Журнал - Проблемы криобиологии 2010 №3

Подождите немного. Документ загружается.

243

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

достигались при длительной эквилибрации с крио-

протектором. Результаты настоящего исследова-

ния не подтверждают криозащитное действие аль-

гината, показанное в работе [15].

Следует отметить, что гидрогель в АМС не

утрачивал прозрачность, оцененную визуально пос-

ле медленного замораживания (режимы 2 и 3), в

отличие от быстрого замораживания (режим 1).

Это свидетельствует о сохранении структурной це-

лостности альгинатного геля при медленном замо-

раживании в описанных условиях, что является

важным критерием для разработки адекватного

протокола криоконсервирования клеток в составе

альгинатных микросфер.

Выводы

1. Криоконсервирование МСК, инкапсулирован-

ных в альгинатные микросферы, с использованием

быстрого охлаждения сопровождается изменением

оптических свойств гидрогеля и приводит к гибели

клеток.

2. Использование медленного замораживания

при криоконсервировании МСК, инкапсулированных

в альгинатные микросферы, под защитой 5 и

10%-го ДМСО позволяет в значительной степени

сохранить жизнеспособность клеток. При этом по-

казатели сохранности и метаболической активнос-

ти клеток зависят от концентрации ДМСО в криоза-

щитной среде. При повышении концентрации

ДМСО с 5 до 10% сохранность инкапсулированных

клеток после криоконсервирования возрастает по-

чти на 20%, а показатели AB-теста – на 70%.

3. Сравнительное изучение МСК в составе аль-

гинатных микросфер и в виде суспензии одиночных

неинкапсулированных клеток при криоконсервиро-

вании под защитой 10% ДМСО не выявило су-

щественных различий в их криочувствительности,

а в присутствии 5% ДМСО МСК в составе альги-

натных микросфер имели более низкие показатели

жизнеспособности.

4. Контроль критического переохлаждения вну-

триклеточного содержимого путем инициации

кристаллизации в ходе медленного программного

замораживания при криоконсервировании МСК в

составе альгинатных микросфер в присутствии

10% ДМСО позволяет добиться максимальных

значений сохранности и метаболической актив-

ности инкапсулированных клеток.

Литература

Петренко А.Ю., Мазур С.П., Петренко Ю.А. и др. Выделе-

ние и дифференцировка стромальных клеток из тканей

плодов и взрослого человека // Трансплантология.–

2007.– Т. 9, №1.– С. 218–220.

This suggestion is confirmed by the data of Almqvist

et al. [3] showed the higher cell viability after freeze-

thawing in the presence of 5% DMSO achieved after

prolonged equilibration with cryoprotectant. The re-

sults of this research do not confirm cryoprotective

effect of alginate, shown by Kusano et al. [15].

It should be noted that the AMB hydrogel did not

lose the transparency visually assessed after slow

freezing (regimens 2 and 3 ) in contrast to the rapid

freezing (regimen 1). This testifies to preservation of

structural integrity of alginate hydrogel during slow

freezing in described conditions, and this is an impor-

tant criterion for development of adequate cryopreser-

vation protocol for cells encapsulated in alginate miro-

beads.

Conclusions

1. Cryopreservation of MSC, encapsulated in algi-

nate microbeads, using rapid cooling is accompanied

by changes in hydrogel optical properties and results

in cell death.

2. Application of slow freezing in the presence of

5 and 10% DMSO during cryopreservation of MSC,

encapsulated in alginate microbeads, enables to pre-

serve significantly the cell viability. Herewith the indi-

ces of viability and cell metabolic activity depend on

DMSO concentration in cryoprotective medium. When

increasing DMSO concentration from 5 up to 10%

the viability of encapsulated cells after freeze-thawing

rises by approximately 20%, and AB test indices do

by 70%.

3. Comparative study of MSC encapsulated in

alginate microbeads and in non-encapsulated suspen-

sion during freeze-thawing in the presence of 10%

DMSO did not reveal significant differences in their

cryosensitivity, and in the presence of 5% DMSO the

post-thaw viability of MSC encapsulated in alginate

microbeads was lower.

4. The elimination of critical overcooling of intra-

cellular content by initiation of crystallization during

slow controlled rate freezing during cryopreservation

of MSC within alginate microbeads in the presence

of 10% DMSO enables to obtain the maximal values

of viability and metabolic activity of encapsulated cells.

References

Petrenko A.Yu., Mazur S.P., Petrenko Yu.A. et al. Isolation

and differentiation of stromal cells from fetal and adult human

tissues // Transplantologiya.– 2007.– Vol. 9, N1.– P. 218–220.

Abdallah B.M., Kassem M. Human mesenchymal stem cells:

from basic biology to clinical applications // Gene Ther.– 2008.–

Vol. 15, N2.– P. 109–116.

Almqvist K.F., Wang L., Broddelez C. et al. Biological freezing

of human articular chondrocytes // Osteoarthritis Cartilage.–

2001.– Vol. 9, N4.– P. 341–350.

244

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

Abdallah B.M., Kassem M. Human mesenchymal stem cells:

from basic biology to clinical applications // Gene Ther.– 2008.–

Vol. 15, N2.– P. 109–116.

Almqvist K.F., Wang L., Broddelez C. et al. Biological freezing

of human articular chondrocytes // Osteoarthritis Cartilage.–

2001.– Vol. 9, N4.– P. 341–350.

Alsberg E., Anderson K.W., Albeiruti A. et al. Cell-interactive

alginate hydrogels for bone tissue engineering // J. Dent.

Res.– 2001.– Vol. 80, N11.– P. 2025–2029.

Aoki T., Koizumi T., Kobayashi Y. et al. A novel method of

cryopreservation of rat and human hepatocytes by using

encapsulation technique and possible use for cell trans-

plantation // Cell Transplant.– 2005.– Vol. 14, N9.– P. 609–

620.

Dankberg F., Persidsky M.D. A test of granulocyte integrity

and phagocytic function // Cryobiology.– 1976.– Vol. 13, N4.–

P. 430–432.

Dezawa M., Kanno H., Hoshino M. et al. Specific induction of

neuronal cells from bone marrow stromal cells and application

for autologous transplantation // J. Clin. Invest.– 2004.–

Vol. 113, N12.– P. 1701–1710.

