Срезы, отмытые после окраски гематоксилином, помещают в
0,1%-ный раствор алцианового синего в 3%-ном растворе уксусной
кислоты на 1-2 мин.
Можно производить окраску только алциановым синим. В этом
случае срезы освобождают от парафина, обрабатывают спиртом и
водой и помещают в краситель на 1-2 мин. Затем промывают в
дистиллированной воде и дифференцируют в 1%-ном растворе спирта,
промывают в водопроводной воде, обезвоживают в спиртах и после
обработки ксилолом заключают в бальзам. В результате клеточные
оболочки окрашиваются в ярко-голубой цвет.
6.5. Рекомендуемая литература
1. Дженсен У. Ботаническая гистохимия. М., 1961.
2. Кононский А.И. Гистохимия. Киев, 1976.
3. Пирс Э. Гистохимия. М., 1962.
4. Прозина М.Н. Ботаническая микротехника. М., 1960.
5. Benes K. On the stainbility of plant cell wall with Alcian Blue. – Biologia Plantarum (Praha).
1968, v.10, N 5, p. 334-346.
6. Krajčinovič M. Der qualitative Nachweis des Pectins in der Pflansencelle mit Hilfe der
minreaction. – Acta Histochemika, 1954-1955, N 1, S. 76-81.
7. ФИКСАЦИЯ И ЗАЛИВКА ПЫЛЬНИКОВ РАСТЕНИЙ ДЛЯ