Duggal S., Frønsdal K.B., Szöke K. et al. Phenotype and

gene expression of human mesenchymal stem cells in alginate

scaffolds // Tissue Eng. A.– 2009.– Vol. 15, N7.– P. 1763–1773

Frith J.E., Thomson B., Genever P. Dynamic three-dimen-

sional culture methods enhance mesenchymal stem cell pro-

perties and increase therapeutic potential // Tissue Eng. C.–

2010.– Vol. 16, N4.– P. 735–749.

Gao L., McBeath R., Chen C.S. Stem cell shape regulates a

chondrogenic versus myogenic fate through Rac1 and N-

cadherin // Stem Cells.– 2010.– Vol. 28, N3.– P. 564–572.

Ghidoni I., Chlapanidas T., Bucco M. et al. Alginate cell

encapsulation: new advances in reproduction and cartilage

regenerative medicine // Cytotechnology.– 2008.– Vol. 58,

N1.– P. 49–56.

Goh B.C., Thirumala S., Kilroy G. et al. Cryopreservation

characteristics of adipose-derived stem cells: maintenance

of differentiation potential and viability // J. Tissue Eng. Regen.

Med.– 2007.– Vol. 1, N4.– P. 322–324.

Heng B.C., Yu H., Ng S.C. Strategies for the cryopreservation

of microencapsulated cells // Biotechnol. Bioeng.– 2004.–

Vol. 85, N2.– P. 202–213.

Jiang Q., Zhang S.Z., Peng J.P., Wang X.L. Preparation and

in vitro studies of microencapsulated cells releasing human

tissue inhibitor of metalloproteinase-2 // J. Zhejiang Univ. Sci.

B.– 2005.– Vol. 6, N9.– P. 859–864.

Kusano T., Aoki T., Yasuda D. et al. Microencapsule technique

protects hepatocytes from cryoinjury // Hepatol. Res.– 2008.–

Vol. 38, N6.– P. 593–600.

Lee D.A., Reisler T., Bader D.L. Expansion of chondrocytes

for tissue engineering in alginate beads enhances chondro-

cytic phenotype compared to conventional monolayer techni-

ques // Acta Orthop. Scand.– 2003.– Vol. 74, N1.– P. 6–15.

Lim F., Sun A.M. Microencapsulated islets as bioartificial

endocrine pancreas // Science.– 1980.– Vol. 210, N4472.–

P. 908–910.

Liu G., Shu C., Cui L. et al. Tissue-engineered bone formation

with cryopreserved human bone marrow mesenchymal stem

cells // Cryobiology.– 2008.– Vol. 56, N3.– P. 209–215

Luk J.M.,Wang P.P., Lee C.K. et al. Hepatic potential of bone

marrow stromal cells: development of in vitro co-culture and

intra-portal transplantation models // J. Immunol. Methods.–

2005.– Vol. 305, N1.– P. 39–47.

Majore I., Moretti P., Hass R., Kasper C. Identification of sub-

populations in mesenchymal stem cell-like cultures from human

umbilical cord // Cell Commun. Signal.– 2009.–- Vol. 7.– 6.

Malinin T.I., Perry Vol.P. Toxicity of dimethyl sulfoxide on

HeLa cells // Cryobiology.– 1967.– Vol. 4, N2.– P. 90–96.

McBeath R., Pirone D.M., Nelson C.M. et al. Cell shape,

cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage

commitment // Dev. Cell.– 2004.– Vol. 6, N4.– P. 483–495.

Murua A., Orive G., Hernandez R.M., Pedraz J.L. Cryopre-

servation based on freezing protocols for the long-term

Alsberg E., Anderson K.W., Albeiruti A. et al. Cell-interactive

alginate hydrogels for bone tissue engineering // J. Dent.

Res.– 2001.– Vol. 80, N11.– P. 2025–2029.

Aoki T., Koizumi T., Kobayashi Y. et al. A novel method of

cryopreservation of rat and human hepatocytes by using

encapsulation technique and possible use for cell trans-

plantation // Cell Transplant.– 2005.– Vol. 14, N9.– P. 609–

620.

Dankberg F., Persidsky M.D. A test of granulocyte integrity

and phagocytic function // Cryobiology.– 1976.– Vol. 13, N4.–

P. 430–432.

Dezawa M., Kanno H., Hoshino M. et al. Specific induction of

neuronal cells from bone marrow stromal cells and application

for autologous transplantation // J. Clin. Invest.– 2004.–

Vol. 113, N12.– P. 1701–1710.

Duggal S., Frønsdal K.B., Szöke K. et al. Phenotype and

gene expression of human mesenchymal stem cells in alginate

scaffolds // Tissue Eng. A.– 2009.– Vol. 15, N7.– P. 1763–

1773

Frith J.E., Thomson B., Genever P. Dynamic three-dimen-

sional culture methods enhance mesenchymal stem cell pro-

perties and increase therapeutic potential // Tissue Eng. C.–

2010.– Vol. 16, N4.– P. 735–749.

Gao L., McBeath R., Chen C.S. Stem cell shape regulates a

chondrogenic versus myogenic fate through Rac1 and N-

cadherin // Stem Cells.– 2010.– Vol. 28, N3.– P. 564–572.

Ghidoni I., Chlapanidas T., Bucco M. et al. Alginate cell

encapsulation: new advances in reproduction and cartilage

regenerative medicine // Cytotechnology.– 2008.– Vol. 58,

N1.– P. 49–56.

Goh B.C., Thirumala S., Kilroy G. et al. Cryopreservation

characteristics of adipose-derived stem cells: maintenance

of differentiation potential and viability // J. Tissue Eng. Regen.

Med.– 2007.– Vol. 1, N4.– P. 322–324.

Heng B.C., Yu H., Ng S.C. Strategies for the cryopreservation

of microencapsulated cells // Biotechnol. Bioeng.– 2004.–

Vol. 85, N2.– P. 202–213.

Jiang Q., Zhang S.Z., Peng J.P., Wang X.L. Preparation and

in vitro studies of microencapsulated cells releasing human

tissue inhibitor of metalloproteinase-2 // J. Zhejiang Univ. Sci.

B.– 2005.– Vol. 6, N9.– P. 859–864.

Kusano T., Aoki T., Yasuda D. et al. Microencapsule technique

protects hepatocytes from cryoinjury // Hepatol. Res.– 2008.–

Vol. 38, N6.– P. 593–600.

Lee D.A., Reisler T., Bader D.L. Expansion of chondrocytes

for tissue engineering in alginate beads enhances chondro-

cytic phenotype compared to conventional monolayer techni-

ques // Acta Orthop. Scand.– 2003.– Vol. 74, N1.– P. 6–15.

Lim F., Sun A.M. Microencapsulated islets as bioartificial

endocrine pancreas // Science.– 1980.– Vol. 210, N4472.–

P. 908–910.

Liu G., Shu C., Cui L. et al. Tissue-engineered bone formation

with cryopreserved human bone marrow mesenchymal stem

cells // Cryobiology.– 2008.– Vol. 56, N3.– P. 209–215

Luk J.M.,Wang P.P., Lee C.K. et al. Hepatic potential of bone

marrow stromal cells: development of in vitro co-culture and

intra-portal transplantation models // J. Immunol. Methods.–

2005.– Vol. 305, N1.– P. 39–47.

Majore I., Moretti P., Hass R., Kasper C. Identification of sub-

populations in mesenchymal stem cell-like cultures from human

umbilical cord // Cell Commun. Signal.– 2009.–- Vol. 7.– 6.

Malinin T.I., Perry Vol.P. Toxicity of dimethyl sulfoxide on

HeLa cells // Cryobiology.– 1967.– Vol. 4, N2.– P. 90–96.

McBeath R., Pirone D.M., Nelson C.M. et al. Cell shape,

cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage

commitment // Dev. Cell.– 2004.– Vol. 6, N4.– P. 483–495.

Murua A., Orive G., Hernandez R.M., Pedraz J.L. Cryopre-

servation based on freezing protocols for the long-term

storage of microencapsulated myoblasts // Biomaterials.–

2009.– Vol. 30, N20.– P. 3495–3501.

Nolan J.S., Packer L. Monolayer culture techniques for normal

human diploid fibroblasts // Methods Enzymol.– 1974.– Vol. 32,

Part B.– P. 561–568.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

245

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

storage of microencapsulated myoblasts // Biomaterials.–

2009.– Vol. 30, N20.– P. 3495–3501.

Nolan J.S., Packer L. Monolayer culture techniques for normal

human diploid fibroblasts // Methods Enzymol.– 1974.– Vol. 32,

Part B.– P. 561–568.

Petrenko Y.A., Gorokhova N.A., Tkachova E.N., Petrenko A.Y.

The reduction of Alamar Blue by peripheral blood lymphocytes

and isolated mitochondria // Укр. біохім. журнал.– 2005.–

Т. 77, №5.– C. 100–105.

Stensvaag V., Furmanek T., Lonning K. et al. Cryopreservation

of alginate-encapsulated recombinant cells for antiangiogenic

therapy // Cell Transplant.– 2004.– Vol. 13, N1.– P. 35–44.

Tomford W.W., Fredericks G.R., Mankin H.J. Studies on

cryopreservation of articular cartilage chondrocytes // J.

Bone Joint Surg. Am.– 1984.– Vol. 66, N2.– P. 253–259.

Tomkoria S., Masuda K., Mao J. Nanomechanical properties

of alginate-recovered chondrocyte matrices for cartilage

regeneration // Proc. Inst. Mech. Eng. H.– 2007.– Vol. 221,

N5.– P. 467–473.

Tuan R.S., Boland G., Tuli R. Adult mesenchymal stem cells

and cell-based tissue engineering // Arthritis Res. Ther.–

2003.– Vol. 5, N1.– P. 32–45.

Wu Y.N., Yang Z., Hui J.H. et al. Cartilaginous ECM component-

modification of the micro-bead culture system for chondro-

genic differentiation of mesenchymal stem cells // Biomate-

rials.– 2007.– Vol. 28, N28.– P. 4056–4067.

Xiang Y., Zheng Q., Jia B.B. et al. Ex vivo expansion and

pluripotential differentiation of cryopreserved human bone

marrow mesenchymal stem cells // J. Zhejiang Univ. Sci. B.–

2007.– Vol. 8, N2.– P. 136–146.

Поступила 16.03.2010

Рецензент Т.Ф. Петренко

Petrenko Y.A., Gorokhova N.A., Tkachova E.N., Petrenko A.Y.

The reduction of Alamar Blue by peripheral blood lymphocytes

and isolated mitochondria // Ukr. Biokhim. Zhurnal.– 2005.–

Vol. 77, N5.– P. 100–105.

Stensvaag V., Furmanek T., Lonning K. et al. Cryopreservation

of alginate-encapsulated recombinant cells for antiangiogenic

therapy // Cell Transplant.– 2004.– Vol. 13, N1.– P. 35–44.

Tomford W.W., Fredericks G.R., Mankin H.J. Studies on

cryopreservation of articular cartilage chondrocytes // J.

Bone Joint Surg. Am.– 1984.– Vol. 66, N2.– P. 253–259.

Tomkoria S., Masuda K., Mao J. Nanomechanical properties

of alginate-recovered chondrocyte matrices for cartilage

regeneration // Proc. Inst. Mech. Eng. H.– 2007.– Vol. 221,

N5.– P. 467–473.

Tuan R.S., Boland G., Tuli R. Adult mesenchymal stem cells

and cell-based tissue engineering // Arthritis Res. Ther.–

2003.– Vol. 5, N1.– P. 32–45.

Wu Y.N., Yang Z., Hui J.H. et al. Cartilaginous ECM component-

modification of the micro-bead culture system for chondro-

genic differentiation of mesenchymal stem cells // Biomate-

rials.– 2007.– Vol. 28, N28.– P. 4056–4067.

Xiang Y., Zheng Q., Jia B.B. et al. Ex vivo expansion and

pluripotential differentiation of cryopreserved human bone

marrow mesenchymal stem cells // J. Zhejiang Univ. Sci. B.–

2007.– Vol. 8, N2.– P. 136–146.

Accepted in 16.03.2010

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

246

Institute of Cattle Breeding of Ukrainian Academy

of Agrarian Sciences, Kharkov

Институт животноводства УААН, г. Харьков

УДК 635.076: 57.043

Л.В. ГОРБУНОВ

Повышение воспроизводимости результатов исследования

криоконсервирования биообъекта

UDC 635.076: 57.043

L.V. GORBUNOV

Increase in Reproducibility of Research Results

of Bioobject Cryopreservation

С помощью предложенной математической модели определены условия повышения воспроизводимости результатов

криобиологического исследования. Показано, что повышение воспроизводимости результатов исследования обеспечивается

при учете начального состояния биологического материала и эффективности его использования. Применение данной

математической модели повышает воспроизводимость результатов исследования до 5 раз, что дает возможность получить

достоверный результат при уменьшении количества биологического материала до 25 раз. Апробация предложенной модели

показала, что учет начального состояния спермиев быка и карпа, эмбрионов мыши повышает воспроизводимость результа-

тов в среднем в 1,5 раза, что дает возможность сравнивать результаты, полученные в разных опытах.

Ключевые слова: воспроизводимость, математическая модель, криоконсервирование, эффективность, спермии быка и

карпа, эмбрионы мыши.

На основі запропонованої математичної моделі визначено умови підвищення відтворюваності результатів кріобіологічного

дослідження. Показано, що підвищення відтворюваності результатів дослідження забезпечується при врахуванні початкового

стану біологічного матеріалу і ефективності його використовування. Застосування даної математичної моделі підвищує

відтворюваність результатів дослідження до 5 разів, що надає можливість одержати достовірний результат при зменшенні

кількості біологічного матеріалу до 25 разів. Апробація запропонованої моделі показала, що врахування початкового стану

сперміїв бугая і коропа, ембріонів миші підвищує відтворюваність результатів в середньому в 1,5 рази, що надає можливість

порівнювати результати, одержані в різних дослідах.

Ключові слова: відтворюваність, математична модель, кріоконсервування, ефективність, спермії бугая і коропа, ембріони

миші.

Conditions of reproducibility increase for cryobiological research results were examined with the proposed mathematical model.

It has been shown that increase of reproducibility of research results is provided with taking into account the initial state of biological

material and the efficiency of its using. Application of this mathematical model increases the reproducibility of research results up to

5 times that provides the obtaining significant result when reducing the biological material number to 25 times. Testing of the suggested

model showed, that taking into account of initial state of bovine and carp spermatozoa and murine embryos increased reproducibility

of results in average in 1.5 times, allowing the comparison of the results of various experiments.

Key words: reproducibility, mathematical model, cryopreservation, efficiency, bovine and carp spermatozoa, murine embryos.

Необходимое условие научного исследования –

воспроизводимость его результатов. Анализ опыта

работы Института высоких статистических техно-

логий и эконометрики МГТУ им. Н.Э. Баумана

показал, что причиной низкой эффективности

проведения эксперимента является применение

устаревших и частично ошибочных статистичес-

ких технологий [9]. Экономический эффект от

использования статистического контроля в про-

мышленности США составляет 0,8% от валового

национального продукта (20 млрд долларов в год),

что существенно больше, чем от любого иного эко-

номико-математического метода.

При использовании несовершенных статисти-

ческих технологий в криобиологических исследо-

ваниях невозможны учет начального состояния

The requirement to scientific research is reproduc-

ibility of its results. Analysis of the experience of the

Institute of High Technologies and Econometrics of

N.E. Bauman Moscow State Technical University

(MSTU) showed that the reason of low efficiency of

performed experiment was the usage of outdated and

partially incorrect statistical technologies [9]. Economi-

cal effect of using statistical control in the USA indus-

try makes 0.8% of gross national product (20 billion

dollars annually) that is significantly higher than any

other economical-mathematical method.

When using imperfect statistical technologies in

cryobiological researches a scientist could not take into

account an initial state of bioobject and efficiency de-

termination of its cryopreservation stages, and that is

the reason of low reproducibility of experimental re-

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

* Адрес для корреспонденции: п/в Кулиничи, Харьковский

район, Харьковская область, Украина, 62404; тел.: (+38 057)

740-31-66, электронная почта: lab_cryo@ukr.net

* Address for correspondence: PO Kulinichi, Kharkov region,

Ukraine 61480; tel.: +380 57 740 3166; e-mail: lab_cryo@ukr.net

247

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

биообъекта и определение эффективности этапов

его криоконсервирования, что является причиной

низкой воспроизводимости результатов опытов [3–

6]. Сохранность нативных спермиев и эмбрионов

в разных опытах может изменяться в пределах

нескольких десятков процентов [4–6]. Это ограни-

чивает возможность применения методов много-

факторного исследования при работе со спермия-

ми и эмбрионами.

Общепринятые параметрические (t) и непара-

метрические (

) критерии анализа полученных

результатов основаны на усреднении показателей

сохранности биообъекта, оцененного до и после

эксперимента [1, 7]. Недостатком данных методов

является большое количество проб (эякулятов или

эмбрионов n ≥ 30) в каждой выборке, что связано

с ранговым распределением значений сохранности

биообъекта (оценка в баллах). Следствиями усред-

нения рангового распределения показателей со-

хранности биообъекта являются большой расход

биологического материала для получения досто-

верного результата и сложность сравнения резуль-

татов отдельных опытов.

Таким образом, низкая воспроизводимость ре-

зультатов отдельных опытов затрудняет сопоста-

вимость данных всего эксперимента. С помощью

общепринятых способов парного сравнения резуль-

татов сохранности биообъекта (в опыте и контро-

ле) невозможно определить эффективность проце-

дуры его криоконсервирования и отдельных её

этапов (культивирование, применение криопротек-

тора и режима замораживания-оттаивания). Для

сопоставления результатов, полученных в разных

опытах, при малом количестве проб (n ≤ 30) необхо-

димо создать математическую модель, обеспечи-

вающую учет индивидуальных особенностей био-

объекта и оценку эффективности выбранного спо-

соба его криоконсервирования.

Цель работы – разработать математическую

модель, повышающую воспроизводимость резуль-

татов криобиологического исследования, и опреде-

лить условия, обеспечивающие уменьшение коли-

чества используемого биообъекта.

Материалы и методы

Сохранность биообъекта, оцененную на i-м

этапе криоконсервирования, определяли из выра-

жения:

(1)

где n

– количество пригодного к дальнейшему

использованию биообъекта, оцененного на i-м

этапе криоконсервирования; n

– общее количест-

во биообъекта.

sults [3–6]. Integrity of native spermatozoa and em-

bryos in different experiments could vary within the

range of several tens of percent [4–6]. It limits the

possibility of multifactor research methods’ applica-

tion when working with spermatozoa and embryos.

Conventional parametric (t) and non-parametric (

)

criteria of analysis of the obtained results are based on

averaging the integrity indices for the bioobject, esti-

mated prior to and after the experiment [1, 7]. A huge

number of the samples (either ejaculates or embryos

n ≥ 30) in each sampling, associated with the rank dis-

tribution of the bioobject integrity values (estimation in

points) is disadvantage of these methods. A high ex-

penditure of biological material for obtaining a sig-

nificant result and difficulty of its comparison in differ-

ent experiments are the results of rank distribution av-

eraging of the bioobject integrity indices.

Thus, low reproducibility of the results of different

experiments makes difficult a comparability of the

whole experiment data. It is impossible to determine

the efficiency of cryopreservation and its single stages

(culturing, exposure in cryoprotectant and utilized

freeze-thawing protocol) for the results of bioobject

integrity (in the experiment and control) using conven-

tional paired comparison methods. It is necessary to

develop a mathematical model, providing considera-

tion of the individual peculiarities of bioobject and esti-

mation of efficiency of chosen cryopreservation method

to compare the results, obtained in different experi-

ments with a little number of the samples (n ≤ 30).

The research aim was to develop the mathematical

model, increasing the reproducibility of the results of

cryobiological research and to establish the conditions,

providing the reduction of the used bioobject's amount.

Materials and methods

Integrity of bioobject, evaluated at i-th cryopreserva-

tion stage was determined by the formula:

(1)

where n

is amount of bioobject, suitable for further

use, evaluated at i-th stage of cryopreservation; n

total amount of bioobject.

Integrity of bioobject is the value of general prob-

ability, which may be presented as the product of con-

ditional probabilities of consequently related events

according to the Bayes' formula [1,7]:

∏

ici

WSS

, (2)

where S

is initial integrity of bioobject, i. e. ratio of number

of suitable native bioobject to total number n

); W

is efficiency of i-th stage of cryopreservation:

248

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

Сохранность биообъекта является величиной

общей вероятности, которая может быть пред-

ставлена как произведение условных вероятностей

последовательно связанных событий в соответст-

вии с формулой Байеса [1, 7]:

∏

ici

WSS

, (2)

где S

– начальная сохранность биообъекта, т. е.

отношение количества пригодного нативного

биообъекта n

к общему числу n

= n

); W

–

эффективность i-го этапа процедуры криокон-

сервирования: культивирования W

, применения

криопротектора W

, замораживания-оттаивания W

полного цикла криоконсервирования W

Сохранность биообъекта определяли на сле-

дующих этапах: культивирование (S

= S

);

обработка криопротектором и культивирование

= S

); замораживание-оттаивание и

культивирование (S

= S

; W

= S

). Сле-

довательно, из выражения (2) можно определить

эффективность i-го этапа криоконсервирования

через отношение показателей сохранности био-

объекта на заданном и предшествующем этапах:

1−

. (3)

Оценивали показатель эффективности на эта-

пах: культивирования W

= S

; применения крио-

протектора W

= S

; замораживания-оттаивания

= S

; полного цикла криоконсервирования W

= W

Среднеквадратическое отклонение рассчиты-

вали по методу альтернативного варьирования

[1, 7]:

)1(( PP

−=

, (4)

где P – вероятность сохранности (1) или эффектив-

ность криоконсервирования биообъекта (3).

Воспроизводимость результатов эксперимента

оценивали при помощи коэффициента вариации:

%100⋅=

. (5)

Повышение воспроизводимости результатов

эксперимента определяли как отношение величин

коэффициентов вариации, полученных для показа-

теля сохранности и эффективности криоконсерви-

рования биообъекта:

z =

. (6)

of culturing, W

of cryoprotectant use, W

of freeze-

thawing, W

of complete cycle of cryopreservation.

Integrity of bioobject was determined at the fol-

lowing stages: culturing (S

= S

); treatment with

cryoprotectant and culturing (S

= S

); freeze-

thawing and culturing (S

= S

; W

= S

Therefore the efficiency of i-th stage of cryopreserva-

tion could be determined from the formula (2) through

relation of the indices of bioobject integrity at given

and previous stages:

1−

. (3)

Index of efficiency was estimated for the following

stages: W

= S

for culturing; W

= S

for cryopro-

tectant application; W

= S

for freeze-thawing; W

= W

for complete cycle of cryopreservation.

Root-mean-square deviations were evaluated by

the method of alternative variation [1,7]:

)1(( PP

−=

, (4)

where P is probability of integrity (1) or efficiency of

bioobject cryopreservation (3).

Reproducibility of experimental results was esti-

mated with variation coefficient:

%100⋅=

. (5)

Increase of experimental results’ reproducibility was

determined as the ratio of values of variation coeffi-

cients, obtained for integrity and efficiency of bioobject

cryopreservation:

z =

. (6)

Minimal amount of bioobject, providing significant

mean value of the indices of integrity and efficiency of

cryopreservation, was determined according to [2, 3]:













, (7)

where t is Student's criterion (at n > 30 t = 2); p is

admissible relative error (p = 5%)

Decrease in bioobject's amount was estimated as

the ratio of minimum number of bioobjects, providing

the significance of its integrity estimation, to cryopre-

servation efficiency (h = n

). During substitution by

(7) and reduction of the values of admissible relative

error p and Student's t criterion with further replace-

ment for (6) we obtain:

zh =

. (8)

249

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

Минимальное количество биообъекта, обеспе-

чивающего достоверное среднее значение пока-

зателей сохранности и эффективности криокон-

сервирования, определяли по [2, 3]:













, (7),

где t – критерий Стьюдента (при n > 30 t = 2); р –

допустимая относительная ошибка (р = 5%).

Уменьшение количества биообъекта оценивали

как отношение минимального числа биообъекта,

обеспечивающего достоверное значение оценки

его сохранности, к эффективности криоконсерви-

рования (h = n

). При подстановке (7) и со-

кращении значений допустимой относительной

ошибки р и критерия Стьюдента t с последующей

заменой на (6) получаем:

zh =

. (8)

Предложенную математическую модель про-

веряли на основе полученных результатов криокон-

сервирования спермиев быка, карпа и эмбрионов

мыши [3–6]. В каждом отдельном опыте изменяли

только один технологический параметр в соответ-

ствии с [1, 7]. Защитную среду для криоконсерви-

рования спермы карпа готовили по методике

Л.И. Цветковой [11], а быка – по методике

Ф.И. Осташко [10]. Все манипуляции с эмбрио-

нами мыши – выделение и подготовка к экспери-

ментам проводили по общепринятым методикам

[8]. В качестве криопротектора применяли раствор

1 М глицерина. Эмбрионы инкубировали в данном

растворе при 20 ± 2°С в течение 10 мин. После

замораживания-отогрева криопротектор отмывали

с помощью раствора 0,5 М сахарозы. Заморажи-

вание спермиев и эмбрионов осуществлялось в

разработанных нами устройствах, основанных на

пассивном охлаждении термоблока в горловине

сосудов Дьюара X-34 (V = 35 л) и X-5 (V = 5 л) [3].

Экспериментально полученные значения сред-

неквадратического отклонения эффективности i-го

этапа криоконсервирования биообъекта рассчиты-

вали по [1, 7]:

)(

−

∑

jii

, (9)

где W

– эффективность криоконсервирования j-го

эмбриона (или спермодозы для спермиев), вычис-

ленная как отношение показателей сохранности

j-го биообъекта на i-м S

и предшествующем S

i–1

этапах криоконсервирования; n – общее количество

эмбрионов (спермодоз).

The suggested mathematical model was examined

on the base of the obtained results of bovine, carp sper-

matozoa and murine embryos’ cryopreservation [3–

6]. In each particular experiment just one technologic

parameter was changed according to [1, 7]. Protec-

tive medium for cryopreservation of carp sperm was

prepared according to L.I. Tsvetkova [11], for bovine

sperm the method of F.I. Ostashko [10] was used. All

manipulations with murine embryos such as obtaining

and preparing to the experiments were carried-out ac-

cording to the standard methods [8]. As cryoprotectant

1M glycerol solution was used. Embryos were incu-

bated in cryoprotectant solution at 20 ± 2°C during

10 min. Cryoprotectant was washed-out after freeze-

thawing using the 0.5 M sucrose solution. The sper-

matozoa and embryos were frozen-thawed in devel-

oped by us devices, which are based on passive cool-

ing of thermoblock in the neck of Dewar vessels X-34

(35 l) and X-5 (5 l).

The experimentally obtained values of root-mean-

square deviation of efficiency of bioobject i-th cryo-

preservation stage were evaluated [1,7]:

)(

−

∑

jii

, (9)

where W

is efficiency of j-th embryo cryopreservation

(or dose for spermatozoa) calculated as the ratio of

j-th bioobject's integrity assessed at the i-th cryopreser-

vation stage S

and the previous stage S

j–1

; n is total

number of embryos (sperm doses).

Integrity S

was determined as the ratio of n

, the

number of admissible j-th bioobject at i-th stage to n

the initial number of j-th bioobject.

For reduction of root-mean-square deviation value

(9) the current values of integrity W

of j-th bioobject,

assessed at the i-th stage of cryopreservation, W

, were

averaged. This operation eliminates systemic errors of

experiments by transition from indirect measurements

to direct ones [1, 7].

Results and discussion

The mathematical model, based on the Bayes' for-

mula (2) and (3), was developed for determination of

the conditions of increase for cryobiological research

results’ reproducibility. For testing of the suggested

mathematical model the expressions (4–8) were used.

Efficiency indices were calculated by substitution of

virtual values of integrity of the bioobject, assessed at

different stages of cryopreservation: 80% after obtain-

ing, 70% after culturing, 60% after cryoprotectant ap-

plication and culturing, 50% after freeze-thawing and

culturing (Table 1). Variation coefficients made 50, 65,

82 and 100%, correspondingly. Obtained efficiency in-

dices for culturing made 88%, equilibration in cryopro-

ыпатЭ

яинаворивреснокоирк

аткеъбооиб

tcejbooiB

segatsnoitavreserpoyrc

%,ьтсоннархоС

%,ytirgetnI

%,ьтсонвиткеффЭ

ffEi %,ycneic

еинечулоП

gniniatbO

0805004 -----

еинаворивитьлуK

gnirutluC

0756686888392237,100,3

яицарбиливкЭ

noitarbiliuqE

06287601681476200,200,4

еинавижаромаЗ

gnizeerF

050010061

385402342,200,5

еинаворивреснокоирK

noitavreserpoyrC

367706992,176,1

250

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

Сохранность S

определяли как отношение ко-

личества пригодного j-го биообъекта на i-м этапе

к начальному количеству j-го биообъекта n

Для уменьшения величины среднеквадратичес-

кого отклонения (9) усредняли текущие значения

относительной сохранности j-го биообъекта,

оцененного на i-м этапе криоконсервирования W

Данная операция устраняет систематические

ошибки опытов посредством перехода от косвен-

ных измерений к прямым [1, 7].

Результаты и обсуждение

Для определения условий повышения воспроиз-

водимости результатов криобиологического иссле-

дования создана математическая модель, основой

которой являются формулы Байеса (2) и (3). Для

апробации предложенной математической модели

применяли выражения (4–8). Показатели эффек-

тивности рассчитывали посредством подстановки

виртуальных значений сохранности биообъекта,

оцененного на разных этапах криоконсервирования:

после получения – 80%, культивирования – 70%,

применения криопротектора и культивирования –

60%, процедур замораживания-оттаивания и куль-

тивирования – 50% (табл. 1). Коэффициенты вариа-

ции составили 50, 65, 82 и 100% соответственно.

Получены показатели эффективности для этапов:

культивирования – 88%, эквилибрации в криопро-

текторе – 86 %, замораживания-оттаивания – 83%,

полного цикла криоконсервирования – 63%. При

этом коэффициенты вариации снижаются до 38, 41,

Таблица 1. Уменьшение количества используемого биообъекта посредством

повышения воспроизводимости результатов криобиологического эксперимента

Table 1. Reduction of used bioobject’s amount by reproducibility increase

of cryobiological experimental results

45 и 77% соответственно.

Применение относи-

тельных показателей (3)

для оценки эффектив-

ности составляющих эта-

пов криоконсервирования

повышает воспроизводи-

мость результатов экспе-

римента в 1,3–2,2 раза,

что дает возможность по-

лучения достоверных

данных при уменьшении

количества используе-

мого биообъекта в 1,7–5

раз (табл. 1).

Для определения усло-

вий повышения воспроиз-

водимости результатов

криоконсервирования

биообъекта в зависимос-

ти от его начального сос-

тояния и эффективности

выбранного этапа(ов)

криоконсервирования

необходимо рассчитать

Примечание: S, W – средние значения; C

, C

– коэффициенты вариации; n

, n

– минимальное

количество биообъекта, обеспечивающее уровень надежности среднего значения Р = 0,95;

z – кратность повышения воспроизводимости результатов (6); h – коэффициент сокращения

количества биообъекта (8).

Note: S, W are mean values; C

, C

are coefficients of variation; n

, n

are minimum numbers of

bioobject, providing reliability level of mean value P = 0.95; z – increase multiplicity for repro-

ducibility of results (6); h – coefficient of bioobject’s amount reduction (8).

tectant did 86%, freeze-thawing did 83% and com-

plete cycle of cryopreservation did 63%. Herewith the

variation coefficients decrease down to 38, 41, 45 and

77%, correspondingly.

Use of relative indices (3) for evaluation of cryopre-

servation stages’ efficiency increases the reproduc-

ibility of experimental results in 1.3–2.2 times, enabling

to obtain significant data during reduction of the used

bioobject's amount in 1.7–5 times (Table 1).

To determine the conditions of bioobject cryopre-

servation results’ reproducibility increase in depend-

ence on its initial state and efficiency of the selected

stage(s) of cryopreservation it is necessary to calcu-

late the complete cycle of cryopreservation (1–8). The

obtained results show that considering the efficiency

of bioobject cryopreservation stage(s) increases the

reproducibility of the study results in 1.1–4.9 times in

the case if bioobject integrity decreases from 90 down

to 30% (Table 2). It enables the obtaining of signifi-

cant result even after reducing the amount number of

bioobject in 1.2–24 times [2]. Increasing the reproduc-

ibility of the results has been found when analyzing the

final stage of technological chain after decreasing of

biological object integrity (Tables 1 and 2).

For testing the suggested model the comparative

analysis of the calculated by (2) and (3) values and

empirically obtained from (1) data of cryopreservation

of various biological material (bovine and carp sper-

matozoa and murine embryos) was carried out (Table 3).

Analysis of experimentally obtained data showed that

efficiency of two-step cooling of carp spermatozoa

ьтсонвиткеффЭ

)во(апатэ

,яинаворивреснокоирк

ffEi foycneic

noitavreserpoyrc

(egats - %,)s

.де.лсу,итсомидовзиорпсовеинешывоП

stinuyrartibra,ytilibicudorperniesaercnI

%,аткеъбооибьтсоннархосяаньлачаН

%,stcejbooibfoytirgetnilaitinI

03040506070809001

0109,136,154,123,112,131,160,100,1

0289,107,105,153,142,151,170,100,1

0380,277,165,104,172,161,180,100,1

0412,278,136,154,113,191,190,100,1

0583,200,237,135,163,122,111,100,1

0616,281,278,136,144,172,131,100,1

0769,254,280,208,165,153,171,100,1

0865,329,254,280,277,105,152,100,1

0939,400,423,377,23,278,154,100,1

00100,100,100,100,100,100,100,100,1

251

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

личных типов биологического материала: спер-

миев быка, карпа, эмбрионов мыши (табл. 3).

Анализ экспериментально полученных данных

показал, что эффективность двухступенчатого ох-

лаждения спермиев карпа достигает 58, а быка –

70%, что обеспечивает сохранность 45 и 52%

соответственно [3, 4]. Показатели эффективности

применения криопротектора составляют 92–94%

и режимов замораживания-оттаивания – 77–89%.

Более высокое значение эффективности криокон-

сервирования получено для эмбрионов мыши –

93%, на этапах применения криопротектора – 87%,

режима замораживания – 100%, при которых уро-

вень сохранности составил 80% [5, 6].

Установлено влияние вариации начального

состояния спермиев карпа на разброс показателей

их сохранности, оцененных на этапе инкубации с

криопротектором (51–67%) и после деконсервиро-

вания (35–52%). В результате применения пока-

зателя эффективности криоконсервирования дан-

ный разброс уменьшился более чем в 2 раза отно-

сительно сохранности и составил 68–78 и 46–51%

соответственно для каждого этапа [4].

Показано, что разные способы криоконсервиро-

вания спермиев карпа и вариация их различного

начального состояния дают практически одинако-

Таблица 2. Повышение воспроизводимости результатов эксперимента в

зависимости от начальной сохранности биообъекта и эффективности

выбранного этапа(ов) криоконсервирования

Table 2. Increase of reproducibility of experimental results depending on initial

integrity of bioobject and efficiency of chosen cryopreservation stage(s)

Примечание: см. табл. 1.

Note: see Table 1.

полный цикл криоконсерви-

рования (1–8). Полученные

результаты показывают,

что учет эффективности

составляющих этапа(ов)

криоконсервирования био-

объекта при снижении его

сохранности от 90 до 30%

повышает воспроизводи-

мость результатов иссле-

дования в 1,1–4,9 раза

(табл. 2). Это дает возмож-

ность получить достовер-

ный результат при уменьше-

нии количества биообъекта

в 1,2–24 раза [2]. Повыше-

ние воспроизводимости ре-

зультатов установлено при

анализе завершающих эта-

пов технологической цепи

вследствие снижения со-

хранности биологического

объекта (табл. 1, 2).

Для проверки предло-

женной модели проведен

сравнительный анализ рас-

четных значений по (2) и

(3) и эмпирически полу-

ченных данных по (1) после

криоконсервирования раз-

achieved 58 and bovine done 70%, that provided in-

tegrity of 45 and 52%, correspondingly [3, 4]. Effi-

ciency of cryoprotectant application made 92–94% and

freeze-thawing regimens did 77–89%. Higher efficien-

cy value was obtained for murine embryos, 93%; for

the stages of cryoprotectant application it made 87%

and for freezing regimen it was 100%, where the in-

tegrity level was 80% [5, 6].

It has been established that the effect of variation

of carp spermatozoa initial state on the dispersion of

their integrity indices, assessed at the stage of incuba-

tion in cryoprotectant, was 51–67% and after freeze-

thawing it was 35–52%. After application of cryopre-

servation efficiency index this dispersion decreased

twice for integrity and made 68–78 and 46–51%, cor-

respondingly, for each stage [4].

It has been shown that different methods of carp

spermatozoa cryopreservation and variation of their

initial state provide almost the same dispersion of in-

tegrity indices, 35–53 and 35–52%, correspondingly.

When estimating the efficiency of cryopreservation the

dispersion of the values made 44–67% for different

methods of freezing spermatozoa, derived from one

ejaculate. When using different ejaculates and one

method of freezing the dispersion made 53–65% (ini-

tial motility of spermatozoa varied from 60 to 90%).

252

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №3

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №3

вый разброс показателей сохранности 35–53 и 35–

52% соответственно. При оценке эффективности

криоконсервирования разброс значений составляет

44–67% для разных способов замораживания спер-

миев, полученных из одного эякулята. При исполь-

зовании разных эякулятов и одного способа замо-

раживания разброс составил 53–65% (начальная

подвижность спермиев варьировала от 60 до 90%).

При почти одинаковой начальной подвижности

спермиев быка 70–80% и разных способах крио-

консервирования разброс показателей их сохран-

ности составил 13–52%, а эффективности – 20–70%.

Переход к показателям эффективности дает

возможность в 2 раза уменьшить влияние качества

(от удовлетворительного до отличного) эмбрионов

мыши на оценку этапов выбранного способа крио-

консервирования: инкубация с криопротектором –

77–95%, режим охлаждения-отогрева – 73–93%.

Состояние эмбрионов оценивали по морфологичес-

ким показателям и развитию в культуре in vitro [5,

6]. При вариации начального состояния эмбрионов

мыши (от удовлетворительного до отличного)

разброс сохранности деконсервированного объек-

та составил 31–80%, что в 1,4 раза больше (см.

табл. 2), чем расхождение сохранности – 52–86%,

обусловленное выбором способа криоконсервиро-

вания. При использовании показателей эффектив-

ности криоконсервирования биообъекта разброс

уменьшился в 1,6 раза относительно сохранности

и составил 64–83 и 63–93% соответственно.

Для исследования вариации показателей со-

хранности и эффективности проанализированы

величины их коэффициентов вариации (табл. 3). В

результате сопоставления коэффициентов вариации

ткеъбооиБ

tcejbooiB

МйелетазакопсорбзаР

nim

÷М

хam

%,}С,W,S{М,

МsecidnifonoisrepsiD

nim

÷М

хam

%,}С,W,S{М,

S С

W С

С=z

С/

иимрепС

апрак

mrepspraC

53 ÷ 35

53( ÷ )25

49 ÷ 731

69( ÷ )631

44 ÷ 76

35( ÷ )56

07 ÷ 311

37( ÷ )49

2,1 ÷ 3,1

3,1( ÷ )5,1

иимрепС

акыб

enivoB

mreps

31 ÷ 2569 ÷ 85202 ÷ 0766 ÷ 0023,1 ÷ 5,1

ыноирбмЭ

ишым

eniruM

soyrbme

25 ÷ 68

13( ÷ )08

04 ÷ 69

05( ÷ )941

36 ÷ 39

46( ÷ )38

03 ÷ 63

83( ÷ )64

3,1 ÷ 7,2

3,1( ÷ )2,3

Таблица 3. Воспроизводимость сохранности биообъекта (S) и

эффективности его криоконсервирования (W), обусловленная

выбором технологии (различным начальным состоянием)

Table 3. Reproducibility of integrity of S bioobject and W efficiency of

its cryopreservation, due to the technology selected

(various initial state)

Примечание: см. табл. 1.

Note: see Table 1.

(6) установлено увеличение в 1,2–3,8

раза воспроизводимости результатов

опытов при использовании показателей

эффективности (3) относительно сохран-

ности (1). Такое расхождение получен-

ных величин объясняется влиянием

разного начального состояния биообъек-

та, с одной стороны, и особенностями

последовательно применяемых мето-

дов криоконсервирования, с другой, на

состояние исследуемой системы крио-

консервирования.

Выявлена следующая закономер-

ность: чем больше разброс сохраннос-

ти, тем выше чувствительность показа-

теля эффективности к оценке состоя-

ния анализируемого способа криокон-

сервирования. Различное начальное

состояние эмбрионов дает более высо-

кие показатели коэффициентов вариа-

ции, оцененные по сохранности (50–

149%) и эффективности (38–46%), чем

выбор способа криоконсервирования

Use of quite similar initial motility of bovine spermato-

zoa 70–80% and different methods of cryopreser-vation

provides the range of their integrity indices of 13–52%,

and efficiency of 20–70%.

The transition to the efficiency indices enables the

double decrease of murine embryo quality influence

(from satisfactory to excellent) on the estimation of

chosen cryopreservation protocol stages: application

of cryoprotectant gave 77–95% and cooling-thawing

regimen does 73–93%. State of embryos was assessed

by morphological indices and in vitro development [5,

6]. When varying the initial state of murine embryos

(from satisfactory to excellent) the dispersion of fro-

zen-thawed object integrity made 31–80% which is in

1.4 times (see Table 2) higher than the integrity disper-

sion of 52–86% due to selection of cryopreservation

method. When using the indices of bioobject cryopre-

servation efficiency the dispersion decreased in 1.6

times as for integrity and made 64–83 and 63–93%,

correspondingly.

For study of integrity and efficiency indices’ varia-

tion the values of its variation coefficients were analy-

zed (Table 3). After the correlation of variation coeffi-

cients (6) the increase of experimental results’ repro-

ducibility in 1.2–3.8 times was established when using

the efficiency indices (3) relative to integrity (1). This

difference of the obtained values is explained by the

effect of different initial states of bioobject on the one

hand, and peculiarities of sequentially applied cryopre-

servation methods on the state of cryopreservation stud-

ied system, on another hand.

The following regularity was found: the higher is

integrity variation, the higher is the sensitivity of effi-

ciency index to the estimation of analyzed cryopreser-